Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Bu prosedür, yüksek kaliteli bir RNA şablonundan sentezlenen CDNA ile başlar. CDNA ilk olarak floresan boya SI üç ile etiketlenir. Etiketleme reaksiyonunun tamamlanmasının ardından, etiketli CDNA saflaştırılır, izole edilir ve etiketleme reaksiyonunun kalitesi değerlendirilir.

Etiketli CDNA daha sonra bir mikrodizi üzerine hibritlenir. Hibridizasyonun ardından, numunelerdeki gen ekspresyonunun nispi seviyelerini belirlemek için diziler analiz edilir. Merhaba, benim adım Sam Peterson, Purdue Üniversitesi Sağlık Bilimleri Okulu'nda Dr.Jennifer Freeman'ın laboratuvarından.

Daha önce, zebra balığı embriyolarından RNA'yı nasıl çıkaracağınızı ve bu RNA'yı CDNA'ya nasıl dönüştüreceğinizi göstermiştik. Bugün size, küresel gen ekspresyon profillerini incelemek için bu CDNA'yı bir zebra balığı, oligo nükleotid mikrodizi platformuna etiketleme ve hibritleştirme prosedürünü göstereceğiz. Tipik olarak, bu prosedürü, bir toksine maruz kalmaya yanıt olarak diferansiyel gen ekspresyonunu incelemek için kullanırız.

Öyleyse başlayalım. Mikroarray deneyi, CD NA'yı sci üç ile etiketlemeye başlamak için etiketlemede kullanılan floresan boya SI üç'ün foto bozulmasını önlemek için minimum ışık ortamı gerektirir: biyo prime dizi CGH genomik etiketleme sisteminin aşağıdaki bileşenleri: 2.5 x rastgele primer tamponu, 10 X-D-C-T-P karışımı ve nükleaz içermeyen su. Ek olarak, çözüldükten sonra SI üç etiketli DCTP'nin bir milimolar stoğunu çözün, kısaca santrifüjleyin veya reaktifleri 0.6 mililitre kalınlığında duvarlı bir tüpte birleştirin.

Toplam 86 mikrolitre hacim elde etmek için 500 nanogram CDNA 40 mikrolitre, 2,5 x rastgele astar tamponu ve nükleaz içermeyen su. İyice karıştırın ve kısaca santrifüjleyin, ardından reaksiyonu bir termosiklertörde yüz santigrat derecede beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, reaksiyonu hemen 10 dakika boyunca bir buz banyosu bulamacına aktarın.

Ardından, ekzo DNA polimerazı dondurucudan çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra reaksiyon tüpüne ekleyin, 10 mikrolitre 10 X-D-C-T-P İki mikrolitre bir milimolar SI 3D CTP ve iki mikrolitre XO temizleme DNA polimerazı karıştırın ve kısaca santrifüjleyin. Son olarak, reaksiyonu 37 santigrat derecede 16 saat inkübe edin ve etiketleme bittiğinde bir termosiklatör inkübe edin.

Etiketli CDNA'yı temizlemeye ve çökeltmeye devam edin. Etiketli CDNA'yı temizlemeye başlamak için. 1,5 mililitrelik tüpe bir MicroCon sütunu yerleştirin.

Sütuna 0.1 XSSC olmayan 300 mikrolitre ekleyin ve ardından etiketleme reaksiyonunu ekleyin. Kolonu 16, 100 G'de dört derece SIU'da 10 dakika santrifüjleyin. Akışın açık pembe olabileceğine dikkat edin.

Akışı atın ve sütuna 300 mikrolitre daha nought 0.1 XSSE ekleyin. Daha sonra santrifüjlemeyi dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16, 100 G'de tekrarlayın. Yine, akışı atın ve bu son yıkamadan sonra dört santigrat derecede 12 dakika boyunca 16, 100 G'de santrifüjleyin, şimdi sütuna 300 mikrolitre T 0.1 XSSC ekleyin.

Akış net olmalı ve sütunda pembe etiketli CDNA görünmelidir. Yine, etiketli CD NA'dan kaçınmak için bu son yıkamadan geçen akışı atın. Kolona 100 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Kolonu mikro santrifüj tüpünden çıkarın ve ters çevirerek yeni bir tüpe yerleştirin.

