Name: Denatüre Üre Poliakrilamid Jel Elektroforez (Üre SAYFA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Öğrenin, tek zincirli DNA veya RNA fragmentlerini ayırmak için denatüre üre poliakrilamid jel elektroforez (Üre SAYFA) yöntemini. Bu teknik moleküler biyolojide sentezlenmiş veya etiketlenmiş oligonükleotitlerin analizi için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Singapur Akademik araştırma konseyi (ARC) [hibe sayısı 90/07] tarafından desteklenmiştir. Biz, destek için Radiodurans teşekkür ederiz.

Bu deneysel prosedür için tam ve ayrıntılı bir metin protokol Moleküler Biyoloji Mevcut Protokoller kullanılabilir. Ayrıntılı adım adım talimatlar, jel sandviç montajı için ve jel cihazlar için 3 BioRad web sitesinde bulunabilir. Gerekli ekipman: Cam levhalar (iç ve dış) 10 cm hücresi: 10,1 x 7,3 cm (iç plaka), 10,1 x 8,2 cm (dış plaka), BioRad 20 cm hücre: 20 x 20 cm (iç plaka), 20 x 22,3 cm (dış plaka), BioRad 0.5-1.5 mm jel tarak ve ayırıcılar Jel döküm standı Kapak ve kablolar ile Jel cihazlar Yüksek gerilim güç kaynağı Isıtma blok veya su banyosu Serolojik pipetler ve Pipet yardım Pipet ve pipet uçları Jel kurutma makinesi veya tarayıcı Reaktifler ve Çözümleri: Üre (ultra saf) % 40 poliakrilamid çözüm (29:1) 10 x TBE çözeltisi (Tris-borat, EDTA tampon) Deiyonize, distile su TEMED % 30 (w / v) amonyum persülfat çözümü 0,5 x TBE çözüm Formamid EDTA Ksilen cyanol Bromphenol mavi Metanol Etanol <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Hacim </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 50 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 60 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 10 ml </td></tr><tr><td> Akrilamid konsantrasyonu </td><td> % 10 </td><td> % 12.5 </td><td> % 15 </td><td> % 10 </td><td> % 12.5 </td><td> % 15 </td><td> % 10 </td><td> % 12.5 </td><td> % 15 </td></tr><tr><td> g ÜRE </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 28,8 </td><td> 28,8 </td><td> 28,8 </td><td> 4,8 </td><td> 4,8 </td><td> 4,8 </td></tr><tr><td> ml% 40 Akrilik (29:1) </td><td> 12,5 </td><td> 15,625 </td><td> 18,75 </td><td> 15 </td><td> 18,75 </td><td> 22,5 </td><td> 2,5 </td><td> 3,125 </td><td> 3,75 </td></tr><tr><td> ul 30% APS </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 199,2 </td><td> 199,2 </td><td> 199,2 </td><td> 33 </td><td> 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> ul TEMED </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 10 x TBE </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="10"> Hacim deiyonize, distile su ile doldurun </td></tr></tbody></table> Tablo 1: tek telli oligonükleotidler çözmek için çeşitli akrilamid konsantrasyonları ve hacimleri için gerekli Reaktifler ve çözümler Jel sandviç montaj ve jel hazırlama <ol><li> Jel üreticileri açıklamasına göre birleştirin ve jel-döküm haznesi 3 jel düzeltmek. 0.5-1.5 mm kalınlığında ayırıcılar kullanın. </li><li> Moleküler biyoloji alanındaki mevcut protokollere göre uygun poliakrilamid çözüm hazırlayın ya da Tablo 1&#39;de listelenmiştir. Denatüre akrilamid jel 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml jel çözüm ve 10.1 x 8.2 cm x 1 mm jel 5 ml jel çözüm için yeterli olacaktır. Birkaç üslerinden aralığında beklenen ürünler / bantlar Büyük jeller kullanılır, daha sonra uzun bir jel tek nükleotid bir fark bantları çözecektir. Beklenen bantları 10&#39;dan fazla nükleotidler farklılık varsa, küçük jeller parçaları çözmek için uygun olacaktır. Ayırma gereksinimlerinin uygun poliakrilamid yüzdesi seçin, daha yüksek bir poliakrilamid konsantrasyonları daha düşük molekül ağırlığı parçaları çözecektir. Ultra saf üre ve istenilen miktarda akrilamid karışımı kullanın. 