Name: Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Öğrenin tek parçacık düzeyinde viral füzyon kinetiğini iki renkli floresans mikroskobu ile görselleştirmeyi. Bu yöntem hemifüzyon ve gözenek oluşumunu gerçek zamanlı izleyerek viral giriş mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH hibe AI57159 (SCH) ve AI72346 (AMvO) tarafından desteklenmiştir. SCH Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırmacı.

Cam kapak kayma işlevsellik Füzyon tayininde kullanılan düzlemsel bilayeri dekstran sulu film desteklenmektedir. Dekstran düzlemsel bilayeri ve cam yüzeyi arasında boşluk gibi davranır. Bu cam yüzey takılıp haline membran bileşenleri önler ve aynı zamanda bir virüs parçacık içeriği füzyon üzerine kaçmak için yer sağlar. Cam lamelleri bize kimyasal bağ dekstran cam (Elender, ve ark 1996) sağlar silan epoksi ile tedavi yoluyla Fonksiyonlu. <ol><li> Seramik boyama raf 25 mm lamelleri düzenleyin ve bir kavanoz veya behere rafa yerleştirin. </li><li> Konteyner% 10 laboratuvar notu züccaciye deterjan solüsyonu ile doldurun. 30 dakika boyunca ultrasonik temiz kap yerleştirin. </li><li> Deiyonize su ile, konteyner ve kapak rafı ve dolum 1M postassium hidroksit ile durulayın. Başka bir 30 dakika banyo sonikatör konteyner dönün. </li><li> Aseton ve etanol kullanılarak bu temizlik işlemi tekrarlayın. </li><li> Su ve kuru coverlips durulayın. </li><li> Son olarak, üç dakikada bir oksijen plazma striptizci lamelleri temizleyin. </li><li> Son temizlik adım, cam aşağıdaki silanization adımları düzgün hidrofilik ve reaktif, yüzey oksitler. </li><li> Isopropanol 3-glycidoxypropyltrimethoxy silan% 0.2 solüsyon hazırlayın. Beş dakika için bu çözüm lamelleri bırakın. </li><li> Silan çözüm atın ve isopropanol lamelleri birkaç kez yıkayın. </li><li> Lamelleri silan bir tabaka ile kaplıdır, ancak cam kovalent bağ silan izin tedavi edilmelidir. Bir saat boyunca 80 santigrat dereceye ayarlanmış fırında lamelleri yerleştirin. </li><li> Lamelleri kuruyan, dekstran 500 tartmak ve% 30 w / v çözeltisi hazırlamak. Su Ön ısıtma çözülme yardımcı olacaktır. Biz, lamel başına bu çözüm yaklaşık 1 ml kullanabilirsiniz. Dekstran çözünmüş sonra, bir vakum desikatörde çözüm defoam. </li><li> Silanlanmış lamelleri kür bitirdiğinizde, seramik rafa kaldırmak ve onları plastik bir dondurucu kutusunun içine düz düzenlemek. Dekstran çözüm ~ 1 ml her lamel üst yüzeyi kapsayacak şekilde 1 ml pipet kullanın. Dondurucu kutusunu kapatın ve 24-36 saat boyunca sessiz bir yerde bekletin. </li><li> Plastik forseps ile lamelleri açgözlü, aşırı dekstran seramik rafın içine dökün ve bunların yerine. Lamelleri su birkaç kez durulayın ve lamelleri 48 saat süreyle su ile ıslatın. Kavanozu hafifçe bir masa üstü rotator ajite olabilir. </li><li> 80 santigrat derece ve bir vakum desikatörde saklayın ayarlanmış fırında lamelleri kurulayın. </li></ol> Lipozom Hazırlık Desteklenen çift katlı lipit katmanını dekstran Fonksiyonlu lamel lipozomlar adsorblama oluşur. Zar yırtıkları ve düz bir yüzey üzerinde yayılır kadar birbirleri ile adsorbe lipozomlar sigorta. <ol><li> Tayininde kullanılan tipik bir lipozom formülasyonu 1,2 oluşur, dioleoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin (DOPC), 1-oleoyl-2-Palmitoyl-sn-Glycéro-3-Phosphocholin (POPC), kolesterol, sığır beyin Disialoganglioside (GD 1a) ve N-((6 - (biotinoyl) amino) hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-Glycéro-3-phosphoethanolamine 4:4:2:0.1:5 x10 -5 'lik bir oran. Tüm bileşenleri kloroform veya kloroform ve metanol çözümleri saklanır. </li><li> Bir cam tüpe aktararak her bir bileşenin hacimleri iki mikromolden lipid içeren bir karışım hazırlayın. Argon veya azot gazı akışı altında çözücü buharlaşır. Iki saat için bir vakum desikatörde test tüpü bırakarak kalan solvent çıkarın. </li><li> HNE tampon 400 mikrolitre (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) kurutulmuş lipid filmi tekrar </li><li> Süspansiyon, plastik bir mikrosantrifüj tüp aktarın. Sıvı azot banyo ve sıcak su banyosu bir çözülme içinde süspansiyon dondurun. Bu donma / çözülme döngüsü dört kez tekrarlayın. </li><li> 100 nm polikarbonat membran filtre ile lipid ekstruder birleştirin ve lipid süspansiyon 