Daha sonra ters çevrilmiş sütunu 2.300 G'de dört santigrat derecede iki dakika santrifüjleyin. Etiketli CDNA, tüpün altındaki suda çözülür. Üreticinin talimatlarına göre bir NanoDrop ND 1000 spektrofotometre kullanarak belirtilen CDNA'yı kontrol edin.

DNA konsantrasyonunu hesaplayın ve ekteki yazılı protokolde açıklandığı gibi boya katılımını değerlendirin. CDNA yeterince etiketlenmişse, etiketli CD NA karışımını pH 5.2 ve bir x hacimde üç molar sodyum asetatın 0.1 x hacminde çökeltmek için yeni bir tüpe altı mikrogram koyun. İzopropanol, karanlığı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe eder.

Bu noktaya kadar olan tüm adımların minimum ışıklı bir ortamda gerçekleştirildiği akılda tutulmalıdır. Daha sonra numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 16, 100 G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, pembe olan DNA peletini bozmadan SUP natantını dikkatlice atın.

Son olarak 500 mikrolitre,% 70 etanol eklenerek yıkandı ve beş dakika boyunca 16, 100 G'de hafif inversiyon santrifüjü ile karıştırıldı. Oda sıcaklığında, supinatı çıkarın, tüpü ters çevirin ve peletin beş dakika kurumasını bekleyin. Etiketli CDNA hibridizasyon için hazırdır.

Hibridizasyona başlamadan önce, çevik gen hibridizasyon sistemini açın ve 42 santigrat dereceye kadar dengelenmesine izin verin. Etiketli CD NA peletini beş mikrolitre nükleaz içermeyen suda çözünmüş pelete çözerek başlayın. Roche Nimble Gen Hybridization kitinden Hibridizasyon bileşenlerini, Hibridizasyon tamponu hibrit A'dan ve hizalama oligosundan, ekteki yazılı protokolde belirtildiği gibi toplam 18 mikrolitrelik bir hacme ekleyin.

İyice karıştırın ve alttaki içeriği toplamak için tüpü kısaca döndürün. Daha sonra, tüpü beş dakika boyunca 95 santigrat dereceye yerleştirerek etiketli CDNA'yı denatüre edin. Diziler hazır olana kadar tüpü hemen çevik gen hibridizasyon sistemine aktarın.

Mikrodizilerin dikkatli kullanım ve depolama gerektirdiğini unutmayın. Roche çevik gen dizileri, oda sıcaklığında kurutucu ile karanlıkta saklanır. Diziyi hassas karıştırıcı hizalama aracına yükleyin.

PMA T, X bir karıştırıcıdaki PMA T'ye yüklenir ve yapışkan şeridi forseps ile çıkarın. Dizi ve mikser yüklendikten sonra PMA T'yi güvenli bir şekilde kapatın. Ardından, PMA t'deki delikten karıştırıcıya basınç uygulayarak diziyi ve karıştırıcıyı PMA T'den ayırın.

Son olarak, dizinin sızdırmaz olduğundan emin olmak ve kabarcıkları gidermek için mikserin dışına baskı uygulamak için bir brayer kullanın. Ardından, CDNA örneğini diziye yüklemek için dizi karıştırıcı kompleksini ısıtmak için hibridizasyon sistemine yerleştirin. Yer değiştirme perpetini yavaşça ve sabit bir basınçla kullanın.

Etiketli numuneden 15 mikrolitreyi mikserin ortasındaki doldurma portuna ekleyin. Fazla numuneyi port deliklerinden silin ve yapışkan şeritlerle kapatın. Ardından mandalı kapatın.

Şimdi çevik gen hibridizasyon sisteminde B programını kullanarak hibridizasyon çözeltisini karıştırmaya başlayın. Mikrodizinin 16 ila 20 saat hibridleşmesine izin verin Hibridizasyondan sonra, hibridizasyon tamamlanmak üzereyken mikrodizi yıkanacak ve taranacaktır. Gen seçer 4.000 B dizisi tarayıcısını açarak taramaya hazırlanın ve yaklaşık 15 dakika ısınmasına izin verin.

Ardından, ekteki yazılı protokolde belirtildiği gibi bir, bir, bir, B, iki ve üç yıkama tamponlarını hazırlayın. Savaş öncesi yıkama tamponu bir A'yı 42 santigrat dereceye kadar tamponlayın, ancak diğer tamponları oda sıcaklığında bırakın. Yıkama tamponu bir A ısındığında, bir tabağa dökün.