0.5-1 x TBE nihai bir konsantrasyon ve hacim deiyonize, distile su ile doldurmak için TBE tampon jel karışımı ekleyin. Mikrodalga fırında 20 saniye boyunca çözüm Isı ve hafifçe karıştırın. Çözüm yandan ısınana kadar büyük jel hacimleri için bu adımı tekrarlayın. </li><li> Hemen bir serolojik pipet ve iki cam levha arasında otomatik bir pipet yardımı ile jel dökün. Hava kabarcıkları tanıtan kaçının. Tarak yerleştirin ve 30-60 dakika süreyle jel polimerize. </li></ol> Elektroforez cihazı kurmak ve jel prerun <ol><li> Talimatları 3 üretmektedir göre döküm haznesi ve jel aparat montaj jel ayırın. </li><li> Dolgu, cam plakalar, alt olacağını alt tampon odasına zekâ çalışan tampon (0.5-1 x TBE)tamponu ile 2-3 cm birleşti. Tampon çalışan jel top üst tampon odasına kadar doldurun. </li><li> Tarak dikkatlice çıkarın ve ipuçları yükleme Bir pipet ve jel kullanarak çalışan tamponu ile kuyu durulayın. </li><li> Yüksek gerilim güç kaynağı kabloları jel sistemi ve fiş kapağını takın. Örnekleri yükleyebilirsiniz önce jel ısı ve jel kalan üre kaldırmak için en az 30 dakika boyunca jel prerun var. Optimum sıcaklık 45-55 arasında olmalıdır ° C 60 daha yüksek ° C bantları, yayma veya cam plakalar çatlak olabilir olabilir. Kaçının Prerun (jel başına 15-25 W) için sabit watt seçin. </li></ol> Örnek hazırlama <ol><li> Bu arada numunesinin. Bu nedenle, uygun miktarda örnek 2 x jel yükleme karışımı ekleyin. Yükleme karışımı genellikle% 90 formamid,% 0.5 &#39;lik EDTA,% 0.1 ksilen cyanol ve% 0.1 bromphenol mavi içerir. </li><li> Örnekleri jel yüklenecek önce, örnekler, örnekleri, birkaç dakika 70-90 ° C arasında ısıtarak ısı denatüre olmalıdır. </li></ol> Jel yükleme ve çalıştırma <ol><li> Prerun bittiğinde kapağı kaldırmak ve iyice kuyu içine süzülen üre gibi önce açıklanan cepleri durulayın. </li><li> Cebinden alttan örnekleri dikkatle uygulayın. Hava kabarcıkları tanıtan kaçının. Yükleniyor tampon çalışması sırasında eşit koşulları sağlamak için boş cepleri uygulanacak. </li><li> Kapak kurma ve 55 jel sıcaklığını korumak için sabit watt jel çalıştırmak ° C prerun benzer. Jel boya ön alt ucuna ulaşıncaya kadar marker boyaların göç uyun. Çalışma süresi kullanılan akrilamid yüzdesi, tampon ve jel kalınlığı iyonik gücü bağlıdır. Bir çalışma, 2-4 saat arasında sürebilir. Jel sıcaklığını kontrol edin. Bir jel termometre çalışması sırasında sağ sıcaklığını izlemek için yardımcı olabilir. </li></ol> Jel Süreci <ol><li> Jel, boya ön jel sonuna ulaştığında alt tampon odasının söndürüldü. Odasından çıkarın ve jel kelepçeler gevşetin. Ayırıcılar dışarı doğru çekin ve dikkatle cam plakalar yüzlülük. Gerekli jel parçası içeren üst kesip durumunda. </li><li> Jel, jel fiksasyon solüsyonu (TBE artı% 5-10 Metanol ve Etanol aynı konsantrasyon) dikkatlice ile bir çanak içine aktarın. 5-10 dakika çözüm jel bırakın ve tampon iki kez değiştirin. </li><li> Jel, bir vakum jel kurutma makinası ya da doğrudan tarama jel kullanarak daha fazla işlem için hazırdır. </li></ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