25 kez a'ya. Ekstrüzyon sonra daha şeffaf olması için süspansiyon görünmelidir. </li><li> Lipozomlar hazırlanır gün kullanılmalıdır. Kullanılıncaya kadar oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol> Mikroakışkan akışı hücre hazırlığı Mikroakışkan basit bir akış hücresi, bir kuvars slayt ve Fonksiyonlu lamel arasında çift kaset sopa sandviç tarafından yapılır. <ol><li> 20x20x3 mm kuvars slayt alın. Karşı tarafta iki adet 1 mm delik bir elmas tur kullanın. </li><li> Çift kaset sopa bir levha 20 mm kare kesilmiş ve bir jilet kullanarak merkezine 15 x 2 mm bölümü kesip. </li><li> Bir tarafı, teyp yedekleme ve litre bant uymak soyunz slayt. Fonksiyonlu lamel diğer tarafında uyun. </li><li> Polietilen boru, iki adet 20 cm uzunlukta kesin ve kuvars slayt deliklerin içine yerleştirin. </li><li> 5 dakikalık epoksi yapıştırıcı ile akış hücresi Seal. </li><li> tamponu ile tutkal tedavi, asal akış hücresi ve tüp. </li><li> Desteklenen bir çift katlı lipid kanallar içine lipozom süspansiyon yaklaşık 80 mikrolitre çizerek, bu aşamada oluşturulabilir. </li></ol> Virüs parçacık etiketleme <ol><li> H3N2 influenza A (X-31) tipik füzyon tayini için kullanılan, ancak, diğer grip suşlarının ve diğer virüsleri başarılı bir şekilde kullanılmıştır. </li><li> Virüs hemifusion ve gözenek oluşumu tespit izin vermek için iki farklı floresan boyalar ile etiketlenir. </li><li> 20 mM bir çözüm yapmak için HNE tampon sulforhodamine b (SRB) eritin. 10 mikrolitre viral süspansiyon ile boya çözüm 20 mikrolitre birleştirin ve oda sıcaklığında 20 saat bırakın. Bu dönemde, boya yavaş yavaş virüs parçacıkları birikebilir. </li><li> PD-10 tuzsuzlaştırma sütun aracılığıyla virüs süspansiyon geçerek aşırı boya çıkarın. Yeterli viral malzeme kullanılması durumunda, renkli bir bant sütununda görülebilir. Bu band etiketli virüs içerir ve yıkandı, olarak toplanabilir. </li><li> Hiçbir grubun görünmüyorsa, 200 mikrolitrelik kesirleri toplamak ve bir spektrofotometre ile 565 nm emme ölçerek virüs etiketli içeren fraksiyonları belirlemek. Toplam hacminin yaklaşık 0.8 ml virüs Zehir gerekir. </li><li> SRB etiketli virüs süspansiyonu 13 mikrolitre octadecyl rodamin 110 (Rh110C18) 2 mM dimetil formamid (DMF) çözümü ekleyerek viral zarf etiketleyin. </li><li> Süspansiyon bir laboratuvar rotator tüp ekleyerek karıştırın ve 3 saat bekletin. </li><li> Daha önce de açıklandığı gibi, PD-10 tuzsuzlaştırma sütun kullanarak aşırı Rh110C18 virüs arındırın. </li></ol> Mikroskop yapılandırma Deney, toplam iç yansıma floresan mikroskopi için uygun bir yüksek NA immersiyon yağı amacı ile donatılmış bir floresan mikroskop yapılır. Argon / kripton gaz lazer 488 ve 568 nm hatları Rh110C18 ve SRB etiketli virüs heyecanlandırmak için kullanılır. Her etiket eş zamanlı görüntüleme bölme dikroik bir ayna ile yeşil ve kırmızı floresan emisyon tarafından gerçekleştirilir ve görüntüleri bağımsız ayrı bir elektron çarparak CCD kamera yarısı üzerine duruluyor. Deneyin yapılması Etiketli virüs parçacıkları, floresein ile yüzey kaplama ve düşük pH tampon (Şekil 1A) ile reaksiyon başlangıcında yerleştirme, füzyon testinin Yürütme akışı hücre içinde biyokimyasal bileşenlerin aşamalı montaj içerir düzlemsel çift katlı lipid montaj: . <ol><li> Mikroskop sahneye akış hücre Dağı ve dakikada 40 mikrolitre hızında akış bir şırınga pompa çıkış boru takın. </li><li> HNE 300 mikrolitre akan aşırı lipozomlar akış kanalları temizleyin. </li><li> Mikroskop Focus ve 488 nm ışık ve 568 nm ışık 70 W / cm 2 350 W / cm 2 yüzey aydınlatmak için lazer gücünü ayarlamak. 1.45 NA 60x immersiyon yağı hedefi kullanıyorsanız, sırasıyla, lazer yoğunlukları mikro 100 Watt ve 20 Watt mikro ayarlayabilirsiniz. </li><li> Pompa akış hücresi içine etiketli virüsü (1 / 100 seyreltilmiş). Virüs akış kanalı alt yüzeye yayılır, parçacıklar, çift katlı lipid dahil gangliozid sopa başlayacak. </li><li> Demirledi virüs partikülleri uygun bir yoğunluk (görüş alanı başına yaklaşık 1000 parçacıklar) elde edilmiştir. Mililitre floresein etiketli streptavidin başına iki mikrogram içeren bir çözüm için giriş tüp geçiş yapın. Etiketli streptavidin bilayeri birleştiğinde lipid molekülleri biotin bağlamak ve sonunda loş bir yeşil arka plan görünür olacak. </li><li> Akış kanalı HNE 300 mikrolitre ile yıkayın. </li><li> Bir görüntüleme alanı seçin, mikroskop odak ve CCD kamera zaman lapsed görüntü elde etmek için hazırlar. Pozlama süresi 100 ms ayarlayın ve 10 Hz hızında kare toplamak. </li><li> 10 mM sodyum sitrat ve 140 mM NaCl içeren bir asidik tampon akan füzyon başlatın. Tampon pH test olan virüs kritik pH altında düzenlenmelidir. PH X-31 sigortalar aşağıda 5.5. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1B füzyon öncesi ve sırasında çift katlı demirledi virionlar anlık gösterir. Her kırınım sınırlı nokta ayrı bir virüs parçacık temsil eder. Kırmızı ve yeşil floresan ayrı viral zarf ve içerik etiketleri eş zamanlı gözlem sağlayan bir CCD kamera, üst ve alt yarısı üzerine imaged edilmiştir. Göre yeşil kanal iki kat daha fazla lekeler genellikle vardırkırmızı, ve bu zarf etikete göre içerik boya ile etiketleme düşük verimlilik yansıtır. Floresein bağlı yüzeyden yayılan yeşil arka plan floresan sitrat tampon vardıklarında kaybolur ve füzyon reaksiyonu başlama zamanını belirliyor. Hemifusion olaylar hemifusion sapı boyunca viral zarf yayılır söndürülür Rh110C18 yeşil floresan patlamaları gibi algılanır ve düzlemsel membran seyreltilir. Dışa doğru genişleyen bir floresan bulut düzlemsel membran yağ açil bağlantılı boya difüzyon gösteren, hemifused parçacıkların çevresinde görülebilir. Gözenek oluşumu viral parçacıkların iç içinde sıkışıp SRB kırmızı floresan çürüme olarak görülmektedir. Bir füzyon gözenek açılması, boya, sulu, gözlem bölgenin düzlemsel bilayeri ve dışarı altında uzaya kaçmak için olanak sağlar. Floresans şiddeti her parçacık için yörüngeleri, bireysel parçacıkların entegre şiddetleri çizilen hemifusion ve gözenek oluşumu (Şekil 1C) verim ve saatleri belirlenmesi kolaylaştırmak. Hemifusion ve gözenek oluşumu olay kez Rh110C18 floresan patlama veya SRB sinyal çürümesi maksimum eğim oluştuğu noktası olarak belirlenir. Başarılı bir deneyde, Rh110C18 verim dequenching sinyalleri ve SRB etiketli parçacıkların yüzde 30 ile etiketlenmiş parçacıkların yaklaşık yüzde 50 kullanışlı sinyal verir. Iki boya ile işaretlenmiş parçacıklar, yaklaşık yüzde 10, hem de lipid karıştırma ve gözenek oluşumu sinyalleri göstermektedir. Şekil 2A-C, tipik bir deney hemifusion ve gözenek oluşumu gecikme süreleri dağılım gösterir. Fig.2D-F, aynı koşullar altında yapılan beş deneyler kombine olayların olay dağılımını gösterir. Mütevazı bir gözlem bile, histogramlar şekli açıktır. Her bir deney pH damla zaman algılama ile senkronize olduğundan, birden fazla deneyler kombine edilebilir ve ara adımlar hız sınırlayıcı hakkında ayrıntılı bilgi elde edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="Şekil 1"> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="Şekil 1"> Şekil 1: Deneysel tasarım . A) Virüs parçacıklar hemifusion ve füzyon gözenek oluşumu kinetiği izlemek için iki floresan boya ile etiketlenir. Floresans yüksek NA mikroskop objektif tarafından toplanan ve bir CCD üzerine görüntülenmiş. B) Floresan görüntüleri (sağda) önce (solda) ve sırasında bireysel viral parçacıkların füzyon. Desteklenen bilayeri aynı ~ 50 x 100 mm 2 'lik alanın her resmin üst ve alt yarısında, sırasıyla, kırmızı ve yeşil floresan karşılık. C) kırmızı SRB viral içerik tracer (üst iz) floresan yoğunluğu, yeşil Rh110C18 membran boya (orta eser) ve pH düşmesi, hemifusion ve füzyon arasında geçen floresein pH sensörü (alt iz) kesin kez sağlar. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2"> Şekil 2 floresan etiketli virüs Fusion kinetiği. PH düşüşü ve hemifusion (A, D) ve gözenek oluşumu (B, E) arasında geçen zaman dağılımları. Dağılımları yükselişi ve çürüme birden fazla ara adımları varlığını göstermektedir. Hemifusion ve bireysel tanecikleri için bir füzyon gözenek açılması arasında geçiş katlanarak hız sınırlayıcı tek bir adım öne dağıtılır. Panelleri AC tek bir deney sonuçları göstermektedir. Aynı koşullar altında yapılan beş ayrı deneylerde Panelleri DF derlenmektedir. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalisation+of+Si%2FSiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li>
<li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li>
</ol>

