Name: Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Öğrenin, QD-FRET ve mikroakışkanlar kullanarak DNA nano komplekslerinin gerçek zamanlı kendi kendine toplanmasını nasıl izleyeceğinizi. Bu yöntem, gen tedavisi uygulamaları için polielektrolit poliplekslerin sentezini iyileştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH hibe HL89764, NSF hibe 0.546.012, 0.730.503 ve 0.725.528 tarafından sağlanan fon desteği.

DNA A. biyotinilasyon Plazmid DNA kovalent olarak üretici (Mirus Bio, Madison, WI) tarafından açıklanan, ancak ~ DNA ortalama 1-2 biotin etiketler ölçekli guanin özel biotin etiketleri ile biotinlenmiş. Plazmid DNA (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) bu protokol etiketli oldu. <ol><li> 1μg/μL DNA çözümü DNaz-özgür ve RNaz-TE tamponu (moleküler biyoloji sınıf kaliteli) suya pDNA istenilen miktarda eritilir. </li><li> Aşağıdaki reaksiyon karışımları kullanarak etiketleme reaksiyon Davranış. BT reaktif son Etiket ekleyin. </li></ol> 100μg DNA reaksiyon için: <table border="1"><tbody><tr><td> DNaz ücretsiz ve RNaz ücretsiz su </td><td> 75 mcL </td></tr><tr><td> 10X Etiketleme Tampon A </td><td> 20 mcL </td></tr><tr><td> 1μg/μL DNA </td><td> 100 mcL </td></tr><tr><td> BT reaktif Etiket </td><td> 5 mcL </td></tr><tr><td> Toplam Hacim </td><td> 200 mcL </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 37 ° C&#39;de 1 saat süreyle reaksiyon inkübe edin. </li><li> Etanol veya isopropanol yağış standart protokoller etiketli numune arındırın. </li></ol> Not: Jel filtrasyon tabanlı sütun DNA sayısallaması veya floresan karakterizasyonu etkileyebilir yüksek UV absorbans veya floresan arka plan yol açabilir. Not: biyotinilasyon düzeyi haba tabanlı testler ile belirlenebilir. Cy5 Katyonik Polimer B. Etiketleme Chitosan (% 83.5 deacetylated 390 kDa Vanson, Redmond, WA) bu çalışmada bir model katyonik polimer olarak kullanılmıştır. Kitosan polimer omurgasına ücretsiz olarak birincil aminler Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ile etiketlenir. <ol><li> Cy5 boya komple konjugasyon kolaylaştırmak için, Cy5 NHS gerekli miktarı hesaplamak Cy5, molar oranda böyle: 200: birincil aminler 1. </li><li> NaOH ilavesi ile ~ 6.5 pH kitosan çözümü (25mm asetat tampon) ayarlayın. Not NHS reaksiyon bazik pH daha etkilidir, ancak burada chitosanın çözünürlük çalışma pH aralığı sınırları. </li><li> Karıştırarak iken, yavaş yavaş bir damla bırak şekilde kitosan çözüm Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) hesaplanan miktar ekleyin. </li><li> Gece karanlıkta, oda sıcaklığında karışımı çalkalayın. </li><li> Arındırmak için,% 1 asetat tamponu karşı karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat süreyle 10k MWCO Slayt-a-Lyzer (Pierce) ile dialyze. </li><li> 2 saat karanlıkta, oda sıcaklığında bir başka tampon ve dialyze değiştirin. </li><li> Tampon ve 4 gecede dialyze ° C karanlıkta değiştirin. </li><li> Mağaza saflaştırılmış etiketli -20 ° C&#39;de polimer </li></ol> Not: Bu çalışmada, standart bir eğri, 670 nm Cy5-NHS ester emisyon yoğunluğu ölçümü ile inşa edilmiştir . Standart eğri Cy5 etiketli kitosan 670 nm&#39;de elde edilen emisyon ölçüm etiketleme yoğunluğu karakterize eder. Absorbans etiketleme etkinliğini belirlemek için de kullanılır olabilir ama burada değildi. QD etiketli DNA ve Cy5-Polimer C. Hazırlık QD için pDNA molar oranı aşan tutulur (pDNA: QD ≈ 1: 2) pDNA için QDS tam konjugasyon sağlamak. TEM görüntüleme veya eşdeğer diğer tesisleri ile her pDNA üzerine etiketli QDS sayısı tahmin edilebilir. Bizim çalışmamızda, pDNA ortalama QDS sayısı olduğu tahmin edilmektedir ~ TEM ve tek bir molekül spektroskopisi tarafından 1-3. Hazırlanması sırasında 1 Kullanım Millipore Milli-Q degrade su (0.2um süzülmüş&gt; 18.0 MW). <ol><li> 10μg pDNA istenilen N / P oranına göre chitosanın gerekli miktarda DNA çözümü olumsuz fosfat kitosan çözüm Protonlaşmış aminlerin teorik oranını hesaplayın. </li><li> Biotinlenmiş pDNA çözüm streptavidin Fonksiyonlu 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) ekleyin. </li><li> 15 dakika süreyle karanlıkta, oda sıcaklığında çözüm inkübe edin. </li><li> QD-işaretli DNA son hacmi 200μL yapmak için 50 mM sodyum sülfat çözeltisi içine ekleyin. </li><li> Milli-Q su ile son hacim 200μL yapmak için, istenilen N / P oranı göre, Cy5-kitosan seyreltilir. </li></ol> Not: mümkün photobleaching önlemek için koyu reaksiyon tutun. Önemli: Bu katalogda Kuantum nokta FRET bir amaç için tasarlanmış Qdot 605 ITK ™ streptavidin konjuge (ITK serisi), kullanmak için dikkatli olun. Düzenli Qdot serisi özellikle hücresel etiketlenmesi için, non-spesifik bağlama önlemek için PEG tabakası ile konjuge. Ancak, bu ek kaplama r, donör-alıcı uzaklığı büyütür.enerji transfer verimliliği educed. Standart Fotolitografi SU-8 Master D. Fabrikasyon <ol><li> Si gofret piranha ° C &#39;de 5 dakika süreyle temizlenmelidir ve 200 pişmiş. </li><li> 25μm, belirlenen ana kalınlığı, spin kat 30 saniye boyunca 2000 rpm&#39;de Si levhası üzerindeki olumsuz fotorezist (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA). </li><li> Yumuşak fırında 65 bir rampa ile ocak gofret ° C / saat - 95 ° C </li><li> 250mJ/cm 2 için UV ışık (365nm), mikro tasarım içeren bir maske film (CAD / Sanat Hizmetleri, Bandon, OR) yoluyla maruz . </li><li> Maruziyet sonrası, 65 bir rampa ile bir ocak gofret fırında ° C / saat - 95 ° C </li><li> SU-8 fotorezist geliştirici kullanarak gofret geliştirin. </li><li> Desenli gofret sert bir rampa, 65 ocak üzerinde pişirilir ° C / saat ile 200 ° C Oda sıcaklığına kadar gofret, daha sonra yavaş yavaş serin, en az 5 saat süreyle 200 ° C&#39;de gofret koruyun. </li></ol> Önemli: süresince kademeli Ramping SU-8 ana pişirme işlemi gereklidir, aksi takdirde SU-8 yapısı silikon gofret veya çatlak kopuk SU-8 yapısı, stres sürümü ile indüklenen olabilir . Kapak Cam ustaları ve Bağlanma PDMS E. Replica Kalıp <ol><li> SU-8 ana tartı tekne yerleştirilir. </li><li> 10 karıştırın silikon elastomer ve kür ajanı (Poli (dimethylsiloxane), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI): 1 oranında. </li><li> SU-8 ana PDMS karışımın üzerine dökün ve kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum desikatörde tartım tekneden ayrılabilirsiniz. </li><li> 1-2 saat 65 ° C&#39;de PDMS Cure. </li><li> Si master kalıp PDMS şerit soyun. </li><li> Punch kanal girişleri ve çıkışları akışkan cihaz. </li><li> PDMS şerit ve etanol ile cam kapak ve hava kuru temizleyin. </li><li> Oksijen plazma ile temizlenmelidir PDMS şerit ve cam kapak (1dk için 20W) davranın. </li><li> Cam kapak ile hemen bağ PDMS şerit. </li><li> 95 ° C&#39;de gece boyunca fırında gümrüklü mikroakışkan çip bırakın. </li></ol> Önemli: Plazma tedavi ve gecede pişirme gelişmiş yapıştırma gücü için gerekli. F. Monitör mikroakışkan Aygıt DNA Nanocomplexes oluşumu <ol><li> Deney sırasında düzgün akışını sağlamak için reaktifler yüklemeden önce, mikroakışkan kanal (mikroakışkan kanal içinde herhangi bir baloncuklar olmadığından emin olmak için) su ile doldurun. </li><li> Video açıklanan boru yoluyla, iki ayrı cam şırınga QD etiketli DNA ve Cy5 etiketli kitosan çözümleri yükleyin. </li><li> Tüp mikroakışkan cihazlar iki girişleri ile bağlayın. Işlemi sırasında herhangi bir hava tanıtmak için dikkatli olun. Laminer akış koşulları altında, 20nL/min (PHD-2000 şırınga pompası, Holliston, MA) akış hızını ayarlayın. </li><li> Mikroskop altında mikro kontrol edin. </li><li> Akış stabil (~ 15 ila 20 dakika), QD-aracılı kanalın merkezi dikkat edilmelidir FRET. </li><li> Kanal boyunca farklı yerlerde floresan resimler (Soğutmalı CCD, Qimaging, BC, Kanada) ele alalım. </li><li> ImageJ ve OriginLab floresan görüntüleri analiz. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. QD-FRET DNA Nanocomplexes self-montaj başlangıç ​​hassas bir gösterge sağlar <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Kuantum nokta-aracılı floresan rezonans enerji transferi (QD FRET) net tespiti için DNA ve gen taşıyıcı arasındaki etkileşimleri başlangıç ​​sağlayan, ekstra ya da hücre içi ortamlarda ya polyplex istikrar nicel ve çok hassas bir göstergesi sağlayabilir. FRET çifti, 605QD ve Cy5, donör ve alıcı arasındaki spektral örtüşme maksimize etmek ve potansiyel çapraz konuşma minimize dayalı seçildi. Bu çifti için, Förster mesafe 69.4Å 3 </li><li> Self-assembly QD-FRET DNA nanocomplexes. Anyonik plazmid DNA (pDNA) ve katyonik gen taşıyıcı, sırasıyla QD (enerji donör) ve Cy5 (enerji alıcı) ile işaretlenmiştir. QD-FRET nanocomplexes elektrostatik karmaşık Koaservasyon yoluyla oluşmuştur. QD-FRET aracılı Cy5 emisyon 488 nm uyarma üzerine, kompakt ve sağlam nanocomplex oluşumu göstermiştir. Kalma süresi (t R) iki dere soruşturma altında reaksiyon konumu ve ortalama akış hızı (v) buluştuğu önlemler mesafe (x) göre hesaplanabilir. Karıştırma, laminer akış doğası nedeniyle sadece hassas hesaplama t R fonksiyonu olarak toplu taşıma izin arayüzü (her görüntünün merkezi) yer alır. Zamansal çözünürlük applie değiştirerek ayarlanabilird akış oranları. (Ankastre) FRET-aracılı sinyal uygulanan akış hızlarına göre birkaç milisaniye içinde meydana gelen bu bağlama hızlı olduğunu belirten, iki dere bir araya geldi arayüzü hemen gözlendi. Ölçek Bar: 100μm. </li></ol>

