Proteinler için Poliakrilamid Jeller Hızlı ve Hassas Kolloidal Coomassie G-250 Boyama

Bu videoda, poliakrilamid jellerde birkaç nanogram proteini saptamak için modifiye edilmiş bir Coomassie boyama protokolünün gücünü göstereceğiz. Birinci boyut ayrımı öncesinde iki boyutlu jel elektroforezi örneğini kullanarak, immobilize pH gradyan şeritleri denatüre edici tampon koşullarında yeniden hidrate edilir.

Şeritlerin gece boyunca yeniden şişirilmesinin ardından, protein örnekleri anodik kap yüklemesi yoluyla uygulanır. Odaklama işlemi sırasında proteinler, izoelektrik noktalarına göre ayrıştırılır. İkinci boyut ayrımı SDS-PAGE ile gerçekleştirilir.

Ardından jel bir boyama kabına aktarılır ve proteinler kolloidal kumasi ile boyanarak tespit edilir. Merhaba, Olor Üniversitesi biyomedikal araştırma merkezindeki Sabina Meka laboratuvarından Nadine de Bala ben. Bugün dikkatinizi, Kangan meslektaşlara göre yaygın olarak bilinmeyen bir prosedüre çekeceğim; Cy Brilliant Blue, elektroforetik ayırmaların ardından proteinlerin görselleştirilmesi için yaygın olarak kullanılan bir boyadır ancak karşılaştırmalı proteomik için genellikle daha az uygulanabilir olduğu varsayılır.

Buna karşın, kolloidal cos boyaması hassasiyet, maliyet ve pratiklik açısından üstün özellikler sunmaktadır. Laboratuvarımızda, hemen hemen tüm jel tabanlı uygulamalarda, özellikle de miyokardiyal protein ekspresyon değişikliklerini belirlemek için analitik proteomikte K boyama protokolünü kullanıyoruz. Bu yöntemin, iki boyutlu elektroforez jellerinin alkali pH aralığındaki miyokardiyal proteinleri saptamak için kullanımını göstereceğim.

Öyleyse başlayalım. Tamamdır. 2D jel elektroforezinin ilk boyutu izoelektrik odaklamadır veya IEF olarak bilinir ve bu analiz için immobilize pH gradyan şeritleri veya IPG şeritleri kullanılır.

IEF öncesinde, dört IPG şeridi IM Mobilly kuru şerit şişirme tepsisi kullanılarak 125 µL rehidratasyon çözeltisi içinde en az 10 saat boyunca tek tek rehidre edilir; böylece IPG şeritleri rehidre edilmiş ve protein örneği uygulamasına hazır hale gelir. Dört farklı kalp preparatından elde edilen TCA ile çöktürülmüş protein örnekleri, 100 µL başına 100 µg protein konsantrasyonuna ulaşacak şekilde IEF örnek tamponunda çözülür. Protein örneklerinin çözünürleştirilmesi, oda sıcaklığında bir vorteks üzerinde en az 30 dakika sürer.

Bu sırada, çoklu dörtlü elektroforez ünitesinde IEF gerçekleştirmek için IM Molene kuru şerit kitinin ek bileşenlerini hazırlayın. Öncelikle soğutma ünitesinin sıcaklığını 20 °C'ye ayarlayın, soğutma plakasının üzerine üç ila dört mililitre örtü sıvısı pipetleyin ve Immobilien kuru şerit tepsisini, kırmızı elektrot bağlantısı anoda bakacak şekilde üzerine yerleştirin. Immobilien kuru şerit tepsisine yaklaşık 10 mililitre örtü yağı dökün ve Immobilien kuru şerit hizalayıcısını, oluklu tarafı yukarı gelecek şekilde yağla kaplı tepsinin üzerine yerleştirin.

Ardından, rehidrate edilmiş şeridi yeniden şişirme tepsisinden çıkarın ve jel yüzeyi yukarı bakacak şekilde hizalayıcının kanallarına yerleştirin. Şeridin asidik ucu anoda doğru bakmalıdır. Sonuçta, tüm şeritlerinle anotik kenarları hizalanmış olmalıdır.