Sıvı ve sürekli desteklenen çift katlı lipit katmanını hazırlanması zor olabilir. Malzeme veya yüzey kusurları kirlenmesine neden olan eser miktarda bilayers, yayılmasını önlemek. Dekstran düzgün bir tabaka dikkatli bir temizlik ve birikimi esastır. Virüs parçacıkları uzun süre görüntüleme floresan etiketleri çamaşır suyu veya inaktif hale gelmesine neden olabilir. Bu tür Foto-hasar ve biyo-görüntüleme ve tek bir molekül alanları bilinir ve genellikle heyecanlı fluorophores reaktif oksijen t...

<table><tbody><tr><td>Corning lam gömme camları, 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS286525</td><td></td></tr><tr><td>Füzyon silika lamlar</td><td>Technical Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boyama rafı</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>(3-glisidoksipropil)trimetoksisilan</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIG5840.1</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran T-500</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 4006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glisero-3-fosfokolin (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2oleoil-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glisero-3-fosfokolin (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-((6-(biotinoyl)amino)heksanoyl)-1,2-diheksadekanoil-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glisero-3-fosf&amp;#8211;tanolamin, trietilamonyum tuzu (biotin-X DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>B1616</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, floresein konjugatı</td><td>Invitrogen</td><td>S-869</td><td></td></tr><tr><td>Sığır beyninden disialogangliosit GD&lt;sub&gt;1a&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2392</td><td></td></tr><tr><td>Mini Ekstrüder</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mikron polikarbonat membran filtreler</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>10 mm tahliye diskleri (membran destekleri)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>230300</td><td></td></tr><tr><td>Sülforodamin b sodyum tuzu</td><td></td><td>S1402</td><td></td></tr><tr><td>Oktadesil rhodamine 110 (Rh110C18)</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Sentez protokolü için bakınız&lt;/em&gt; Floyd &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2008</td></tr><tr><td>PD-10 tuzsuzlaştırma kolonları</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Nikon floresan mikroskobu</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objektifi</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr lazeri</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Pompası</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702213</td><td></td></tr></tbody></table>

