Name: Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Öğrenin tek parçacık düzeyinde viral füzyon kinetiğini iki renkli floresans mikroskobu ile görselleştirmeyi. Bu yöntem hemifüzyon ve gözenek oluşumunu gerçek zamanlı izleyerek viral giriş mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH hibe AI57159 (SCH) ve AI72346 (AMvO) tarafından desteklenmiştir. SCH Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırmacı.

Cam kapak kayma işlevsellik Füzyon tayininde kullanılan düzlemsel bilayeri dekstran sulu film desteklenmektedir. Dekstran düzlemsel bilayeri ve cam yüzeyi arasında boşluk gibi davranır. Bu cam yüzey takılıp haline membran bileşenleri önler ve aynı zamanda bir virüs parçacık içeriği füzyon üzerine kaçmak için yer sağlar. Cam lamelleri bize kimyasal bağ dekstran cam (Elender, ve ark 1996) sağlar silan epoksi ile tedavi yoluyla Fonksiyonlu. <ol><li> Seramik boyama raf 25 mm lamelleri düzenleyin ve bir kavanoz veya behere rafa yerleştirin. </li><li> Konteyner% 10 laboratuvar notu züccaciye deterjan solüsyonu ile doldurun. 30 dakika boyunca ultrasonik temiz kap yerleştirin. </li><li> Deiyonize su ile, konteyner ve kapak rafı ve dolum 1M postassium hidroksit ile durulayın. Başka bir 30 dakika banyo sonikatör konteyner dönün. </li><li> Aseton ve etanol kullanılarak bu temizlik işlemi tekrarlayın. </li><li> Su ve kuru coverlips durulayın. </li><li> Son olarak, üç dakikada bir oksijen plazma striptizci lamelleri temizleyin. </li><li> Son temizlik adım, cam aşağıdaki silanization adımları düzgün hidrofilik ve reaktif, yüzey oksitler. </li><li> Isopropanol 3-glycidoxypropyltrimethoxy silan% 0.2 solüsyon hazırlayın. Beş dakika için bu çözüm lamelleri bırakın. </li><li> Silan çözüm atın ve isopropanol lamelleri birkaç kez yıkayın. </li><li> Lamelleri silan bir tabaka ile kaplıdır, ancak cam kovalent bağ silan izin tedavi edilmelidir. Bir saat boyunca 80 santigrat dereceye ayarlanmış fırında lamelleri yerleştirin. </li><li> Lamelleri kuruyan, dekstran 500 tartmak ve% 30 w / v çözeltisi hazırlamak. Su Ön ısıtma çözülme yardımcı olacaktır. Biz, lamel başına bu çözüm yaklaşık 1 ml kullanabilirsiniz. Dekstran çözünmüş sonra, bir vakum desikatörde çözüm defoam. </li><li> Silanlanmış lamelleri kür bitirdiğinizde, seramik rafa kaldırmak ve onları plastik bir dondurucu kutusunun içine düz düzenlemek. Dekstran çözüm ~ 1 ml her lamel üst yüzeyi kapsayacak şekilde 1 ml pipet kullanın. Dondurucu kutusunu kapatın ve 24-36 saat boyunca sessiz bir yerde bekletin. </li><li> Plastik forseps ile lamelleri açgözlü, aşırı dekstran seramik rafın içine dökün ve bunların yerine. Lamelleri su birkaç kez durulayın ve lamelleri 48 saat süreyle su ile ıslatın. Kavanozu hafifçe bir masa üstü rotator ajite olabilir. </li><li> 80 santigrat derece ve bir vakum desikatörde saklayın ayarlanmış fırında lamelleri kurulayın. </li></ol> Lipozom Hazırlık Desteklenen çift katlı lipit katmanını dekstran Fonksiyonlu lamel lipozomlar adsorblama oluşur. Zar yırtıkları ve düz bir yüzey üzerinde yayılır kadar birbirleri ile adsorbe lipozomlar sigorta. <ol><li> Tayininde kullanılan tipik bir lipozom formülasyonu 1,2 oluşur, dioleoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin (DOPC), 1-oleoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin (POPC), kolesterol, sığır beyin Disialoganglioside (GD 1a) ve N-((6 - (biotinoyl) amino) hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-Glycéro-3-phosphoethanolamine 4:4:2:0.1:5 x10 -5 'lik bir oran. Tüm bileşenleri kloroform veya kloroform ve metanol çözümleri saklanır. </li><li> Bir cam tüpe aktararak her bir bileşenin hacimleri iki mikromolden lipid içeren bir karışım hazırlayın. Argon veya azot gazı akışı altında çözücü buharlaşır. Iki saat için bir vakum desikatörde test tüpü bırakarak kalan solvent çıkarın. </li><li> HNE tampon 400 mikrolitre (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) kurutulmuş lipid filmi tekrar </li><li> Süspansiyon, plastik bir mikrosantrifüj tüp aktarın. Sıvı azot banyo ve sıcak su banyosu bir çözülme içinde süspansiyon dondurun. Bu donma / çözülme döngüsü dört kez tekrarlayın. </li><li> 100 nm polikarbonat membran filtre ile lipid ekstruder birleştirin ve lipid