Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Bu prosedür, yüksek kaliteli bir RNA kalıbından sentezlenmiş cDNA ile başlar. cDNA önce floresan boya Cy3 ile işaretlenir. İşaretleme reaksiyonu tamamlandığında, işaretlenmiş cDNA saflaştırılır, izole edilir ve işaretleme reaksiyonunun kalitesi değerlendirilir.

İşaretlenmiş CDNA daha sonra bir mikroarray üzerine hibridize edilir. Hibridizasyonun ardından, örneklerdeki göreceli gen ekspresyon seviyelerini belirlemek için arrayler analiz edilir. Merhaba, ben Purdue Üniversitesi Sağlık Bilimleri Okulu'ndaki Dr. Jennifer Freeman laboratuvarından Sam Peterson.

Daha önce, zebrafish embriyolarından RNA'nın nasıl ekstrakte edileceğini ve bu RNA'nın nasıl cDNA'ya dönüştürüleceğini göstermiştik. Bugün, global gen ekspresyon profillerini incelemek amacıyla, bu cDNA'nın etiketlenmesi ve zebrafish oligonükleotid mikroarray platformuna hibridizasyonu prosedürünü göstereceğiz. Tipik olarak bu prosedürü, bir toksin maruziyetine yanıt olarak gelişen diferansiyel gen ekspresyonunu incelemek için kullanırız.

Öyleyse başlayalım. Mikroarray deneyi, etiketlemede kullanılan Cy3 floresan boyasının fotodegradasyonunu önlemek için minimum ışık ortamı gerektirir. cDNA'yı Cy3 ile etiketlemeye başlamak için BioPrime Array CGH Genomic Labeling System'in şu bileşenlerini çözdürün: 2.5x random primer tamponu, 10X dNTP karışımı ve nükleaz içermeyen su. Ayrıca, 1 mM'lık Cy3 etiketli dCTP stokunu çözdürün. Çözdürme işleminden sonra, reaktifleri kısa süreliğine santrifüjleyip 0.6 mL'lik kalın duvarlı bir tüpte birleştirin.

40 µL cDNA'nın 500 ng'ı, 2.5 x random primer tamponu ve toplam hacmi 86 µL'ye tamamlamak için nükleaz içermeyen su ekleyin. İyice karıştırıp kısa süreliğine santrifüjleyin, ardından reaksiyonu bir termosiklet cihazında 100 °C'de beş dakika inkübe edin. İnkübasyon sonunda, reaksiyonu derhal 10 dakika boyunca buz banyosuna aktarın.

Ardından, exo DNA polimerazı dondurucudan çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Daha sonra reaksiyon tüpüne 10 µL 10 X-D-C-T-P Mix, 2 µL 1 mM SI 3D CTP ve 2 µL XO cleanout DNA polimeraz ekleyin; iyice karıştırın ve kısaca santrifüjleyin. Son olarak, reaksiyonu 37 °C'de 16 saat boyunca inkübe edin ve etiketleme işlemi tamamlandığında bir termosikletör kullanın.

İşaretlenmiş cDNA'nın temizlenmesi ve çöktürülmesi işlemine geçin. İşaretlenmiş cDNA'yı temizlemeye başlamak için bir MicroCon kolonunu 1.5 ml tüpe yerleştirin.

Kolona 300 µL 0.1 XSSC ekleyin ve ardından işaretleme reaksiyonunu ekleyin. Kolonu 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.100 ×g'de santrifüjleyin. Akış sıvısının açık pembe olabileceğine dikkat edin.

Akış sıvısını atın ve kolona 300 µL daha 0.1 X SSC ekleyin. Ardından, 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.100 G'de santrifüj işlemini tekrarlayın. Akış sıvısını tekrar atın ve kolona ek olarak 300 µL 0.1 X SSC ekleyin; bu son yıkamadan sonra 4 °C'de 12 dakika boyunca 16.100 G'de santrifüj yapın.

Akış sıvısı berrak olmalı ve kolonda pembe etiketli CDNA görülmelidir. Etiketli CD NA'yı elüe etmek için bu son yıkamadan gelen akış sıvısını tekrar atın. Kolona 100 microliters nükleazdan arındırılmış su ekleyin. Kolonu mikro santrifüj tüpünden çıkarın ve yeni bir tüpe ters çevirin.