Damıtılmış su ile doyurulmuş elektrot şeritlerini, elektrot şeritlerinin jel yüzeyiyle en azından kısmen temas ettiğinden emin olarak jel şeritlerin uçlarına yanlamasına yerleştirin. Son olarak, renkli işaret ilgili elektronik kontağa bakacak şekilde elektrotları elektrot şeritlerinin üzerine konumlandırın. Örnek kabı çubuğunu immobilien kuru şerit tepsisindeki anoda yakın bir konuma getirin ve her bir IPG şeridinin üzerine bir örnek kabı yerleştirin.

IPG şeridi ile iyi temas sağlandığından emin olmak için numune kaplarını nazikçe aşağı bastırın. IPG şeritlerini kaplayacak şekilde tepsiye 70 ila 80 mililitre örtü yağı dökün. Numune kaplarının içine yağ sızmamalıdır.

Yağ kaplara sızarsa, bir pipet yardımıyla uzaklaştırın ve kapları yeniden ayarlayın. Son olarak, örnek kaplarını tamamen kaplayacak şekilde yaklaşık 150 mililitre örtü yağı ekleyin. Şimdi, protein örneklerini örtü sıvısının yüzeyinin altına pipetleyerek örnek kaplarına uygulayın.

Kabın hacmi 100 µL'dir. Tüm protein numuneleri yüklendikten sonra tüm iletkenleri bağlayın. Multi four ünitesini güç kaynağına bağlayın ve gradyan modunda 11.1 kVh boyunca izoelektrik odaklama gerçekleştirin; IEF sonrası IPG şeritleri, jel tarafı yukarı gelecek şekilde bir tepsiye yerleştirilir ve dengeleme sırasında redüksiyon ile alkilasyona tabi tutulur.

İndirgeme için, şerit başına 2,5 milliliters %1'lik DTT dengeleme çözeltisi kullanın. Ardından 15 dakika boyunca çalkalayın ve sonrasında DTT çözeltisini tamamen yenileyerek şeritleri %2,5'lik iodoasetamid dengeleme çözeltisi içinde 15 dakika daha çalkalayarak alkilleştirin. Dengeleme aşamasındaki şeritleri su dolu bir beherde bir kez durulayın ve fazla dengeleme tamponunu uzaklaştırmak için filtre kağıdı üzerine tamponlayın.

Ardından, şeritleri bir XSDS çalıştırma tamponuna aktarın. Şeritlerdeki proteinler artık 2D jel elektroforezinin ikinci boyutu için hazırdır. İkinci boyut, dikey bir elektroforez sisteminde SDS-PAGE ile gerçekleştirilir.

Kullanımdan bir gün önce, uygun sayıda bir milimetre kalınlığında %12 akrilamid jel dökülür ve ıslak kağıtla örtülmüş olarak saklanır. Oda sıcaklığında, dengelenmiş IPG şeritleri ayırma jellerinin üzerine yerleştirilir ve sıcak agar çözeltisi ile sabitlenir; ardından proteinler, ilk 15 dakika 80 volt ve ardından boya önü jel kasetinin altına ulaşana kadar 120 volt uygulanarak 2,5 saat boyunca ayrıştırılır.

Proteinler SDS-PAGE ile ayrıştırılırken, jelin kolloidal Coomassie boyaması için gerekli çözeltileri hazırlayın. Boyama çözeltisi hazırlanırken, bileşenlerin aşağıdaki sırayla eklenmesine dikkat etmek çok önemlidir. İlk olarak, bir beher içerisinde 100 gram alüminyum sülfatı ve yaklaşık 1,5 litre milli-Q suyunu çözün ve karıştırın. Alüminyum sülfat çözündükten sonra, 200 mililitre etanol ekleyip karıştırın ve çözeltiye 0,4 gram CBB G-250 ekleyin.