<ol><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li>
<li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

<ul><li> Yaptığımız işin önemi: <ol><li> Bu basit bir mikroakışkan çipi içinde QD-FRET yanıtları aracılığıyla gerçek zamanlı olarak polimerik DNA nanocomplex kendini montaj kinetiği (milisaniye çözünürlük) izlemek için ilk girişimi. </li><li> Mikroakiskan mekansal, DNA nanocomplex sentezi sırasında sürecini analiz etmek için iyi kontrollü mikroçevresinin sunuyor ise QD-aracılı FRET, moleküler etkileşimlerin başlangıcı ve self-montaj süreci boyunca son derece duyarlı ve kantitatif bir gösterge sağlar. </li><li> Mikroakiskan ve sahipliği yapacaktır entegrasyonu kompleks reaksiyonlar her türlü araştırmak için yeni ve ilginç bir yaklaşım göstermektedir. </li><li> Çıkan QD-FRET polimerik DNA nanocomplexes yapı-işlev ilişkileri kurmak için kolayca uygulanabilir. 1,2 </li></ol></li></ul>

<table><tbody><tr><td>SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid DNA</td><td>Clontech Laboratories</td><td>pEGFP-C1</td><td>4.9 kb, MW = 3.3 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Label&lt;/em&gt;IT Biotin Etiketleme Kiti</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR 3400</td><td>Standart protokol, çift zincirli DNA'nın her 20-60 bp'sine yaklaşık bir etiket düşecek şekilde etiketleme verimi sağlar; etiketleme yoğunluğu bu çalışmada ayarlanmıştır.</td></tr><tr><td>Streptavidin 605QD</td><td>Invitrogen</td><td>Qdot&amp;#174; 605 ITK&amp;#174; Streptavidin Konjugatı</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-NHS Ester</td><td>Amersham</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>Kitosan</td><td>Vanson</td><td>390 kDa</td><td>%83,5 deasetile</td></tr><tr><td>Lamel Camı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545C</td><td>No. 1; Boyut: 40 x 22mm</td></tr><tr><td>Gastight Cam Şırınga</td><td>Hamilton Co</td><td>TLL serisi</td><td>Numune hacmine bağlı olarak 50&amp;#x03BC;L ile 500&amp;#x03BC;L arası</td></tr><tr><td>Tygon Boru</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>0.02 ID, 100ft</td><td>Tygon Borular Microbore, 0.02 ID, 100ft</td></tr><tr><td>Konnektör</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-23R</td><td>0.750&quot; uzunluğunda özelleştirilmiş</td></tr><tr><td>Şırınga Pompası</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD-2000</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>QImaging</td><td>Intensified Retiga Soğutmalı</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX-51</td><td>100W cıva ark lambası</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>v1.36b</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>Origin Pro8</td><td>OriginLab</td><td>Öğrenci Versiyonu</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Filtre setleri</td><td>Omega Optical</td><td>475AF40</td><td>Her iki kanaldaki eksitasyon filtresi</td></tr><tr><td>Mikroskop Filtre setleri</td><td>Omega Optical</td><td>595AF60</td><td>605QD kanalındaki emisyon filtresi</td></tr><tr><td>Mikroskop Filtre setleri</td><td>Omega Optical</td><td>670DF40</td><td>QD-FRET kanalındaki emisyon filtresi</td></tr><tr><td>Mikroskop Filtre setleri</td><td>Omega Optical</td><td>500 DRLP</td><td>605QD kanalındaki uzun geçiren dikroik filtre</td></tr><tr><td>Mikroskop Filtre setleri</td><td>Omega Optical</td><td>595DRLP</td><td>QD-FRET kanalındaki uzun geçiren dikroik filtre</td></tr></tbody></table>