tek parçacık düzeyinde viral fusion kinetik Ölçüm yöntemi

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membran füzyon zarflı virüslerin hücre içine girişi sırasında önemli bir adım. Konvansiyonel füzyon deneyleri genellikle zor ilgili moleküler adımları sırası kantitatif analiz yapma, füzyon olayları çok sayıda rapor. Biz, in vitro bir hedef bilayeri aslında bir sıvı desteği ile tek bir virüs parçacıkları eritme kinetiği izlemek için iki renkli floresan tahlil geliştirdik. Grip viral parçacıkların, membran ve kırmızı bir hidrofilik fluorofor viral iç leke leke yeşil bir lipofilik fluorofor ile inkübe edilir. Biz bir akış hücresi dekstran-functionilized cam yüzeyinde bir gangliozid içeren çift katlı lipid mevduat, bir CCD parçacıkların yüzlerce içeren, düzlemsel bilayeri ve görüntü 100 x 100 mikron 2 alan floresan viral parçacıkların inkübe kamera. Görüntüleme hem de kırmızı ve yeşil floresan, biz aynı anda membran boya (yeşil) ve sulu içeriği (kırmızı) parçacıkların davranışlarını izlemek. Füzyon pH altında bir değere pH düşürücü üzerine, partiküllerin membran ile sigorta. Hemifusion, hedef zarının dış broşür ile viral zarının dış broşürün birleştirilmesi, yeşil floresan bir parçacığın ani bir değişim olarak görülebilir. Gözenek kalan iki distal broşür sonraki füzyon üzerine kurulacaktır ve viral partikül kırmızı yayan fluorofor hedef membran altında piyasaya sürülecek. Bu olay bireysel parçacıkların kırmızı floresan bir azalmaya yol açacaktır. Son olarak, hedef membran gömülü olduğu bir pH duyarlı fluorofor entegre floresan pH damla tam zamanı bildirir. Üç floresan-time izleri, tüm önemli olaylar (pH düşmesi, gözenek oluşumu üzerine karıştırma hemifusion, içerik üzerine karıştırma lipid) kolay bir şekilde ve tek tek her parçacık için ayıklanır. Histogramlar birçok bireysel parçacıklar için çeşitli geçişler için geçen süreleri toplayarak, ilgili ara yaşamlarda belirleyebilirsiniz. Doğrudan bir floresan gözlemlenebilir yoksa bile gizli ara bu histogramlar doğrudan görüntülenebilir.

Biz mevcut bir<em&gt; In vitro</em&gt; Iki renkli bir sıvı hedef bilayeri ile tek bir virüs partikülü füzyon görselleştirmek için floresan tahlil. Farklı viral zarı ve iç leke fluorophores viral parçacıkların etiketleme, biz hemifusion ve gözenek oluşumu kinetiği izlemek mümkün.

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membran füzyonu, zarflı virüslerin hücrelere girişi sırasında temel bir adımdır. Konvansiyonel füzyon analizleri tipik olarak çok sayıda füzyon...

