İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

Bu prosedür, eksi 17 °C'ye ayarlanmış bir kriyostatta, sıvı azot buharıyla dondurulmuş doku bloklarının sekiz mikrometre kalınlığında kesilerek şarjsız düz cam lamlara alınmasıyla başlar. Ardından, kesitler histo gene boyama kiti ile boyanır. Piramidal nöronlar belirlendikten sonra, yaklaşık 500 hücre HS yakalama kapağına lazerle yakalanır.

Hücrelerin bulunduğu kap, 50 µL ekstraksiyon tamponu içeren bir mikro santrifüj tüpüne ters çevrilerek yerleştirilir ve daha önce buz üzerinde konumlandırılmış bir Falcon tüpüne aktarılarak 42 °C'ye ayarlanmış bir benmariye yerleştirilir. Kısa bir santrifüjleme adımının ardından kap çıkarılır. Geriye kalan solüsyon, RNA izolasyonu için hazır hale gelir.

Merhaba, ben McLean Hastanesi Yapısal ve Moleküler Nörobilim Bölümü'ndeki Wilson Wu laboratuvarından Charmaine Peterson. Bugün size, insan postmortem beyin dokusundan piramidal nöronların lazerle yakalanması işlemine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, mikroarray teknolojisi kullanarak şizofreni hastalarının superior ve inferior giruslarındaki diferansiyel gen ekspresyonunu incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Beyin dokuları, doku kesme işlemi öncesinde sıvı azot buharı ile dondurulmuş bloklar halinde Harvard Beyin Dokusu Kaynak Merkezi'nden temin edilmiştir. RNA kontaminasyonunu azaltmak önemlidir; bu nedenle çalışma alanı, kesme bıçağı ve lamlar dahil tüm yüzeyler, RNA SAP gibi bir RNA dekontaminasyon solüsyonu ile işlenmiş ve %100 ethanol ile silinmiştir.

Bu prosedür, sıvı azot buharı ile dondurulmuş doku bloklarının, -17 °C'ye ayarlanmış bir kriyostatta, şarjsız düz cam lamlar üzerine kesilmesiyle başlar. Doku kesitleri, histo gene hızlı boyama kiti kullanılarak piramidal nöronların tanımlanması için hazırdır. Etanoldehidratasyon serisini hazırlamak için, histo gene kitiyle birlikte verilen boyama kavanozlarına uygun etanol konsantrasyonlarından ve RNA içermeyen sudan 25 mL'lik alikotlar hazırlayın.

Bir adet %75 etanol kavanozu hariç tüm kavanozları bir buz kovasına yerleştirin. Bu %75 etanolü -20 °C dondurucuya koyun. Ardından, her 100 µL boyama çözeltisine bir mikrolitre RNA inhibitörü ekleyerek boyama çözeltisini hazırlayın.

İki lam üzerinde dört doku kesiti boyayacağımız için, bir mikrosantrifüj tüpündeki 400 mikrolitre boyama çözeltisine dört mikrolitre RNA inhibitörü eklenir. Boyama çözeltisi buz üzerinde tutulur. Çeker ocak altında çalışınız.

Fazla suyu gidermek için ksilen kavanozuna moleküler elekler ekleyin; fazla su, doku kalkmasını tehlikeye atabilir. Su banyosunu 42 °C sıcaklığa ayarlayarak açın ve bir raf yardımıyla desteklenmiş 50 mL'lik bir Falcon tüpünü su banyosuna yerleştirin. -80 °C dondurucudan iki lam çıkarın ve bunları bir Kim wipe üzerinde çözdürün.

Slaytların köşeleri çözülmeye başlayana kadar, yaklaşık 30 saniye boyunca dokuyu -20 °C dondurucudaki %75 etanol içinde kısa süreliğine sabitleyin. Ardından, RNA içermeyen pensler kullanarak slaytları 30 saniyelik bir yıkama için nükleaz içermeyen suya aktarın. Slaytlar yıkandıktan sonra, boyama solüsyonunu kesit üzerinde yoğunlaştırmak için kesitlerin etrafını bir PAP bariyer kalemiyle çevreleyin; dört kesiti histogene boyama solüsyonu ile 20 saniye boyunca boyayın. Kesit başına 97 µL boyama/RNA inhibitörü kullanarak, önceden buz üzerinde hazırlanan etanolde her adım için 30 saniye boyunca kesitleri dehidre edin.