Ardından ters çevrilmiş kolonu 4 °C'de 2 dakika boyunca 2,300 G'de santrifüjleyin. İşaretli cDNA, tüpün altındaki suda çözünmüş haldedir. Elde edilen cDNA'yı, üretici talimatlarına uygun olarak NanoDrop ND 1000 spektrofotometre kullanarak kontrol edin.

Eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı şekilde DNA konsantrasyonunu hesaplayın ve boya inklüzyonunu değerlendirin. cDNA yeterince işaretlenmişse, işaretli cDNA karışımını çöktürmek için yeni bir tüpe altı mikrogram ekleyin; pH 5.2'de 3 molar sodyum asetatın 0,1 x hacmi ve 1 x hacim isopropanol ile oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika inkübe edin.

Bu noktaya kadar olan tüm adımların minimum ışık ortamında gerçekleştirildiği unutulmalıdır. Ardından numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 16.100 G'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, pembe renkli olan DNA peletini bozmadan supernatantı dikkatlice dökün.

Son olarak, 500 µL %70 etanol ekleyerek yıkama yapıldı ve tüp nazikçe tersyüz edilerek karıştırıldıktan sonra 16.100 G'de beş dakika santrifüj edildi. Oda sıcaklığında süpernatan uzaklaştırıldı, tüp ters çevrildi ve peletin beş dakika boyunca kuruması sağlandı. İşaretlenmiş cDNA hibridizasyon için hazırdır.

Hibridizasyona başlamadan önce, nimble gen hibridizasyon sistemini açın ve 42 °C'ye dengelenmesini bekleyin. İşleme, işaretli CD NA pelletini beş µL nükleaz içermeyen suda çözerek başlayın. Eşlik eden yazılı protokolde belirtildiği üzere, Roche Nimble Gen Hybridization kitinden hibridizasyon tamponu hybrid A ve hizalama oligosu hibridizasyon bileşenlerini toplam 18 µL hacme ulaşacak şekilde ekleyin.

İyi karıştırın ve içeriği tabanda toplamak için tüpü kısa süreliğine santrifüjleyin. Ardından, tüpü beş dakika boyunca 95 °C'de tutarak işaretli cDNA'yı denatüre edin. Diziler hazır olana kadar tüpü hemen NimbleGen hibridizasyon sistemine aktarın.

Mikrodizilerin dikkatli bir şekilde taşınması ve saklanması gerektiğini unutmayın. Roche nimble gen dizileri, oda sıcaklığında, kurutucuyla birlikte karanlıkta saklanır. Diziyi hassas karıştırıcı hizalama aracına yerleştirin.

PMA T'ye X one karıştırıcıyı yükleyin ve yapışkan şeridi pensle çıkarın. Dizi ve karıştırıcı yüklendiğinde, PMA T'yi güvenli bir şekilde kapatın. Ardından, PMA t üzerindeki delikten karıştırıcıya baskı uygulayarak diziyi ve karıştırıcıyı PMA T'den ayırın.

Son olarak, dizinin sızdırmaz olduğundan emin olmak ve hava kabarcıklarını gidermek için mikserin dış çevresine bir brayer ile basınç uygulayın. Ardından, cDNA örneğini diziye yüklemek amacıyla, dizi mikser kompleksini ısıtılmak üzere hibridizasyon sistemine yerleştirin. Yer değiştirme pipetini yavaşça ve sabit bir basınçla kullanın.

İşaretlenmiş örnekten 15 µL'yi karıştırıcının merkezindeki dolum portuna ekleyin. Port deliklerindeki fazla örneği silin ve yapışkan şeritlerle kapatın. Ardından mandalı kapatın.

Şimdi nimble gen hibridizasyon sistemindeki B programını kullanarak hibridizasyon solüsyonunu karıştırmaya başlayın. Mikrodizinin 16 ila 20 saat boyunca hibridize olmasına izin verin. Hibridizasyon tamamlanmaya yakınken, mikrodizi yıkanacak ve taranacaktır. Gene Picks 4,000 B dizi tarayıcısını açarak tarama işlemi için hazırlık yapın ve cihazın yaklaşık 15 dakika boyunca ısınmasını bekleyin.

Ardından, ekteki yazılı protokolde belirtildiği şekilde bir A, bir B iki ve üç yıkama tamponlarını hazırlayın. Yıkama tamponu bir A'yı 42 °C'ye ısıtın, ancak diğer tamponları oda sıcaklığında bırakın. Yıkama tamponu bir A ısındığında, onu bir kaba boşaltın.