birleştiren qd fret mikroakiskan real-time dna nanocomplex self-meclis monitör

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Genomik gelişmeler, hücresel ve moleküler düzeyde patogenezi hedef terapötikler gelişme yakıt devam ediyor. Genelde hücre içinde fonksiyonel, nükleik asit temelli tedaviler etkili bir hücre içi dağıtım sistemi gerektirir. Bir yaygın olarak kabul edilen bir yaklaşım bozulması karşı koruyarak DNA hücresel alımını kolaylaştıran, elektrostatik kendini montaj yoluyla nanocomplexes oluşturmak için bir gen taşıyıcı ile karmaşık DNA. , Erken disosiasyon ya da çok istikrarlı bağlama hücresel alımı ve terapötik etkinliği için zararlı olabilir çünkü meydan okuma, etkin gen taşıyıcıların rasyonel tasarım yatıyor. Toplu karıştırma tarafından sentezlenen Nanocomplexes nanocomplexes büyüklüğü ve istikrar içinde heterojen atfedilen açma hücre içi ve ticareti davranış, çeşitli gösterdi. Böyle bir heterojenite, kendini montaj kinetiği doğru değerlendirme engelleyen ve onların fiziksel özellikleri transfeksiyon verimliliği veya bioactivities ilişkilendirerek zorluk ekler. Biz sahipliği yapacaktır (yani QD-FRET) ve Mikroakiskan laminer akış altında nanocomplex kendini montaj gerçek zamanlı kinetiği karakterize bir roman yakınsama sunuyoruz. Mikroakiskan yüksek temporal çözünürlük (~ milisaniye) ile mekansal sürecini analiz etmek için iyi kontrollü mikroçevresinin sunar ise, QD-FRET sentez süreci boyunca moleküler etkileşimler ve kantitatif ölçümü başlamasından son derece hassas bir göstergesi sağlar. Polimerik nanocomplexes modeli sistem için, iki ayrı self-montaj işlemi aşamalarında bu analitik platformu tarafından ele geçirildi. Microscale elde edilen öz-montaj işlemi kinetik yönü birçok mikro ve nano ölçekli uygulamalar için ilgili microreactor tabanlı reaksiyonlar için özellikle değerli olacaktır. Ayrıca, nanocomplexes microfludic cihazların uygun tasarımı sayesinde özelleştirilmiş olabilir, ve elde edilen polimerik DNA nanocomplexes yapı-işlev ilişkileri kurmak için kolayca uygulanabilir QD-FRET.

Biz gelecekteki nükleik asit temelli tedaviler için daha iyi kontrol ve sentez üniforma ve özelleştirilebilir polyplexes sağlaması bekleniyor polielektrolit polyplexes oluşumunu araştırmak için yeni ve güçlü bir entegrasyon sahipliği yapacaktır (QD-FRET) ve Mikroakiskan sunuyoruz.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Genomik alanındaki ilerlemeler, patogenezi hücresel ve moleküler düzeyde hedefleyebilen terapötiklerin geliştirilmesini desteklemeye devam etmektedir. Tipik olarak...