Yeterli doku kalkması için gerekli olandehidratasyonu sağlamak amacıyla, son %100 etanol adımı üç dakikaya uzatılmalıdır. Son olarak, lamları beş dakika boyunca ksilen içinde bekletin ve lazer yakalama mikrodisseksiyona geçmeden önce lamların tamamen havada kurumasına izin verin; tek hücreli lazer yakalama prosedürü için boyama işleminden sonra piramidal nöronlar derhal çıkarılmalıdır. MİKRODİSSEKSİYON veya LCM, daha önceden hazırlanmış olan ve içinde 50 mL'lik bir Falcon tüpü bulunan 42 °C'lik bir su banyosu gerektirir.

Tek hücreli LCM, ARCTURUS XT lazer yakalama sistemi ve yazılımı ile gerçekleştirilir. Bu prosedüre başlamak için, lamları ve kapakları arcturus XT cihazına yerleştirin. Yakalama HS kapaklarını kullanın, ancak program ayarını makro konumunda tutun.

Her bir lamın genel görünüm fotoğrafını elde etmek için genel bakış yükleme kutusuna tıklayın. Lazer yakalama için en uygun kesiti belirlemek adına parlaklık odağını 2x büyütmede ayarlayın. Aşırı katlanmış doku kesimlerinden kaçının; bunun yerine bütün, pürüzsüz ve boyanmış kesitleri seçin.

Çekim yapacağınız genel bölgenin üzerine, bizim durumumuzda yakalanacak alan olan korteksin üçüncü katmanını da kapsayacak şekilde bir başlık yerleştirin. Başlık raylarının herhangi bir kıvrımın üzerinde kalmadığından emin olun, aksi takdirde başlık eğilecek ve bu da değişken spot boyutlarına yol açacaktır.

Ardından, IR lazer noktasının konumunu 40 x büyütmede manuel olarak doğrulayın. Mavi artı işareti, IR lazer noktasının merkezinde olmalıdır. Eğer değilse, noktanın üzerine sağ tıklayıp "located IR spot" seçeneğini seçerek konumunu ayarlayın.

40 x büyütmede, piramidal nöronları şu kriterlere göre belirleyin: birincisi, hücrelerin piramidal şeklinde olması ve ikincisi, apikal ve/veya bazal dendritlerin proksimal kısımlarının tanımlanabiliyor olmasıdır. Pozisyon fonksiyonundaki artı işaretine tıklayarak kapsama alanının konumunu kaydedin. Böylece, kapsama alanı hareket ettirilse bile, nokta boyutunu ayarladığınız tam olarak aynı noktaya her zaman geri dönecektir.

Kontrol kutusuna güç için 70 ve süre için 16 değerlerini girin. Bu parametreler kullandığımız dokuya özgü olduğundan, işleme başlamadan önce kendi özel doku örneğinize göre bu değişkenleri test etmenizi ve ayarlamanızı öneririz. Tek hücrelerin lazerle yakalanması işleminde, otomatik tabla hareket ettirme seçeneğinin işaretini kaldırın ve doğru boyut sembolünün sağdaki panelde yer alan sembolle örtüştüğünden emin olun.

Yakalama testi yapmak istediğiniz nöronu seçmek için sağ alt köşedeki daire seçeneğini seçin. Mavi artı işaretini daireyle hizaladıktan sonra, test IR spotuna tıklayarak lazeri aktive edin. Lazerin oluşturduğu nokta, öncelikle yakalanan nesnenin etrafında net, koyu bir halkaya sahip olmalıdır.

Halkanın hücreyi kapsayacak kadar büyük, ancak istenmeyen dokuları veya diğer hücreleri dahil etmeyecek kadar küçük olduğundan emin olun. Eğer bu halka çok açıksa, hücre yakalanamamış demektir. Koyu renkli halkanın ortasında koyu bir nokta varsa, lazer gücü veya süresi çok fazladır.