süspansiyon 25 kez a'ya. Ekstrüzyon sonra daha şeffaf olması için süspansiyon görünmelidir. </li><li> Lipozomlar hazırlanır gün kullanılmalıdır. Kullanılıncaya kadar oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol> Mikroakışkan akışı hücre hazırlığı Mikroakışkan basit bir akış hücresi, bir kuvars slayt ve Fonksiyonlu lamel arasında çift kaset sopa sandviç tarafından yapılır. <ol><li> 20x20x3 mm kuvars slayt alın. Karşı tarafta iki adet 1 mm delik bir elmas tur kullanın. </li><li> Çift kaset sopa bir levha 20 mm kare kesilmiş ve bir jilet kullanarak merkezine 15 x 2 mm bölümü kesip. </li><li> Bir tarafı, teyp yedekleme ve litre bant uymak soyunz slayt. Fonksiyonlu lamel diğer tarafında uyun. </li><li> Polietilen boru, iki adet 20 cm uzunlukta kesin ve kuvars slayt deliklerin içine yerleştirin. </li><li> 5 dakikalık epoksi yapıştırıcı ile akış hücresi Seal. </li><li> tamponu ile tutkal tedavi, asal akış hücresi ve tüp. </li><li> Desteklenen bir çift katlı lipid kanallar içine lipozom süspansiyon yaklaşık 80 mikrolitre çizerek, bu aşamada oluşturulabilir. </li></ol> Virüs parçacık etiketleme <ol><li> H3N2 influenza A (X-31) tipik füzyon tayini için kullanılan, ancak, diğer grip suşlarının ve diğer virüsleri başarılı bir şekilde kullanılmıştır. </li><li> Virüs hemifusion ve gözenek oluşumu tespit izin vermek için iki farklı floresan boyalar ile etiketlenir. </li><li> 20 mM bir çözüm yapmak için HNE tampon sulforhodamine b (SRB) eritin. 10 mikrolitre viral süspansiyon ile boya çözüm 20 mikrolitre birleştirin ve oda sıcaklığında 20 saat bırakın. Bu dönemde, boya yavaş yavaş virüs parçacıkları birikebilir. </li><li> PD-10 tuzsuzlaştırma sütun aracılığıyla virüs süspansiyon geçerek aşırı boya çıkarın. Yeterli viral malzeme kullanılması durumunda, renkli bir bant sütununda görülebilir. Bu band etiketli virüs içerir ve yıkandı, olarak toplanabilir. </li><li> Hiçbir grubun görünmüyorsa, 200 mikrolitrelik kesirleri toplamak ve bir spektrofotometre ile 565 nm emme ölçerek virüs etiketli içeren fraksiyonları belirlemek. Toplam hacminin yaklaşık 0.8 ml virüs Zehir gerekir. </li><li> SRB etiketli virüs süspansiyonu 13 mikrolitre octadecyl rodamin 110 (Rh110C18) 2 mM dimetil formamid (DMF) çözümü ekleyerek viral zarf etiketleyin. </li><li> Süspansiyon bir laboratuvar rotator tüp ekleyerek karıştırın ve 3 saat bekletin. </li><li> Daha önce de açıklandığı gibi, PD-10 tuzsuzlaştırma sütun kullanarak aşırı Rh110C18 virüs arındırın. </li></ol> Mikroskop yapılandırma Deney, toplam iç yansıma floresan mikroskopi için uygun bir yüksek NA immersiyon yağı amacı ile donatılmış bir floresan mikroskop yapılır. Argon / kripton gaz lazer 488 ve 568 nm hatları Rh110C18 ve SRB etiketli virüs heyecanlandırmak için kullanılır. Her etiket eş zamanlı görüntüleme bölme dikroik bir ayna ile yeşil ve kırmızı floresan emisyon tarafından gerçekleştirilir ve görüntüleri bağımsız ayrı bir elektron çarparak CCD kamera yarısı üzerine duruluyor. Deneyin yapılması Etiketli virüs parçacıkları, floresein ile yüzey kaplama ve düşük pH tampon (Şekil 1A) ile reaksiyon başlangıcında yerleştirme, füzyon testinin Yürütme akışı hücre içinde biyokimyasal bileşenlerin aşamalı montaj içerir düzlemsel çift katlı lipid montaj: . <ol><li> Mikroskop sahneye akış hücre Dağı ve dakikada 40 mikrolitre hızında akış bir şırınga pompa çıkış boru takın. </li><li> HNE 300 mikrolitre akan aşırı lipozomlar akış kanalları temizleyin. </li><li> Mikroskop Focus ve 488 nm ışık ve 568 nm ışık 70 W / cm 2 350 W / cm 2 yüzey aydınlatmak için lazer gücünü ayarlamak. 1.45 NA 60x immersiyon yağı hedefi kullanıyorsanız, sırasıyla, lazer yoğunlukları mikro 100 Watt ve 20 Watt mikro ayarlayabilirsiniz. </li><li> Pompa akış hücresi içine etiketli virüsü (1 / 100 seyreltilmiş). Virüs akış kanalı alt yüzeye yayılır, parçacıklar, çift katlı lipid dahil gangliozid sopa başlayacak. </li><li> Demirledi virüs partikülleri uygun bir yoğunluk (görüş alanı başına yaklaşık 1000 parçacıklar) elde edilmiştir. Mililitre floresein etiketli streptavidin başına iki mikrogram içeren bir çözüm için giriş tüp geçiş yapın. Etiketli streptavidin bilayeri birleştiğinde lipid molekülleri biotin bağlamak ve sonunda loş bir yeşil arka plan görünür olacak. </li><li> Akış kanalı HNE 300 mikrolitre ile yıkayın. </li><li> Bir görüntüleme alanı seçin, mikroskop odak ve CCD kamera zaman lapsed görüntü elde etmek için hazırlar. Pozlama süresi 100 ms ayarlayın ve 10 Hz hızında kare toplamak. </li><li> 10 mM sodyum sitrat ve 140 mM NaCl içeren bir asidik tampon akan füzyon başlatın. Tampon pH test olan virüs kritik pH altında düzenlenmelidir. PH X-31 sigortalar aşağıda 5.5. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1B füzyon öncesi ve sırasında çift katlı demirledi virionlar anlık gösterir. Her kırınım sınırlı nokta ayrı bir virüs parçacık temsil eder. Kırmızı ve yeşil floresan ayrı viral zarf ve içerik etiketleri eş zamanlı gözlem sağlayan bir CCD kamera, üst ve alt yarısı üzerine imaged edilmiştir. Göre yeşil kanal iki kat daha fazla lekeler genellikle vardırkırmızı, ve bu zarf etikete göre içerik boya ile etiketleme düşük verimlilik yansıtır. Floresein bağlı yüzeyden yayılan yeşil arka plan floresan sitrat tampon vardıklarında kaybolur ve füzyon reaksiyonu başlama zamanını belirliyor. Hemifusion olaylar hemifusion sapı boyunca viral zarf yayılır söndürülür Rh110C18 yeşil floresan patlamaları gibi algılanır ve düzlemsel membran seyreltilir. Dışa doğru genişleyen bir floresan bulut düzlemsel membran yağ açil bağlantılı boya difüzyon gösteren, hemifused parçacıkların çevresinde görülebilir. Gözenek oluşumu viral parçacıkların iç içinde sıkışıp SRB kırmızı floresan çürüme olarak görülmektedir. Bir füzyon gözenek açılması, boya, sulu, gözlem bölgenin düzlemsel bilayeri ve dışarı altında uzaya kaçmak için olanak sağlar. Floresans şiddeti her parçacık için yörüngeleri, bireysel parçacıkların entegre şiddetleri çizilen hemifusion ve gözenek oluşumu (Şekil 1C) verim ve saatleri belirlenmesi kolaylaştırmak. Hemifusion ve gözenek oluşumu olay kez Rh110C18 floresan patlama veya SRB sinyal çürümesi maksimum eğim oluştuğu noktası olarak belirlenir. Başarılı bir deneyde, Rh110C18 verim dequenching sinyalleri ve SRB etiketli parçacıkların yüzde 30 ile etiketlenmiş parçacıkların yaklaşık yüzde 50 kullanışlı sinyal verir. Iki boya ile işaretlenmiş parçacıklar, yaklaşık yüzde 10, hem de lipid karıştırma ve gözenek oluşumu sinyalleri göstermektedir. Şekil 2A-C, tipik bir deney hemifusion ve gözenek oluşumu gecikme süreleri dağılım gösterir. Fig.2D-F, aynı koşullar altında yapılan beş deneyler kombine olayların olay dağılımını gösterir. Mütevazı bir gözlem bile, histogramlar şekli açıktır. Her bir deney pH damla zaman algılama ile senkronize olduğundan, birden fazla deneyler kombine edilebilir ve ara adımlar hız sınırlayıcı hakkında ayrıntılı bilgi elde edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="Şekil 1"> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="Şekil 1"> Şekil 1: Deneysel tasarım . A) Virüs parçacıklar hemifusion ve füzyon gözenek oluşumu kinetiği izlemek için iki floresan boya ile etiketlenir. Floresans yüksek NA mikroskop objektif tarafından toplanan ve bir CCD üzerine görüntülenmiş. B) Floresan görüntüleri (sağda) önce (solda) ve sırasında bireysel viral parçacıkların füzyon. Desteklenen bilayeri aynı ~ 50 x 100 mm 2 'lik alanın her resmin üst ve alt yarısında, sırasıyla, kırmızı ve yeşil floresan karşılık. C) kırmızı SRB viral içerik tracer (üst iz) floresan yoğunluğu, yeşil Rh110C18 membran boya (orta eser) ve pH düşmesi, hemifusion ve füzyon arasında geçen floresein pH sensörü (alt iz) kesin kez sağlar. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2"> Şekil 2 floresan etiketli virüs Fusion kinetiği. PH düşüşü ve hemifusion (A, D) ve gözenek oluşumu (B, E) arasında geçen zaman dağılımları. Dağılımları yükselişi ve çürüme birden fazla ara adımları varlığını göstermektedir. Hemifusion ve bireysel tanecikleri için bir füzyon gözenek açılması arasında geçiş katlanarak hız sınırlayıcı tek bir adım öne dağıtılır. Panelleri AC tek bir deney sonuçları göstermektedir. Aynı koşullar altında yapılan beş ayrı deneylerde Panelleri DF derlenmektedir. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalisation+of+Si%2FSiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li>
<li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li>
</ol>