<ol><li> Grubun keskinlik, çeşitli faktörlere bağlıdır. Yani ideal 1-5 ul arasında keskin bantları için yüklenen örnek hacmi, mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Ancak, 15&#39;e kadar ul hala kabul edilebilir bir çözüm sağlar yüklenebilir. Keskin bantları daha az örnek hacmi sonuçları. </li><li> Bant kalitesi de jel kalınlığına bağlıdır. 0,75 mm gibi Tiner jeller, 1.5 mm kalınlığında jeller daha iyi sonuçlar göstermektedir. </li><li> Bantların şekli de örnek jel cebine eşit uygulanabilir değilse jel yükleme sırasında etkilenmiş olabilir. Yükleme ...

denatüre Üre poliakrilamid jel elektroforez (Üre sayfa)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Üre SAYFA veya üre poliakrilamid jel elektroforezi denatüre ikincil DNA veya RNA yapıları yıkılır ve molekül ağırlığı dayalı bir poliakrilamid jel matris ayrılması için kullanılan 6-8 M üre, istihdam etmektedir. 2 ila 500 üsleri arasında parçaları, bir tek nükleotid gibi küçük uzunluğu farklılıklar, bu yöntemi kullanarak 1 ayrılabilir. Örnek göç seçilen akrilamid konsantrasyonuna bağlıdır. Poliakrilamid bir daha yüksek oranda düşük molekül ağırlıklı parçaları giderir. Kombinasyonu üre ve sıcaklıklar 45-55 ° C jel çalışması sırasında yapılandırılmamış DNA veya RNA molekülleri birbirinden ayrılması için izin verir. Genel olarak bu yöntem, tek iplikli DNA veya RNA parçaları, enzimatik parçalanma reaksiyonlarını sentezlenmiş veya etiketli oligonükleotidler veya ürünlerin analiz veya arındırmak için gereklidir. Bu video makalede denatüre üre poliakrilamid jeller hazırlamak ve çalıştırmak için nasıl göstermektedir. Orijinal protokol 1,2 ek olarak, teknik ipuçları yer almaktadır.

Denatüre üre poliakrilamid jel elektroforezi ayrı tek iplikli DNA veya RNA 500 nükleotidlerin bir sınıra kadar kullanılır. Üre, ısı denatüre örnekleri ve yapılandırılmamış tek iplikçikler ile birlikte moleküler ağırlığına göre jel matriks içinde göç ederler.

Denatüre Üre Poliakrilamid Jel Elektroforez (Üre SAYFA)

Üre PAGE veya denatüre edici üre poliakrilamid jel elektroforezi, sekonder DNA veya RNA yapılarını denatüre eden 6-8 M üre kullanır ve bunların ... için kullanılır.

Genel olarak, bu tür jeller; sentezlenmiş veya işaretlenmiş oligonükleotidler ya da enzimatik kesim reaksiyonlarından elde edilen ürünler gibi tek zincirli DNA veya RNA fragmanlarını ayırmak için gereklidir. Ayırma aralığı poliamid konsantrasyonuna bağlıdır; üre, ısı ile birlikte örnekleri denatüre eder ve tek zincirli moleküller jel matrisi içinde moleküler ağırlıklarına göre göç eder. Bu video, tipik bir jelin dökümünü, çalıştırılmasını ve işlemesini sunmaktadır.Merhaba, benim adım Haki. Nanyang Teknolojik Üniversitesi'ndeyim. Bu gösterimde, size denatüre eden poliakrilamid jel elektroforezinin nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğim.Temiz cam plakalar kullanın ve jel sandviçini üreticinin açıklamasına göre oluşturun. Jeli, standart jel döküm hücresine sabitleyin. Eğer jel cam plakalara yapışma eğilimindeyse, büyük jellerin cam plakalarını dondurun.Ayırma gereksinimlerinize göre uygun jel boyutunu ve kalınlığını seçin. Moleküler biyolojideki güncel protokollere uygun olarak jel çözeltisini hazırlayın.Ayırma gereksinimlerinize uygun bir poliamid konsantrasyonu seçin. Daha yüksek akrilamid yüzdesi, daha düşük moleküler ağırlıktaki fragmanların çözünürlüğünü artıracaktır. Alta pure

denaturing-urea-polyacrylamide-gel-electrophoresis-urea-page

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) multiprotein kompleksler (MPCs) karakterizasyonu açıklar. Birinci boyut, diyaliz hücresel lizatları bireysel MPCs tanımlamak için BN-PAGE ile ayrılır. Ikinci bir boyut SDS-PAGE, faiz MPCs daha immün bileşenleri analiz alt gruba ayrılır.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Bu video, proteinler için denatüre edici bir poliakrilamid bazlı ayırma tekniğini göstermektedir. Bu teknik, proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ön tanımlanmasına yardımcı olur.