Bu prosedür, kuantum noktaları veya QD FRET çifti oluşturmak için DNA ve polimerin etiketlenmesiyle başlar; plazma DNA'sı kuantum noktalarıyla konjuge edilir. Enerji donörü olan organik polimer, enerji akseptörü olan bir organik florofor ile etiketlenir.QD fret karıştırıldığında, elektrostatik kendiliğinden düzenlenme yoluyla nano kompleksler oluşur ve ardından etkileşim gerçekleşirken QD aracılı fret sinyali takip edilebilir. Bu QD fret sistemi, bileşenlerin yalnızca karıştırma arayüzündeki difüzyon yoluyla etkileşime gireceği bir mikroakışkan kanala aktarılır. Böylece, DNA nano kompleks kendiliğinden düzenlenmesi, QD fret ve mikroakışkanların kombinasyonu ile izlenebilir.Merhaba, ben Johns Hopkins Üniversitesi Makine Mühendisliği Bölümü'ndeki Biyos ve tek molekül dinamiği laboratuvarından Megan Ho. Bugün sizlere, DNA nanoyapıların kendi kendine montajını gerçek zamanlı olarak izlemek için kuantum nokta ve mikroakışkanların birleştirilmesine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, gen tedavisi lokalizasyonu için DNA nanoyapı komplekslerini çalışmak amacıyla kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Plazma DNA'sını guanin spesifik biyotin etiketleri ile kovalent olarak biyotinlemek için MIRIs bio'dan bir biyotin etiketleme kiti kullanılır; ancak bu işlem, DNA başına yaklaşık bir ila iki biyotin etiketi olacak şekilde ölçeklendirilir. Başlamak için, 1 µg/µL DNA çözeltisi hazırlamak üzere istenilen miktardaki plazma DNA'sını TE tamponunda çözün.Plazma D-N-A-D-N-A içermeyen ve RNA içermeyen su, 10 x markalama tamponu A ve markalama reaktifini karıştırarak markalama reaksiyonunu hazırlayın. Markalama reaktifi en son eklenir. Reaksiyonu 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.Bir saatlik inkübasyonun ardından, etiketli örneği standart protokolleri izleyerek etanol çöktürme yöntemiyle saflaştırın. Etiketli DNA'yı kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.Bir sonraki adım, iyonik polimerin işaretlenmesidir. Bu gösterimde, model iyonik polimer olarak Kitosan kullanacağız ve kitosan polimer omurgasındaki serbest primer aminleri sci-fi NHS ile işaretleyeceğiz; öncelikle, sci-fi ile primer aminlerin molar oranının 1'e 200 olacağı şekilde gerekli sci-fi NHS miktarını hesaplayın. Bu, sci-fi boyasının tamamen konjugasyonunu kolaylaştıracaktır.Yavaşça karıştırırken, 25 millimolar asetat tamponu içindeki kitosan çözeltisinin pH değerini yaklaşık 6.5'e ayarlamak için sodyum hidroksit ekleyin; ardından hesaplanan miktardaki sci-fi NHS'yi kitosan çözeltisine damla damla ilave edin. Karışımı karanlıkta tutmak için şişeyi alüminyum folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında gece boyunca çalkalayın. Ertesi gün, karışımı Pierce marka 10 K-M-W-C-O membran kullanılarak %1 asetat tamponu karşısında, karanlıkta, oda sıcaklığında iki saat boyunca diyaliz ederek saflaştırın.İki saat sonra, %1 asetat tamponunu değiştirin ve iki saat daha diyalize edin. Oda sıcaklığında ve karanlıkta tamponu tekrar değiştirin ve karanlıkta, dört santigrat derecede gece boyunca diyalize edin. Ertesi gün, saflaştırılmış işaretli polimeri diyaliz kasetinden çıkarın.Ardından, beşli etiketli SCI kitosanı bir mikrosantrifüj tüpüne toplanır ve -20 °C'de saklanır. Biyotinize plazma DNA çözeltisine streptavidin ile fonksiyonelleştirilmiş 605 noktaları ekleyin. Kuantum noktalarının FRET amacıyla tasarlanmış olması nedeniyle, standart Q-nokta serisi yerine ITK serisi Q-nokta konjugatlarını kullandığınızdan emin olun.Çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Olası fotobezmeyi önlemek için QD etiketleme reaksiyonunu karanlıkta tutun. 