Sıvı ve sürekli desteklenen çift katlı lipit katmanını hazırlanması zor olabilir. Malzeme veya yüzey kusurları kirlenmesine neden olan eser miktarda bilayers, yayılmasını önlemek. Dekstran düzgün bir tabaka dikkatli bir temizlik ve birikimi esastır. Virüs parçacıkları uzun süre görüntüleme floresan etiketleri çamaşır suyu veya inaktif hale gelmesine neden olabilir. Bu tür Foto-hasar ve biyo-görüntüleme ve tek bir molekül alanları bilinir ve genellikle heyecanlı fluorophores reaktif oksijen t...

<table><tbody><tr><td>Corning lam gömme camları, 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS286525</td><td></td></tr><tr><td>Füzyon silika lamlar</td><td>Technical Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boyama rafı</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>(3-glisidoksipropil)trimetoksisilan</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIG5840.1</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran T-500</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 4006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glisero-3-fosfokolin (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2oleoil-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glisero-3-fosfokolin (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-((6-(biotinoyl)amino)heksanoyl)-1,2-diheksadekanoil-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glisero-3-fosf&amp;#8211;tanolamin, trietilamonyum tuzu (biotin-X DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>B1616</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, floresein konjugatı</td><td>Invitrogen</td><td>S-869</td><td></td></tr><tr><td>Sığır beyninden disialogangliosit GD&lt;sub&gt;1a&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2392</td><td></td></tr><tr><td>Mini Ekstrüder</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mikron polikarbonat membran filtreler</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>10 mm tahliye diskleri (membran destekleri)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>230300</td><td></td></tr><tr><td>Sülforodamin b sodyum tuzu</td><td></td><td>S1402</td><td></td></tr><tr><td>Oktadesil rhodamine 110 (Rh110C18)</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Sentez protokolü için bakınız&lt;/em&gt; Floyd &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2008</td></tr><tr><td>PD-10 tuzsuzlaştırma kolonları</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Nikon floresan mikroskobu</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objektifi</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr lazeri</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Pompası</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702213</td><td></td></tr></tbody></table>

