Name: Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Öğrenin, paralel akışkan enjektör dizisi kullanarak bozulmamış 3-D beyin devrelerine viral teslimatı nasıl gerçekleştirilir. Bu yöntem, optogenetik manipülasyon ve sinir devresi analizi için transgenik fare modellerinin hızlı oluşturulmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ESB NIH Yönetmen Kullanıcı Yeni Yenilikçisi Ödülü (OD002002-01 DP2), NIH Mücadelesi Grant 1RC1MH088182-01, NIH Büyük Fırsatlar Hibe 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0.835.878 ve 0.848.804), McGovern Enstitüsü Nöroteknoloji Ödülü Programı tarafından fon kabul eder Savunma, NARSAD, Alfred P. Sloan Vakfı, Jerry ve Marge Burnett, Nörobilim, MIT Media Lab, Benesse Vakfı ve Wallace H. Coulter Vakfı Yenilik SFN Araştırma Ödülü Bölümü.

1. Stereotaksik Kelepçe inşa <ol><li> Stereotaksik kelepçe enjektörler stereotaksik koluna paralel olacak şekilde, stereotax enjektör dizisi takmak için kullanılır. </li><li> Her bir laboratuar, aynı anda birden fazla cerrahi yer alabileceğini tahmin sürece, sadece tek bir kelepçe gerekiyor. Bu durumda, eşzamanlı ameliyatlar beklenen maksimum sayısı olarak aynı sayıda olun. Aynı zamanda ilk hasar halinde, fazladan bir tavsiye olabilir. </li><li> Stereotaksik kelepçe yapmak için, öncelikle, 1.5 mm dış çapı (OD) çelik kanül 2 inç uzunluğunda kesilir ve uçları düz kadar aşağı Dremeled. </li><li> Sonra, bir boşluk olarak kullanılmak üzere küçük bir parça (yaklaşık 0,5 x 0,5 cm), PCB proto-board dışarı kesilir. </li><li> Yapılan hiçbir kesinti malzeme yüzeyine dik olduğundan emin olun bir lazer kesici kullanarak, iki özdeş dikdörtgenler (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;) 1 / 8 &quot;akrilik kaplama, iki dairesel delik olan her dikdörtgen kesilir 1.5mm çap dikdörtgen ters köşe. ilk delik, sadece sıkı metal kanül içine alabilecek kadar büyük. çapı 1 / 16 &quot;(Şekil 1C) ikinci bir delik vardır. </li><li> Metal kanül ikinci 1.5 mm delikten sonra, bir dikdörtgenin 1.5 mm delik eklenir. Kanül alt ucuna bir hokey sopası şekli oluşturan, altındaki dikdörtgen alt yüzü ile uyumlu. </li><li> Bu yapı, iki dikdörtgen arasındaki sıkı düzenlenen ayırıcı tutarken, kanül ve 1.5mm delikleri etrafında sıcak tutkal kullanarak birlikte yapıştırma dikdörtgenler için ayırıcı önlemek için dikkatli olmak yapıştırılır. Kil modelleme, bu işlem sırasında birlikte bir şeyler tutmak için yararlı olabilir. </li><li> Tutkal kuruduktan sonra, 1-72 vida dikdörtgenlerin üst kısmında 1 / 16 deliğe sokulur. Sonra 1-72 altıgen somunu 1-72 vida ucuna vidalanır ve sıkılır. Vida ve somun birlikte kelepçe tutmak için hizmet vermektedir. </li><li> Epoksi altıgen somunu veya vida konuları içine almak için izin vermeden, alt dikdörtgen, 5 dakikalık epoksi küçük miktarda alt yüzüne altıgen somunu eklemek için, altıgen somunu kenarında bırakılır. Herhangi bir modelleme kil kaldırılır ve ayırıcı vida sıkma tarafından sıkıca yerinde tutulabilir doğruladı. </li></ol> 2. Hamilton pompa ve stereotax özelleştirilmiş enjektör dizi için sistem hazırlanması <ol><li> Enjektör dizi beyin koordinatları hemen her şekilde özelleştirilebilir. </li><li> Kullanıcı ilk bulur stereotax tarafından kullanılan uygun koordinatlara dönüştürme, bir fare (veya başka tür) beyin atlası istenen enjeksiyon yerleri koordinatları (burada, X, Y ve Z koordinatları). Enjeksiyon sitelerin sayısı (Şekil 1A ve 1B üç) bundan sonra k olarak adlandırılan olacak. </li><li> k 10 ul Hamilton