Bu işlemi, yakalamak istediğiniz katman içindeki dokunun farklı bölgelerinde tekrarlayın. Nokta boyutunun konuma bağlı olarak farklılık göstermediğini kontrol etmek için uygun ayarlamaları yapın. Yakalamak üzere yaklaşık 500 adet piramidal nöron belirleyin.

Hücreleri yakalamak için lazer yakalama düğmesine basın. Kapağı QC istasyonuna taşıyın. Nöronların en az %90'ının çıkarıldığından emin olun.

Eğer değilse, hücrelerin çoğunun yakalandığı bölgeden daha fazla hücre yakalayın. Kapağı, 50 µL ekstraksiyon tamponu içeren 0,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Kapak, tamponun sızmasını önleyecek şekilde mükemmelce oturacak biçimde tasarlanmıştır.

Ekstraksiyon tamponunun tüm kapağı kapladığından emin olarak düzeneği ters çevirin ve 42 °C'ye ayarlanmış su banyosundaki 50 mililitrelik Falcon tüpünün dibine yerleştirin. Dokunun kapaktan ayrılması için nöronları 30 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından tüp ve kapak düzeneğini 800 gs'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra kapağı çıkarın.

RNA izolasyonu daha sonra yapılacaksa, kalan hücre ekstraktını -80 °C'de saklayın. Aksi takdirde, bir sonraki bölümde gösterildiği gibi hücre ekstraktından RNA izolasyonuna geçin; RNA izolasyonu, LCM örneklerinden az sayıda hücreyi izole etmek ve düşük bolluktaki mRNA'yı muhafaza etmek için tasarlanmış PICO pure izolasyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir.

Bu prosedüre başlamak için, kit ile birlikte verilen %70 etanolü hücre ekstraktına ekleyin ve ön koşullandırılmış bir saflaştırma kolonunda santrifüjleyin. Yıkama işleminden sonra RNA'nın kolon filtresine bağlanmasını sağlamak amacıyla, DNA interferansı riskini ortadan kaldırmak için RNA'yı DNase ile işlemden geçirin. Bu adım, özellikle gerçek zamanlı R-T-P-C-R gibi sonraki uygulamalarda büyük önem taşımaktadır.

DNA sindiriminden sonra 40 µL yıkama tamponu bir (wash buffer one) ekleyin ve saflaştırma kolonunu 8.000 Gs hızında 15 saniye santrifüjleyin. Ardından, kit ile birlikte sağlanan protokole göre yıkama işlemlerine devam edin; ancak, RNA veriminizi düşürebilecek yıkama tamponunun kolonda kalmadığından emin olmak için yıkama tamponu iki (wash buffer two) ile yapılan son yıkama adımını iki dakikadan iki buçuk dakikaya çıkarın. Kolonu başka bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Elüsyon tamponunu ekleyin ve kolondaki filtre üzerinde bir dakika inkübe edin, ardından RNA'yı elüe etmek için kolonu santrifüjleyin.

Son olarak, sanal bir jel ve elektroforogram sağlayan bir Experian High Sense laboratuvar çipi çalıştırarak ekstrakte edilen RNA'nın kalitesini kontrol edin; numuneden 1,3 µL'yi 0,5 mL'lik bir tüpe pipetleyin. Kalite kontrol testi için numunenin geri kalanını -80 °C'de dondurun. RNA kalitesi doğrulandıktan sonra, RNA amplifiye edilebilir, işaretlenebilir ve hibridize edilebilir.

Gen ekspresyon profilleme analizi için, hem mikroarray hem de Q-R-T-P-C-R deneylerinin gerçekleştirilmesi için yeterli olan yaklaşık 50 mikrogram amplifiye RNA ile sonuçlanacak şekilde, ribo amp HS plus kiti ile iki tur lineer amplifikasyon gerçekleştirilecektir. Amplifiye RNA'yı işaretlemek için molecular devices marka turbo biotin labeling kiti ve işaretleme kiti kullanılır. Son olarak, atrix marka human X üç P gene chip pro beret kullanılarak gen ekspresyon profillemesi gerçekleştirilecektir.