tek parçacık düzeyinde viral fusion kinetik Ölçüm yöntemi

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membran füzyon zarflı virüslerin hücre içine girişi sırasında önemli bir adım. Konvansiyonel füzyon deneyleri genellikle zor ilgili moleküler adımları sırası kantitatif analiz yapma, füzyon olayları çok sayıda rapor. Biz, in vitro bir hedef bilayeri aslında bir sıvı desteği ile tek bir virüs parçacıkları eritme kinetiği izlemek için iki renkli floresan tahlil geliştirdik. Grip viral parçacıkların, membran ve kırmızı bir hidrofilik fluorofor viral iç leke leke yeşil bir lipofilik fluorofor ile inkübe edilir. Biz bir akış hücresi dekstran-functionilized cam yüzeyinde bir gangliozid içeren çift katlı lipid mevduat, bir CCD parçacıkların yüzlerce içeren, düzlemsel bilayeri ve görüntü 100 x 100 mikron 2 alan floresan viral parçacıkların inkübe kamera. Görüntüleme hem de kırmızı ve yeşil floresan, biz aynı anda membran boya (yeşil) ve sulu içeriği (kırmızı) parçacıkların davranışlarını izlemek. Füzyon pH altında bir değere pH düşürücü üzerine, partiküllerin membran ile sigorta. Hemifusion, hedef zarının dış broşür ile viral zarının dış broşürün birleştirilmesi, yeşil floresan bir parçacığın ani bir değişim olarak görülebilir. Gözenek kalan iki distal broşür sonraki füzyon üzerine kurulacaktır ve viral partikül kırmızı yayan fluorofor hedef membran altında piyasaya sürülecek. Bu olay bireysel parçacıkların kırmızı floresan bir azalmaya yol açacaktır. Son olarak, hedef membran gömülü olduğu bir pH duyarlı fluorofor entegre floresan pH damla tam zamanı bildirir. Üç floresan-time izleri, tüm önemli olaylar (pH düşmesi, gözenek oluşumu üzerine karıştırma hemifusion, içerik üzerine karıştırma lipid) kolay bir şekilde ve tek tek her parçacık için ayıklanır. Histogramlar birçok bireysel parçacıklar için çeşitli geçişler için geçen süreleri toplayarak, ilgili ara yaşamlarda belirleyebilirsiniz. Doğrudan bir floresan gözlemlenebilir yoksa bile gizli ara bu histogramlar doğrudan görüntülenebilir.

Biz mevcut bir<em&gt; In vitro</em&gt; Iki renkli bir sıvı hedef bilayeri ile tek bir virüs partikülü füzyon görselleştirmek için floresan tahlil. Farklı viral zarı ve iç leke fluorophores viral parçacıkların etiketleme, biz hemifusion ve gözenek oluşumu kinetiği izlemek mümkün.

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membran füzyonu, zarflı virüslerin hücrelere girişi sırasında temel bir adımdır. Konvansiyonel füzyon analizleri tipik olarak çok sayıda füzyon...

Bu analizde kullanılan lamel camlar dekstrin ile fonksiyonelleştirilmiş ve ardından mikroakışkan akış hücrelerine yerleştirilmiştir. Ardından, her bir akış hücresi, hidratye dekstrin üzerinde bir lipid çift tabakası oluşturmak üzere birleşen lipozom süspansiyonu ile inkübe edilir. Floresan mikroskobu altında, fluoro four ile işaretlenmiş virüs ve fluorescein ile işaretlenmiş streptavidin eklenir ve virüsün çift tabakaya bağlanması sağlanır.Asidik tamponun girişi, virüsün çift katmanla füzyonunu başlatır ve bir dijital kamera analiz boyunca floresan değişimlerini kaydeder. Merhaba, ben Daniel Floyd; Harvard Üniversitesi Biyolojik Kimya ve Moleküler Farmakoloji Bölümü'nde Anine Vanian'ın laboratuvarındayım. Bugün sizlere, tek partikül düzeyinde viral füzyon kinetiğini görselleştirmek için kullanılan bir yöntemi göstereceğim.Virüsün konak hücrelere ulaşma yolunu incelemek için laboratuvarda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Protokole, dekstrin ile fonksiyonelleştirilmiş lamelleri hazırlayarak başlayın.İlk adım olarak lameller; %10 deterjan, 1 molar potasyum hidroksit aseton ve %100 etanol çözeltileri içerisinde her bir çözelti için 30 dakika boyunca sonike edilir. İşlemle