15 dakika sonra, nihai hacmi 200 microliters yapmak için QD etiketli DNA'yı 50 millimolar sodyum sülfat çözeltisine ekleyin.Bilim kurgu polimerini hazırlamak için, kitosan çözeltisindeki protonlanmış immünlerin DNA çözeltisindeki negatif fosfatlara teorik oranı olan istenen NP oranına göre, 10 mikrogram plazma DNA'sı için gerekli kitosan miktarını hesaplayın; bilim kurgu kitosanını, son hacim 200 mikrolitre olacak şekilde istenen NP oranına göre Milli Q suyu ile seyrelten. QD etiketli DNA ve bilim kurgu kitosanı çözeltileri, altıncı bölümde gösterileceği üzere mikroakışkan cihaza yükleme için hazırdır. Silikon gofret, 25 mikronluk belirlenmiş master kalınlığı için gofret üzerindeki nemi gidermek amacıyla piranha temizleme ve fırınlama işlemleriyle önceden hazırlanır. Negatif fotoresisti, silikon gofrete 2000 RPM hızında 30 saniye boyunca spin coat yöntemiyle uygulayın.Wafer'ı, saatte 65 °C artış hızıyla 95 °C'ye kadar ısıtılan bir sıcak plaka üzerinde yumuşak pişirme (soft bake) işlemine tabi tutun. Bu işlem, SU-8 fotoresistindeki solventin buharlaşmasını sağlayarak UV ışığına maruz bırakılmadan önce malzemeyi katılaştıracaktır.Yumuşak pişirme işleminden sonra, mikro kanal tasarımını içeren bir maske filmini silikon gofret üzerine uygulayın ve pozlama sonrası santimetrekare başına 250 milijoule değerinde 365 nanometre UV ışığına maruz bırakın. Gofreti, saatte 65 degrees Celsius artış hızıyla 95 degrees Celsius'ye ulaşacak şekilde bir ısıtıcı plaka üzerinde pişirin. Tam gelişimi kontrol etmek için gofreti SU eight Fotoresist geliştirici kullanarak geliştirin.Waferi izopropil alkole batırın. İzopropil alkol süt rengini almamalıdır. Son olarak, SU8 yapısını güçlendirmek için desenli wafer'ı, sıcak plakada saatte 65 °C artan bir rampa ile 200 °C'ye kadar sert pişirmeye (hard bake) tabi tutun.Gofretlemi 200 °C'de en az beş saat boyunca tutun. Ardından gofreti kademeli olarak oda sıcaklığına kadar soğutun. SU eight master'ı bir tartım kabına yerleştirin.Silikon elastomer ile kürleme ajanı polidimetilsiloksan (PDMS)'yi 10:1 oranında karıştırın. PDMS karışımını SU eight master üzerine dökün ve kabarcıkları gidermek için tartım kabını vakumlu desikatörde bekletin. PDMS'yi 65 °C'de bir ila iki saat boyunca kürleyin.PDMS kürlendikten sonra, akışkan cihazı için iki kanal girişi ve bir kanal çıkışı olacak şekilde, delgeç kullanarak PDMS şeridini silikon ana kalıptan ayırın. PDMS şeridini ve lamel camı etanol ile temizleyin ve ardından havada kurutun. Temizlenen PDMS şeridini ve lamel camını 20 watt gücünde oksijen plazması ile işlemden geçirin.İlk olarak, PDMS şeridi hemen lamla yapıştırın. Yapıştırılmış mikroakışkan çipi gece boyunca 95 °C'deki fırında bırakın. Bağlanma gücünü artırmak için plazma işlemi ve gece boyunca fırınlama esastır.Reaktifleri yüklemeden önce, içeride hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için mikroakışkan kanalı suyla doldurun. Bu, akışın sorunsuz olmasını sağlayacaktır. Deney sırasında, önceden hazırlanmış QD, etiketli DNA ve sci-fi etiketli Kitozan çözeltilerini borular aracılığıyla iki ayrı cam şırıngaya yükleyin.Tüpleri mikroakışkan cihazın iki girişine bağlayın. İşlem sırasında içeriye hava girmemesine dikkat edin. Akış hızını, laminar akış koşulları altında dakikada 20 nanolitre olarak ayarlayın.Akış yaklaşık 15 ila 20 dakika boyunca stabil kaldığında, mikro kanalları mikroskop altında kontrol edin. Kanalın merkezinde QD aracılı FRET gözlemlenmelidir. Soğutmalı bir CCD kamera ile kanal boyunca farklı konumlardan floresan görüntüler edinin.Bu görüntüleri Image J ve OriginLab ile analiz edin. Fret aracılı sinyal, kanal boyunca farklı eksenel pozisyonlarda izlenir. Kalış süresi, TISA çubuğunun kalış süresi olduğu bu formül kullanılarak, uygulanan akış hızına göre hesaplanır.Zaman X, iki akışın birleştiği nokta ile incelenen reaksiyonun konumuna olan mesafedir. V ise ortalama akış hızıdır. Böylece sistemimizde FRET aracılı bilimkurgu sinyallerinin kesit yoğunluk profilleri analiz edilebilir.Deneysel olarak ölçülen profiller Gauss dağılımı sergilemektedir. Basit bir mikroakış kanalında, kuantum aracılı iplik üzerinden DNA çivi komplekslerinin nasıl izleneceğini göstermiş olduk. Bu prosedürleri uygularken, uygulanan akış hızı ve kanal geometrisine dayanarak kalış süresinin doğru hesaplanabilmesi için mikroakış kanalınız üzerinde bir belirteç tasarlamanız gerektiğini hatırlatmak önemlidir.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneyinizde başarılar dileriz.