CBB G two 50 tamamen çözündüğü anda, 47 mililitre ortofosforik asit ekleyin. Bu adım, kamasi moleküllerinin kolloidal durumlarında kümelenmesini sağlar. Son olarak, toplam hacim iki litre olacak şekilde milli Q su ekleyin.

Son bekletme çözeltisinde yüzen partiküller olacaktır. Bu çözeltiyi filtrelemeyin. Boyama çözeltisi önceden hazırlanabilir ve kullanıma kadar karanlıkta saklanabilir.

SDS jeli tamamlandığında, jeli cam plakalardan dikkatlice çıkarın ve Milli Q su ile dolu bir boyama kabına aktarın. Jelin bulunduğu kabı yatay bir çalkalayıcıya yerleştirin ve 10 dakika boyunca çalkalayın.

Yıkama işlemini yaklaşık beş ila 10 dakika boyunca iki kez daha tekrarlayın. Taze milli cube suyu ile jelin iyice yıkanması önemlidir; çünkü jelde kalan SDS, boyanın proteine bağlanmasını bozarak hassasiyetin azalmasına neden olabilir. Üçüncü yıkamanın sonunda, kaptaki suyu dökün.

Jel artık boyanmaya hazırdır. Öncelikle, kolloidal partikülleri eşit şekilde dağıtmak için Kumasi çözeltisini çalkalayın. Ardından, jeli kaplayacak kadar çözelti ekleyin.

Kumasi çözeltisi içeren kabın üzerini kapatın. Jeli bir çalkalayıcıya yerleştirin ve 2 ila 12 saat boyunca çalkalayın. 10 dakika sonra, ilk protein lekelerinin belirdiğini göreceksiniz.

Boyamanın %80 ila %100'ü iki saatlik inkübasyon ile gerçekleştirilebilir. Ancak, %100'e yakın bir boyama elde etmek için gece boyu inkübasyon öneriyoruz. Boyama tamamlandığında, Kamasi çözeltisini uzaklaştırın ve jeli Milli Q su ile iki kez durulayın.

Jeli duruladıktan sonra, boyama kabındaki yapışmış boya partiküllerini tüy bırakmayan bir kağıt havlu ile temizleyin. Jele boya giderme çözeltisi ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde 10 ila 60 dakika boyunca bekletin. Son olarak, jeli Milli Q su ile iki kez durulayın.

Jel orijinal kalınlığına dönecek ve kumasi boyamasının renk yoğunluğu da artacaktır. Bu protokolü takip ederseniz, 2D jeliniz belirgin şekilde çözünmüş olmalı ve koyu mavi protein lekeleriyle iyi boyanmış görünmelidir. 2D jellerde gerçekleştirdiğimiz kumasi boyama sonucu, gümüş boyama sonucuyla kıyaslanabilir düzeydedir.

Yüksek hassasiyete ve kütle spektrometresi ile uyumluluğa sahip olduğu bildirilen Chef Chenko ve ark. protokolüne göre. İki boyutlu jel elektroforezi örneğini kullanarak, kangs cooma boyamanın ne kadar hızlı, basit ve hassas olduğunu size göstermiş olduk. Po akrilamid jellerindeki proteinleri saptamak için boyama işlemi iki saat içinde tamamlanabilir.

Prosedürün kendisi çok az emek gerektirir. Ve son olarak, bir nanogram protein kadar düşük miktarları tespit etmeniz mümkün olabilir. Bu nedenle, bu protokol jel tabanlı proteomiklerin etiketsiz yöntemlerine kesinlikle iyi bir alternatiftir.

Sürdürme prosedürünü uygularken, analitik saflıkta kimyasallar ve en yüksek saflıkta su kullanmanız gerektiğini unutmamak önemlidir. Ayrıca, bileşenlerin boyama çözeltisine sırayla eklenmesi, hazırlık sürecindeki kritik bir adımdır. Son olarak, elektroforetik ayrıştırmadan sonra jellerden kalıntı SDS'leri etkili bir şekilde yıkamayı unutmayın.

Aksi takdirde, jellerinizde hiçbir şey göremezsiniz. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dilerim.