şırınga sayısı gibi Harvard aparat bu gibi bir enjeksiyon / çekme şırınga pompa yerleştirilir. </li><li> Her Hamilton şırınga, iğne, polietilen boru Sonraki, 3 metrelik parçalar güvenli bir şekilde bağlıdırlar. </li><li> Upchurch Bilimsel bir F-252 boru kol polietilen boru, her parça için açık ucu üzerine kaydırdı ve yer somunu kullanarak bir P-627 tüp adaptörü bağlı ve aynı zamanda Upchurch Bilimsel, halkalı. </li></ol> 3. Özelleştirilmiş Enjektör Array oluşturulması <ol><li> Her enjektör dizi, kullanıcının seçtiği koordinat ayarlamak için özelleştirilmiştir. Ancak, sadece bir çeviri ve / veya rotasyon farklı koordinat kümeleri için, aynı enjektör dizi kullanılmalıdır. </li><li> Göz önüne alındığında sadece göreceli enjeksiyon sitelerin X ve Y koordinatları, k delik &quot;aynı bağıl aralık, kalınlığı 1 / 32 bir PCB proto-board içine Bu delikler, bir Modela mini değirmen ve bir .011 kullanarak delinir&quot; delinir McMaster-Carr matkap ucu çapı. Kırılma veya matkap tükenmesini önlemek için yavaş bir sondaj oranı (Z-hız) kullandığınızdan emin olun. Değirmen kurulu çıkarmadan önce, bir dikdörtgen küçük bir tükenmesini önlemek için, çapı 1 / 32 &quot;daha büyük bir matkap ucu kullanılarak, küçük delikler etrafında delinmiş mini değirmen Kod kolayca MATLAB kullanarak oluşturulabilir; örnek kodu aşağıdaki dosyaları sağlanmaktadır. <ol class="lroman"><li> generate.m - MATLAB kodu istenilen koordinatları Modela kodu üretmek için </li><li> holes_ex.rml - Proto-board delik zil sesi tonu (sekiz delikli) Modela kodu </li><li> outline_ex.rml - sondaj dikdörtgen için delikleri etrafında Modela kodu </li></ol></li><li> 245 mikron OD/100 mm iç çapı (ID) erimiş silika kapiler boru Polymicro Teknolojileri edinilebilir, 3 inç adet k sayısı bölünür. Bunlar ayrı ayrı enjektörler oluşmaktadır. Kılcal boru tek parça ile dürttü.deliklerin her biri, gerçek enjektörler tıkamadan enkaz kaldırmak için. Enjektörler, daha sonra her deliğe yarım takılı, birbirlerine sıkı ve paralel tutulur. Enjektörler, enjektör dizinin yapısı oluşturarak, yönetim kurulu epoxied. Geriye kalan tek şey, doğru uzunlukta enjektörler trim. </li><li> Enjektör dizi stereotaksik kelepçe vida sıkma sonra akrilik dikdörtgenler arasında proto-board bir köşesinde koyarak stereotaksik kelepçe takılmış ve. Sonra, kelepçe, metal kanül stereotax eki mekanizmasını kullanarak, stereotax eklenir. </li><li> Aşağıdaki mikroskop altında yapılır. Dış enjektörler (yani, diğer herhangi bir enjektör içine darbeleme olmadan, düz bir kenarı ile yan yaklaştı olabilir) biri için, proto-kurulu alt ötesine uzanan ucu makas ile kesilir. Kortikal enjeksiyon için enjektör proto-board yüzey ötesinde yaklaşık 5mm uzanan olması uygundur. Derin enjeksiyonları için derinlemesine karşılık gelen bir artış, bu sayı artabilir. Ucu Dremel aleti ile düzleştirilir. Enjektör ipuçları derinlemesine hassas, daha az önemli olmadığını da tıkanma karşı ekstra bir önlem olarak bir açıyla zemin olabilir. </li><li> Sonra, stereotaksik kol aralık içinde kararlı bir referans noktası seçilir ve enjektör dizi dış enjektör ucu basık, bu referans noktası o kadar taşınır. </li><li> Ikinci bir enjektör ilgili koordinatları ile birlikte, tercih edilir. Birinci ve ikinci enjektör koordinatları göreli arasındaki yükseklik farkı (z yönünde) değerlendirilmektedir. Enjektör dizi bu izafi mesafe Z ekseni boyunca hareket eder. Ikinci enjektör ikinci enjektör ucu referans noktası yüksekliği şu anda düz ve böylece kesilmiş