Bu analizde kullanılan lamel camlar dekstrin ile fonksiyonelleştirilmiş ve ardından mikroakışkan akış hücrelerine yerleştirilmiştir. Ardından, her bir akış hücresi, hidratye dekstrin üzerinde bir lipid çift tabakası oluşturmak üzere birleşen lipozom süspansiyonu ile inkübe edilir. Floresan mikroskobu altında, fluoro four ile işaretlenmiş virüs ve fluorescein ile işaretlenmiş streptavidin eklenir ve virüsün çift tabakaya bağlanması sağlanır.Asidik tamponun girişi, virüsün çift katmanla füzyonunu başlatır ve bir dijital kamera analiz boyunca floresan değişimlerini kaydeder. Merhaba, ben Daniel Floyd; Harvard Üniversitesi Biyolojik Kimya ve Moleküler Farmakoloji Bölümü'nde Anine Vanian'ın laboratuvarındayım. Bugün sizlere, tek partikül düzeyinde viral füzyon kinetiğini görselleştirmek için kullanılan bir yöntemi göstereceğim.Virüsün konak hücrelere ulaşma yolunu incelemek için laboratuvarda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Protokole, dekstrin ile fonksiyonelleştirilmiş lamelleri hazırlayarak başlayın.İlk adım olarak lameller; %10 deterjan, 1 molar potasyum hidroksit aseton ve %100 etanol çözeltileri içerisinde her bir çözelti için 30 dakika boyunca sonike edilir. İşlemler arasında deiyonize su ile durulama yapılır. Son sonikasyon işleminin ardından lameller su ile durulanır ve ardından 80 °C'deki inkübatörde kurutulur.Ardından, lamel camlarını üç dakika boyunca oksijen plazma temizleyiciye yerleştirin. Bu adım lamların yüzeyini oksitleyerek camın tekdüze şekilde hidrofilik olmasını sağlar ve sonraki silanizasyon adımları için reaktif hale getirir. Sonraki aşamada, lamel camlarını izopropanol içerisinde %0,2'lik taze bir gliksil oksipropil trimetoksisilan çözeltisine daldırın ve beş dakika boyunca inkübe edin.Ardından lamelleri birkaç kez izopropanol ile durulayın. Slan kaplı lamelleri bir saat boyunca 80 °C'de bekletin. Bu kürleme adımı, slan'ın cama kovalent olarak bağlanmasını sağlar.Sertleştirme işleminden sonra, lamel camlarını plastik bir dondurucu kutusunun içine düz bir şekilde yerleştirin. Her bir lamel camının üst yüzeyini, suda ağırlıkça hacimce %30'luk bir dekstrin çözeltisinin yaklaşık bir mililitresi ile kaplayın.Dondurucu kutusunu kapatın ve lamelleri 24 ila 36 saat boyunca sakin bir yerde bekletin. Ertesi gün, lamelleri plastik pensetle tutarak fazla dekstrini dökün ve lamelleri tekrar seramik rafa yerleştirin. Lamelleri birkaç kez suyla durulayın ve 48 saat boyunca suda bekletin.Kap, masaüstü bir rotator üzerinde hafifçe karıştırılabilir; lamel camlar 80 °C'ye ayarlanmış bir fırında kurutulmalı ve bir sonraki adıma hazır olana kadar vakumlu bir desikatörde saklanmalıdır. Planer bir çift katman oluşturmak için lamel camların lipozom karışımı ile kaplanması işlemi gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, lipid çift katmanını oluşturmak için lipozomları hazırlamaktır; çeker ocak altında, kloroformda çözünmüş tüm lipidleri cam bir deney tüpünde birleştirin.Lipozom formülasyonu, virüs partiküllerine bağlanan dia ganglia yan zincirini ve streptavidin konjugatlı pH indikatörü floreseine bağlanan biyotinize bir lipidi içerir. Ardından, çözücüyü argon veya azot gazı akımı altında uçurun. Kalan çözücüyü gidermek için test tüpünü iki saat boyunca vakumlu bir desikatörde bekletin.Kurutulmuş lipid filmini 400 µL HNE tamponu içinde tekrar süspanse edin. Ardından süspansiyonu plastik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Süspansiyonu sıvı azot banyosunda dondurun ve sıcak su banyosunda çözdürün.Dondurma-çözme döngülerinden sonra, bu dondurma-çözme döngüsünü dört kez tekrarlayın. Lipid süspansiyonunu ekstrüde etmek için 100 nanometre membran filtre takılmış bir lipid ekstrüderi kullanın. Ekstrüzyondan sonra, süspansiyonun 25 kez daha şeffaf görünmesi gerekir.Lipozomları oda sıcaklığında saklayın ve hazırladığınız gün kullanın. Lipidler hazır olduğuna göre, mikroakışkan akış hücresini hazırlayın. Öncelikle, 20 x 20 x 3 mm boyutlarında bir kuvars lam alarak elmas freze ile karşıt taraflara iki adet 1 mm çapında delik açın.