Bir lam rafını yıkama tamponu bir B içine daldırın. Şimdi dizi karıştırıcı kompleksini nimble gen hibridizasyon sisteminden çıkarın ve jigin içine kaydırın. Düzeneği önceden ısıtılmış yıkama tamponu bir A içine daldırarak yıkama işlemini başlatın ve karıştırıcıyı laptan soyarak dikkatlice çıkarın. Ardından diziyi jigden çıkarın ve yıkama tamponu bir A içinde 15 saniye boyunca çalkalayın. Diziyi hızla yıkama tamponu bir B içine daldırılmış bir lam rafına aktarın ve lam rafını iki dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın.

Ardından lam rafını yıkama tamponu ikiye aktarın ve bir dakika boyunca çalkalayın. Son olarak, lam rafını yıkama tamponu üçe aktarın ve 15 saniye boyunca çalkalayın. Diziyi lam kurutma santrifüjüne aktarıp iki dakika boyunca döndürerek yıkama işlemlerini tamamlayın.

D ışığa ve ozona duyarlı olduğu için diziyi hemen tarayın; diziyi barkodu aşağı bakacak şekilde GenePicks 4,000 B dizi tarayıcısına yerleştirerek tarama işlemine başlayın. Donanım ayarları iletişim kutusunda, 532 nanometre lazerin PMT değerini 500 olarak belirleyin; gücü %100'e, piksel boyutunu beş mikrona, ortalanacak satır sayısını bire ve odak konumunu sıfır mikrona ayarlayın. Kurulum tamamlandığında, dizinin önizlemesini yapın.

Taranacak bir alan seçin ve ardından bu alanı tarayın. Tarama tamamlandığında görüntü histogramını kontrol edin. İdeal olarak, E eksi beş normalize edilmiş sayımlardan birinin 65.000 saturasyon sınırında olması gerekir; bu durum, özelliklerin yaklaşık %1 ila 2'sinin satüre olduğu anlamına gelir.

Normalize edilmiş sayımlar 1 E-5'ten küçükse, PMT kazancını artırın ve lamı yeniden tarayın. Normalize edilmiş sayımlar 1 E-5'ten büyükse, PMT kazancını düşürün ve lamı yeniden tarayın, görüntüyü kaydedin ve veri normalizasyonu ile yoğunluk değerlerinin hesaplanması için bir veri analiz programı kullanın. İşaretleme reaksiyonu rutin olarak en az 10 µg işaretli cDNA üretir.

Boya inklüzyonu, nükleotid/SI 3 oranının A 260/A 550 oranının 23,15 ile çarpımına eşit olduğu basit bir baz boya oranı kullanılarak hesaplanabilir. Başarılı bir reaksiyon sonucunda 50 ile 80 arasında bir değer elde edilir. Kabul edilebilir bir hibridizasyonda, özelliklerin %1 ila %2'si doygunluğa ulaşarak sonuç verecektir.

65.000 doygunluk sınırında 1 E-5 normalize edilmiş sayım. PMT değeri 500 civarına ayarlandığında, mikroarray'in taranmış görüntüsü incelenerek ve hizalanmış oligoların yoğunluğu array üzerindeki diğer özelliklerle karşılaştırılarak hibridizasyon kalitesi nitel olarak da değerlendirilebilir. Taranmış görüntü, array alanı içerisinde herhangi bir partikül veya toz lekesi olup olmadığı açısından da değerlendirilmelidir.

Sonraki analizlerde, örneklerdeki gen ekspresyonunun göreceli seviyelerini belirlemek ve diferansiyel olarak eksprese edilen genleri tanımlamak için analiz verilerinizi görüntülemek amacıyla bir saçılım grafiği kullanılabilir. Diferansiyel olarak eksprese edilen genler, en iyi uyum çizgisinden önemli ölçüde sapacaktır. Tamamlayıcı bir prosedürde, zebrafish embriyolarından RNA nasıl ekstrakte edilir ve sentezlenerek cDNA'ya dönüştürülür göstermiştik. Burada ise, global gen ekspresyon profillerini incelemek için cDNA'nın bir oligonükleotid mikroarray platformu üzerinde nasıl işaretleneceğini ve hibridize edileceğini gösterdik.

Bu prosedürü uygularken, her zaman yüksek kaliteli CD NA kullanmayı unutmayın ve bölge üç boyasının doğrudan ışığa maruz kalmasından kaçının. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.