combining-qd-fret-microfluidics-to-monitor-dna-nanocomplex-self

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Biz DNA hibridizasyon tespiti için mikroakışkan tabanlı elektrokimyasal Bioçip sunuyoruz. SsDNA probu fonksiyonlandırmalar ardından, özgüllük, duyarlılık ve algılama limiti tamamlayıcı ve non-ssDNA hedefleri ile incelenmiştir. Sonuçlar 3.8 nM'lik bir algılama sınırı ile, elektro-kimyasal sistemine DNA hibridizasyonu olaylarının etkisini göstermektedir.

Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Polidimetilsiloksan (PDMS) içinde iki mikrokanal arasında nanoakışkan bir bağlantı oluşturmak için silika kolloidal nanopartiküllerin basit bir kendi kendine montaj tekniği öneriyoruz. Bu teknik kullanılarak, bir mikrokanalın içine ~ 45 nm'ye kadar gözenek boyutuna sahip nano gözenekli bir boncuk zarı inşa edildi ve DNA örneklerinin elektrokinetik ön konsantrasyonuna uygulandı.

Kolloidal Parçacıkların Öz-Montaj Süreci yoluyla PDMS mikroakışkan Chip Sub-50 Nm Nanofluidic Junctions oluşturma

Bu eser mikrosıvısal damlacık tabanlı platformlar imalatı ve polyacrylamide mikroküreler microsphere-PCR güçlendirme için uygulanması için bir yöntem sağlar. Microsphere-PCR yöntemi, Çift iplikçikli DNA ayıran olmadan tek iplikçikli DNA amplicons elde olanak verir.

Bir damlacık dayalı mikrosıvısal yaklaşım ve Microsphere-PCR güçlendirme tek iplikçikli DNA'Amplicons için

Kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, etiketlenmemiş protein kullanırken kısıtlama endonükleazlarının reaksiyon mekanizmasını araştırabiliriz. Bu tek moleküllü teknik, bireysel protein-DNA etkileşimlerinin büyük ölçüde çoğullanmış gözlemine izin verir ve veriler, iyi doldurulmuş bekleme süresi dağılımları oluşturmak için bir araya getirilebilir.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Burada, DNA üzerinde birleşen EWS-FLI1 kondensatlarının biyofiziksel mekanizmasını incelemek için tek moleküllü görüntüleme yöntemi olan DNA Perdeleri'nin kullanımını açıklıyoruz.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Öğrenin, QD-FRET ve mikroakışkanlar kullanarak DNA nano komplekslerinin gerçek zamanlı kendi kendine toplanmasını nasıl izleyeceğinizi. Bu yöntem, gen tedavisi uygulamaları için polielektrolit poliplekslerin sentezini iyileştirir.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Daha fazla video keşfet