Çift taraflı bant tabakasından bir jilet yardımıyla 20 milimetre boyutlarında bir kare kesin. Merkezinden 15 x 2 milimetrelik bir bölümü çıkarın. Bandın bir tarafının koruyucu katmanını soyun ve bandı lam üzerine yapıştırın.Diğer tarafı, şimdi 20 santimetre uzunluğunda kesilmiş polietilen tüplerle fonksiyonelleştirilmiş bir kapatma lamına yapıştırın ve bunları kuvars lamdaki deliklere yerleştirin. Son olarak, akış hücresini beş dakikalık epoksi yapıştırıcı ile sızdırmaz hale getirin. Kuvars lamı kapatma lamına bağlamak için yapıştırıcıyı kuvars lamın kenarlarına yayın.Boru ile kuvars lam arasındaki bağlantıyı sızdırmaz hale getirmek için iki damla daha yapıştırıcı kullanın. Yapıştırıcı kürlendikten sonra, akış hücresini ve boruları HNE tamponu ile hazırlayın. Ardından, destekli lipid çift tabakasını oluşturmak için, ekstrüde edilmiş lipozom süspansiyonunu alın ve füzyon deneyinden bir gün önce kanallara yaklaşık 80 µL çekin.Viral iç kısmı kırmızıya boyamak için virüs partiküllerinin etiketlenmesine başlayın. Yeni hazırlanmış 20 µL sülforubin veya SRB çözeltisini 10 µL viral süspansiyonla birleştirin ve oda sıcaklığında 20 saat bekletin. Ertesi gün, virüs süspansiyonunu bir PD 10 tuzsuzlaştırma kolonundan geçirip 800 µL HNE tamponu ile seyrelterek fazla boyayı uzaklaştırın.Kolonda, işaretli virüsü içeren belirgin renkli bir bant bulunmalıdır. Bir sonraki elüsyon adımında bu fraksiyonu toplayın, SRB ile işaretlenmiş viral süspansiyona 13 µL Octa decal, RUMINE one 10 veya RH one 10 C 18 ekleyerek viral zarfı yeşile boyayın. Tüpü bir laboratuvar rotatörüne takarak süspansiyonu karıştırın ve üç saat boyunca bekletin.Ardından, fazla RH one 10 C 18'i bir PD 10 tuzsuzlaştırma kolonu kullanarak uzaklaştırın. Daha önce olduğu gibi, virüs artık füzyon analizi için hazırdır. Füzyon kinetiği analizini, yüksek sayısal açıklıklı yağ daldırma objektifli bir floresan mikroskobu kullanarak gerçekleştirin.Bir Argonne kripton lazeri, viral membran ve iç kısımdaki floroforları uyarır. Ardından dikroik bir ayna, kırmızı ve yeşil floresan emisyonlarını ayırarak görüntüleri, bir elektron çarpanlı CCD veya şarj coupled device kamera sensörünün ayrı yarılarına bağımsız olarak odaklar. Lamelini mikroskop tablasına yerleştirin ve çıkış borusunu, dakikada 100 µL akış hızına ayarlanmış bir şırınga pompasına bağlayın.300 microliters HNE akıtarak akış kanallarındaki fazla liposomları temizleyin. Mikroskobu odaklayın ve kırmızı floroforu uyarmak için yüzeyi 350 watts/cm² 488 nanometer ışıkla, yeşil floroforu uyarmak için ise 70 watts/cm² 568 nanometer ışıkla aydınlatacak şekilde lazer gücünü ayarlayın. Mikroskop hazır olduğunda, bir ila yüze seyreltilmiş işaretli virüsü akış hücresine pompalayın.Virüs akış kanalının alt yüzeyine difüze oldukça partiküller kenetlenmeye başlar. Lamellerin içine yerleştirilmiş düzlemsel çift katmanın DIA ganglion tarafına tutunurlar. Kenetlenen partiküllerin yoğunluğu görüş alanı başına yaklaşık birkaç yüz partiküle ulaştığında, mililitrede iki mikrogramlık bir çözeltinin akışına başlayın.İşaretli streptavidin, çift katmanlı yapıdaki biyotine bağlı lipid moleküllere bağlandığında pH'a duyarlı bir florofor olan floresein işaretli streptavidin kullanılır. Hafif yeşil bir arka plan tekrar belirdiğinde, akış kanalını 300 µL HNE ile yıkayın. Virüsler kenetlendiğine ve çift katman yüzeyi floresein ile kaplandığına göre, analize başlama zamanı gelmiştir.Bir görüntüleme alanı seçin, mikroskobu odaklayın ve CCD kamerayı zaman ayarlı görüntüleme için hazırlayın. Pozlama süresini 100 milisaniye olarak ayarlayın ve kareleri 10 hertz hızında toplayın. Asidik bir sodyum sitrat tamponu akıtarak virüs membran füzyonunu başlatın.pH düştükçe, floresein floresansı sönerek asitlenmenin gerçekleştiği anı belirler. CCD kamera, analiz boyunca verileri kaydeder ve bu veriler, CCD kamera tarafından belgelendiği üzere hemi füzyon ve gözenek oluşum zamanını belirlemek için kullanılabilir. pH düşüşünden sonra, viral ve planar membranlar kaynaştığında, lipidler karıştığında ve viral zarftaki yeşil boya planar membran içinde seyreldiğinde yeşil floresans patlamaları meydana gelir.Buna karşılık, viral ve lipid membranların, viral iç kısımdaki kırmızı boyanın düzlemsel çift tabakanın altındaki sulu alana kaçarak görüş alanının dışına çıkmasına izin veren gözenekler oluşturması nedeniyle, pH düşüşünden sonra kırmızı floresansta bir azalma görülür; bu eğilimler, füzyon öncesi ve sırasındaki floresan anlık görüntülerle de görselleştirilebilir. Ayrıca, bu örnekte gösterildiği gibi her bir partikül için floresans yoğunluğu seyirlerini grafiğe dökün; hemi füzyon, yeşil floresans yoğunluğunun eğiminin en dik olduğu nokta, gözenek oluşumu ise kırmızı floresans azalmasının gerçekleştiği nokta olarak tanımlanır. Farklı deneylerden gelen verileri senkronize etmek için pH düşüş zamanını t eşittir sıfır olarak kullanarak, burada gösterildiği gibi hemi füzyon ve gözenek oluşumu gecikme sürelerinin histogramlarını oluşturmak üzere birden fazla deneyden gelen verileri birleştirin.Sizlere tek partikül düzeyinde viral füzyon kinetiğinin nasıl ölçüleceğini göstermiş oldum. Bu prosedürü uygularken, homojen ve akışkan bir çift katman elde etmek için temiz lameller kullandığınızdan emin olun.Ayrıca, fotooturşulama hasarını en aza indirebilmek için floresan görüntüleme sırasında kullandığınız ışık miktarını minimumda tutmaya çalışın. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