method-for-measurement-viral-fusion-kinetics-at-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Kaynak: Esposito, A. M.,et al. High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, hücreden hücreye viral transmisyonu izlemek için kullanılan bir ko-kültür floresan analizini göstermektedir. Analiz, viral membran füzyonunu görselleştirmek ve test bileşiklerinin viral girişi engellemedeki etkinliğini değerlendirmek için kırmızı-yeşil raporlayıcı kaset kullanmaktadır.

Cre-İndüklenebilir Floresan Reporter Kullanılarak Viral Füzyon İnhibitörlerinin Değerlendirilmesi

Kaynak: Zeigler Allen, L., et al. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'. J. Vis. Exp. (2013).Bu video, floresan tabanlı tespit ve hassas partikül sıralama yoluyla karışık popülasyonlardan genom içeren tekil virüslerin akış sitometrisi ile nasıl izole edildiğini ve ardından sonraki genomik karakterizasyon için agaroz gömme işleminin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektedir.

Genomik Analiz İçin Tekil Virüs Partiküllerinin Floresan Tabanlı Ayrıştırılması

Bu video, konakçı hücrelere viral girişin belirli adımlarını ve endozomla füzyonu hedefleyen antiviral ajanları değerlendirmek için bir testi göstermektedir. Hücreler düşük bir sıcaklıkta inkübe edilir ve daha sonra HCV ile enfekte edilir. Düşük sıcaklık, konakçı hücrelere viral bağlanmaya izin verir, ancak endositoz yoluyla içselleştirmeyi engeller. Test antiviral bileşiği eklenir ve hücreler fizyolojik sıcaklıkta inkübe edilir. Daha yüksek bir sıcaklığa bu geçiş, viral girişi kolaylaştırır ve...

Test Bileşiklerinin Konakçı Hücrelerde Viral Giriş ve Füzyon Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek İçin Bir Test

Bu yöntem, Rift Valley vebası virüsü (RVFV) suşu, MP-12 ile enfeksiyon sonrası konakçı hücre transkripsiyon değişiklikleri ölçmek tıkırtı kimya kullanımı açıklanmaktadır. Sonuçlar floresan mikroskobu ile nitel görüntülendi veya akım sitometri ile kantitatif elde edilebilir. Bu yöntem, diğer virüs ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Arenavirüs yaşam döngüsünün ilk adımı, viral partiküllerin konak hücrelere bağlanmasıdır. Arenavirüs bağlanma olaylarının ultra hassas tespiti ve kantitasyonu için kantitatif (q) RT-PCR tabanlı bir test sunuyoruz.

Arenavirüs hücre Ek Ölçümü için son derece hassas Deneyi

Biz Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı readouts kullanarak protein etkileşimleri tahlil için otomatik floresans ömrü görüntüleme (Flim) kullanan açık kaynak kodlu bir yüksek içerik analizi (HCA) aleti sunuyoruz. Bu openFLIM-HCA cihaz için veri toplama yazılımı μManager yazılır ve veri analizi FLIMfit üstlenilmiştir tarafından kontrol edilir.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

Burada, anjiyotensin dönüştürücü enzim-2'ye bağlı manyetik mikroküreler tarafından yakalanan sağlam şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) viral partikülleri üzerinde iki benzersiz spike protein epitopunu aynı anda tespit etmek için çift raportörlü bir akış sitometrik sistemi kullanan yeni geliştirilmiş bir multipleks floresan immünolojik testi açıklıyoruz.

Viral Partiküller Üzerindeki Yüzey Protein Epitoplarının Multipleks Çift Raportör Stratejisi ile Profillenmesi

Öğrenin tek parçacık düzeyinde viral füzyon kinetiğini iki renkli floresans mikroskobu ile görselleştirmeyi. Bu yöntem hemifüzyon ve gözenek oluşumunu gerçek zamanlı izleyerek viral giriş mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Daha fazla video keşfet