Doku kesit alma işlemi sonucunda, her slaytta iki kesit olmak üzere toplamda iki slayt ve vaka başına toplam dört kesit elde edilmelidir. Her kesit; minimum yırtılma, çatlama veya katlanma ile pürüzsüz olmalıdır. Piramidal nöronlar, yaklaşık 20 ila 25 µm boyutunda, piramidal şeklinde, belirgin apikal dendritlere sahip ve koyu renkli boyanmış olmalıdır.

LCM sırasında, lazer termoplastik film üzerinden darbe yaptıktan sonra hücreler kapakçığa yapışır ve böylece çevre dokuyu bırakarak lam üzerinde kalmazlar. Makro ayarlarda, lazer gücünün ve şiddetinin doğru ayarlanmasıyla yakalama HS kapakçıkları kullanıldığında, nöronların yaklaşık %85 ila %100'ü kapakçığa yapışmalıdır. Her kesit için, kesit başına yaklaşık 500 ila 700 hücre elde etmelisiniz; bu da vaka başına en az 500 picogram toplam RNA ile sonuçlanacaktır.

Toplam RNA izolasyonunun ardından, RNA kalitesi BioRad Experian aracılığıyla bir elektroforogram ve sanal jel yardımıyla değerlendirilir. Postmortem dokularda, elektroforogramda 18 s ve 20 a s ribozomal RNA birimlerine karşılık gelen iki belirgin pik görmelisiniz. Ancak, kesit alma öncesindeki faktörler nedeniyle doku degrade olmuş olabileceği için durum her zaman böyle olmayabilir.

Normalde, kırmızı oklarla belirtildiği üzere, 18 s civarında büyük bir pik ve daha küçük bir 28 s piki ile karakterize, degradasyonu gösteren büyük bir tümseklik görürsünüz. Buna karşılık, aşırı degradasyon nedeniyle kötü kaliteli RNA, eğrisi altında geniş bir alan bulunan bir elektroforogram ile kendini belli eder. İki tur lineer amplifikasyon sonrası mRNA kalitesini test etmek için yayılım konumundaki aşağı yönlü kaymanın yanı sıra, hem BioRad Experian standart Sense lab çipi hem de NanoDrop spektrofotometresi kullanıyoruz.

Geleneksel Atrics mikroarray teknolojisinin, bu protokol ile tespit edilebilmesi için mRNA transkript yayılımının en az 600 nükleotid uzunluğunda olması gerekir. mRNA yayılımının, zamanın bir fonksiyonu olarak yavaşça alçalan büyük piklerin görüldüğü elektroferogram ile belirtildiği üzere 1000 nükleotid aralığına ulaştığı belirlenmiştir. Bu sonuç, sanal jel ile de doğrulanmıştır.

Transkript uzunlukları 600 nükleotidden kısaysa, örnek hibritleşmeye dahil edilmemelidir. NanoDrop okumaları, örnekler genelinde ortalama 260/280 oranının veya saflığın 2,5 olduğunu göstermiştir. Ortalama konsantrasyon 1,7 µg/µL olup, örnek başına yaklaşık 50 µg mRNA elde edilmiştir; bu miktar hem mikroarray analizi hem de 15 ila 20 µg mRNA gerektiren sonuçların qRT-PCR ile sonraki doğrulamaları için yeterlidir. Sonuçlarımız, bu protokol ile elde edilen RNA'nın hem miktarının hem de kalitesinin, atrix human X3P çipi aracılığıyla gen ekspresyon farklarını incelemek için yeterince iyi olduğunu göstermektedir.

Atrics Human X three P çipine hibridizasyon sonrası, yeterli hibridizasyonu ve prob yoğunluklarını gösteren ortalama %26,6'lık bir çağrı yüzdesi elde ettik. Bu hücrelerden elde edilen RNA'yı kullanmak amacıyla, postmortem insan beyin dokusundan lazer yakalama yöntemiyle parametal nöronların nasıl izole edileceğini size göstermiş olduk. Bu prosedür uygulandığında, mikroarray G profilleme çalışmaları için tüm adımların RNase'den arındırılmış bir ortamda gerçekleştirilmesi ve RNA bütünlüğünü korumak adına adımların zamanında tamamlanması önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.