method-for-measurement-viral-fusion-kinetics-at-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek Virüs Genomik (SVG) tek Virons en genom izole etmek ve yükseltmek için bir yöntemdir. Karışık malzeme grubuyla viral süspansiyonları böylece virion yakalama ve alt işleme sırasında genom kesme azaltarak, agaroz içeren ayrık kuyu ile bir mikroskop lamı üzerine akım sitometri kullanılarak sıralanır. Tüm genom amplifikasyonu sekanslama için uygun olan genomik malzeme ile sonuçlanan birden fazla yer değiştirme amplifikasyonu (MDA) kullanılarak elde edilir.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Source: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp. (2017)The video demonstrates a protocol for monitoring the heat-induced aggregation of virus-like particles using dynamic light scattering (DLS). It begins with preparing a monodisperse suspension of purified particles. The sample is then loaded into a preheated DLS instrument. As the capsid proteins denature with heat, exposed hydrophobic regions cause particle...

Tracking Aggregation of Virus-Like Particles Using Dynamic Light Scattering

Bu video, konakçı hücrelere viral girişin belirli adımlarını ve endozomla füzyonu hedefleyen antiviral ajanları değerlendirmek için bir testi göstermektedir. Hücreler düşük bir sıcaklıkta inkübe edilir ve daha sonra HCV ile enfekte edilir. Düşük sıcaklık, konakçı hücrelere viral bağlanmaya izin verir, ancak endositoz yoluyla içselleştirmeyi engeller. Test antiviral bileşiği eklenir ve hücreler fizyolojik sıcaklıkta inkübe edilir. Daha yüksek bir sıcaklığa bu geçiş, viral girişi kolaylaştırır ve...

Test Bileşiklerinin Konakçı Hücrelerde Viral Giriş ve Füzyon Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek İçin Bir Test

Bu yöntem, Rift Valley vebası virüsü (RVFV) suşu, MP-12 ile enfeksiyon sonrası konakçı hücre transkripsiyon değişiklikleri ölçmek tıkırtı kimya kullanımı açıklanmaktadır. Sonuçlar floresan mikroskobu ile nitel görüntülendi veya akım sitometri ile kantitatif elde edilebilir. Bu yöntem, diğer virüs ile kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Virionların yüzeye bağlanması, Süper çözünürlüklü floresan görüntüleme veya atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) ile tek virion görüntüleme için bir gerekliliktir. Burada, VIRIONların AFM ve süper çözünürlüklü floresan görüntülemede kullanıma uygun cam yüzeylere kontrollü yapışıklık için örnek bir hazırlama yöntemi gösteriyoruz.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

İnfluenza A virüsünün A549 hücrelerine bağlanmasını ve ayrıca virüs partiküllerinin akış sitometrisi ile hedef hücrelere içselleştirilmesini ölçmek için yarı kantitatif bir yöntemi tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Akış Sitometrisi ile A549 Hücreleri Eklenti ve içselleştirilmesi Gribi bir virüs Ölçme

Arenavirüs yaşam döngüsünün ilk adımı, viral partiküllerin konak hücrelere bağlanmasıdır. Arenavirüs bağlanma olaylarının ultra hassas tespiti ve kantitasyonu için kantitatif (q) RT-PCR tabanlı bir test sunuyoruz.

Arenavirüs hücre Ek Ölçümü için son derece hassas Deneyi

Viral genom amplifikasyon kullanan rutin algılama yöntemleri bulaşıcı olmayan parçacıklar bulaşıcı ayırımcılık için kendi yetersizlik tarafından sınırlıdır. Bu makalenin amacı, aptamer bağlama, dinamik ışık saçılma ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak bulaşıcı norovirus parçacıkların ayrımcılık yardım etmek alternatif yöntemler detaylı protokollerde sağlamaktır.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Bu yazıda, tdTomato ve eGFP 'i ifade eden bir çift yönlü muhabir Plasmid ile nakledilmiş HEK293T hücrelerini kullanarak BK-polyomavirus transkripsiyon aktivitesinin FACS tabanlı ölçümünü gerçekleştirmek için bir protokol sunulmuştur. Bu yöntem daha da Nicek viral transkripsiyon üzerinde yeni bileşiklerin etkisini belirlemek için izin verir.

BK-polyomavirus kodlama dışı kontrol bölgesini Akış sitometrisi yoluyla transkripsiyon aktivitesinin ölçümü

Bu makalede, açık kaynaklı, ucuz smfBox'ı kullanarak biyomolekülleri serbestçe dağıtarak, açmadan hizalamaya ve odaklanmaya, veri toplama ve analize kadar, bireysel olarak tam olarak düzeltilmiş doğru FRET ölçümleri yapmak için adım adım yönergeler sağlanır.

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

Öğrenin tek parçacık düzeyinde viral füzyon kinetiğini iki renkli floresans mikroskobu ile görselleştirmeyi. Bu yöntem hemifüzyon ve gözenek oluşumunu gerçek zamanlı izleyerek viral giriş mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Daha fazla video keşfet