Protein Analizi için Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Moleküler Ağırlığa Göre Proteinleri Ayırmak ve Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, fosforile RNA türlerinin fosforile olmayan muadillerinden ayrılması için denatüre edici bir poliakrilamid jel elektroforezi gösteriyoruz. RNA türleri, jel üzerinde lazer tespiti için floresan olarak etiketlenmiştir.

RNA Analizi için Üre Poliakrilamid Jel Elektroforezinin Denatüre Edilmesi: Floresan Etiketli Fosforile RNA Oligonükleotidlerini Fosforile Olmayan Eşdeğerlerinden Ayırmak İçin Bir Teknik

Bu videoda, insan fonksiyonel olmayan hipofiz adenomunun (NFPA) tümör dokularından elde edilen karmaşık bir protein karışımından tek tek proteinleri ayıran iki boyutlu bir jel elektroforezi yöntemi gösteriyoruz. Proteinler, birinci boyutta elektrik yüklerine göre ayrılır ve ikinci boyutta moleküler ağırlıklara göre daha da ayrılır.

İki Boyutlu Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Yük ve Moleküler Ağırlığa Dayalı Kompleks Protein Karışımındaki Proteinlerin Analizi İçin Bir Ayırma Tekniği

RNA polimeraz II olgun mRNA'nın 3 'ucunun ötesine uzanan bir ön-madde RNA sentezler. Olgun RNA uç yarılma kompleksinin endonükleaz etkinliği ile, RNA dizileri tarafından dikte bir bölgede, cotranscriptionally oluşturulur. Burada, detay in vitro bölünme reaksiyonları çalışma yöntemi biz.

Pre-mRNA Substratlarm 3 &#39;End Bölünme: Hücre Ücretsiz Sistemlerini Kullanma RNA İşleme Reaksiyonları Analizi<em&gt; In vitro</em

Bu makale, insan hücrelerinin lizatlarından elde edilen dinnamin benzeri GTPase MxA proteininin oligomerik durumunu, denatüre olmayan PAGE ile western blot analizinin bir kombinasyonunu kullanarak değerlendirmek için basit ve hızlı bir protokolü açıklamaktadır.

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

Bu protokol alt birimi yakımının birlikte ve rekombinant proteazom montaj daha kapsamlı bir muayene için karıştırma postlysis alt birimini hem kullanır.

Rekombinant Archaeal proteazomlar ve Nondenaturing PAGE ile Proteozom Meclisi İncelenmesi: Durum bir Kombine Yaklaşım

Burada RNA Mango aptamers ı, II, III veya IV ile etiketlenmiş görüntü Rnas 'ında doğal veya denatüre Poliakrilamid jel elektroforezi (Page) jelleri kullanarak hassas, hızlı ve ayrımcılık sonrası jel boyama yöntemi sunuyoruz. Standart sayfa jeller çalıştırdıktan sonra, Mango-Tagged RNA kolayca TO1-biotin ile lekelenmiş ve daha sonra yaygın olarak kullanılabilir floresan okuyucular kullanılarak analiz edilebilir.

Polyacrylamide jeller içinde Mango-Tagged RNA floresan görselleştirme bir Poststaining yöntemi ile

Denatüre Gradient Jel Elektroforezi (DGGE)

Bu video in vitro anjiyogenez tayininde bir protokol anjiyogenez özetlediği çeşitli aşamaları olduğunu göstermektedir. Zaman atlamalı çimlenme görüntüleri, lümen oluşumu, dallanma ve anastomoz - anjiyogenez temel özellikleri gösterilmektedir.

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Öğrenin, tek zincirli DNA veya RNA fragmentlerini ayırmak için denatüre üre poliakrilamid jel elektroforez (Üre SAYFA) yöntemini. Bu teknik moleküler biyolojide sentezlenmiş veya etiketlenmiş oligonükleotitlerin analizi için kullanılır.

Denatüre Üre Poliakrilamid Jel Elektroforez (Üre SAYFA)

Daha fazla video keşfet