Bir sürgülü rafı yıkama tamponuna daldırın, bir B.Şimdi dizi karıştırıcı kompleksini çevik gen hibridizasyon sisteminden çıkarın ve jig'e kaydırın. Düzeneği bir A ön ısıtma yıkama tamponuna daldırarak yıkamaya başlayın ve slayttan soyarak karıştırıcıyı dikkatlice çıkarın. Ardından diziyi aparattan çıkarın ve yıkama tamponu bir A'da 15 saniye çalkalayın. Diziyi hızlı bir şekilde yıkama tamponu B içine batırılmış bir kayar rafa aktarın ve kayar rafı iki dakika kuvvetlice çalkalayın.

Ardından sürgülü rafı ikinci yıkama tamponuna aktarın ve bir dakika çalkalayın. Son olarak, sürgülü rafı üçüncü yıkama tamponuna aktarın ve 15 saniye çalkalayın. Diziyi slayt kurutma santrifüjüne aktararak yıkayıcıları bitirin ve santrifüjlemeyi takiben iki dakika döndürün.

D ışığa ve ozona duyarlı olduğu için diziyi hemen tarayın, dizi barkodunu gen penaları 4.000 B dizisi tarayıcısına yükleyerek taramayı başlatın. Donanım ayarı diyalog kutusu setinde, 532 nanometre lazerin 500'de ayarlanmış bir PMT değeri vardır, gücü %100 piksel boyutuna beş mikrona, çizgileri ortalamaya bir mikrona ve odak konumunu sıfıra ayarlayın. Kurulum tamamlandığında, diziyi önizleyin.

Taramak için bir alan seçin ve ardından tarayın. Tarama tamamlandıktan sonra görüntü histogramını kontrol edin. İdeal olarak, bir E eksi beş normalleştirilmiş sayım 65.000 doygunluk sınırında olmalıdır, bu da özelliklerin yaklaşık% bir ila 2'sinin doygun olduğu anlamına gelir.

Normalleştirilmiş sayımlar bir E eksi beşten azsa, PMT kazancını artırın ve slaydı yeniden tarayın. Normalleştirilmiş sayımlar bir E eksi beşten büyükse, PMT kazancını azaltın ve slaydı yeniden tarayın, görüntüyü kaydedin ve veri normalizasyonu ve yoğunluk değerlerinin hesaplanması için bir veri analiz programı kullanın. Etiketleme reaksiyonu rutin olarak en az 10 mikrogram etiketli CDNA verir.

Boya birleştirme, nükleotidin SI üç oranının A iki 60 ila beş 50 oranının 23 nokta 15 ile çarpımına eşit olduğu basit bir baz boya oranı kullanılarak hesaplanabilir. İyi bir reaksiyon 50 ile 80 arasında bir değerle sonuçlanacaktır. Kabul edilebilir bir hibridizasyon, doymuş verim özelliklerinin% bir ila 2'sine sahip olacaktır.

65.000 doygunluk sınırında bir E eksi beş normalleştirilmiş sayım. PMT değeri ayarlandığında, 500'e yakın hibridizasyon kalitesi, mikrodizinin taranmış görüntüsünü görüntüleyerek ve hizalanmış oligoların dizideki diğer özelliklere yoğunluğunu değerlendirerek kalitatif olarak da değerlendirilebilir. Taranan görüntü, dizi alanındaki herhangi bir belirli nokta veya toz lekesi açısından da değerlendirilmelidir.

Sonraki analizde, örneklerdeki gen ekspresyonunun göreceli düzeylerini belirlemek ve diferansiyel olarak eksprese edilen genleri tanımlamak için analiz verilerinizi görüntülemek için bir dağılım grafiği kullanılabilir. Diferansiyel olarak ifade edilen genler, ücretsiz bir prosedürde en uygun çizgiden önemli ölçüde sapacaktır. Zebra balığı embriyolarından RNA'yı c CD NA sentezlemek için nasıl çıkaracağınızı gösterdik. Burada, küresel gen ekspresyon profillerini incelemek için CD NA'yı bir oligonükleotid mikroray platformuna nasıl etiketleyeceğinizi ve hibritleştireceğinizi gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, her zaman yüksek kaliteli CD NA kullanmayı unutmayın ve sitenin üç boyasını doğrudan aydınlatmaya maruz bırakmaktan kaçının. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.