ve doğru uzunlukta için Dremeled. Enjektör dizi referans noktası ile, enjektörün ucu karşılaştırma kolaylaştırmak için X ve Y yönlerinde hareket ettirilebilir. </li><li> Kırpma Bu süreç kalan enjektörler için tekrarlanır. </li></ol> 4. Tüm sistem montajı <ol><li> Stereotaksik kelepçe ve özelleştirilmiş enjektör dizisi, her ikisi de zaten inşa, bu bölüm için gereklidir. </li><li> Her bir enjektör arka uç (kesilmiş olmamıştır sonuna), P-235 somun ve P-200 halkalı Upchurch Bilimsel kullanarak, bir F-240 boru kol mavi ve eklenir zaten bağlı dişli adaptöre bağlı polietilen boru Hamilton pompa. Ayrıntılı bilgi için üreticinin talimatlarına konsülte edilebilir. </li><li> 27-gauge bir iğne kullanılması, silikon yağı, tüm sistem Hamilton şırınga, enjektör ucu doludur ki Hamilton şırınga arkasına hiç hava kabarcığı enjekte edilir. </li><li> Yerleştirilir Hamilton şırınga Hamilton pompası yeniden silikon yağı, mümkün olan en büyük hacimli şırınga korunur. </li><li> Deney pompası (bu durumda iki) için tasarlanmış daha fazla şırınga gerektiriyorsa, şırıngalar, onları birbirlerine paralel tutmak ve tüm parçaları olduğundan emin olmak için küçük plastik parçaları (örneğin, iğne kapakları) aralıklı olabilir aynı ölçüde pompa ile itti. Ya da, çok raf yükseltme kiti, tek seferde 10 şırınga adete kadar Harvard Apparatus satın olabilir. </li></ol> 5. Enjeksiyonlar / cerrahi <ol><li> Paralel bir enjektör ile enjekte süreci tek bir pipet yardımıyla enjekte çok benzer. </li><li> Hızlı pompalama büyük ve küçük tüp arasındaki ortak bir stres yaratır, çünkü, yavaş dolum / oranları bu süreç boyunca demlenmeye esastır. Önerilen maksimum hızı: 2 ul / virüs yükleme dk, ve 0.1 virüs beslerken ul / dk. </li><li> Bir anestezi fare stereotax yerleştirilir ve deney süresince anestezi kalır. </li><li> Gerektiği gibi fare hazırlayın. Örneğin, bir bistüri ile, tek bir kesim gözler arasındaki kulağı arasında, cildin orta hatta aşağı yapılır. Kafatası açığa çıkarmak için deri geri çekilir ve fasya temizlenmelidir. Bir çekti cam pipet stereotax eklenir. Kulak çubukları pozisyonları bregma ve lambda aynı yükseklikte hizalanır ve böylece onları birleştiren çizginin stereotax Y-eksenine paralel olduğu kadar ayarlanır. Stereotax eksenleri enjeksiyon koordinatları hesaplanır edildiği koordinat sistemine göre odaklı. Stereotaksik bregma cam pipet ucu ile sıfırlanır ve sonra ucu X ve Y-koordinatlarının enjeksiyon sitelerinden biri kafatası biraz üzerinde konumlandırılmış. </li><li> Bir diş matkap kullanarak, son derece ince bir tabaka kemik kalana kadar, ucu aşağıdaki kafatası dikkatlice uzakta karşılaştırıldı. Cam pipet düşük olabilirdelinmiş deliğe doğru pozisyonda merkezli olup olmadığını kontrol etmek için kaldırdı ed ve. 30-gauge iğne kullanarak, küçük bir parça katmanın doğru X ve Y koordinatları, nazikçe kapalı alınır duramater maruz kaldığı. Bu delik enjektörler (0.25mm geniş) sığacak kadar büyük olmalıdır. Diyagramı Şekil 1D bakın. Bu şekilde, küçük, 0.25mm geniş delikler, kafatası yapılan X-ve her enjeksiyon yerinde karşılık gelen Y koordinatları. </li><li> Cam pipet kavuz konteyner atılır ve özelleştirilmiş enjektör dizi stereotaksik kelepçe kullanarak stereotax eklenir. </li><li> Enjektör dizinin doğru açıyı ayarlamak için, aşağıdaki gibi iki dış enjektörler, belirli bir referans noktası kalibre edilmesi tercih edilmektedir. Enjektörlerin bir referans noktası ile eşleşen sonra, göreli X-ve bu enjektör göre enjeksiyon siteler arasında Y-mesafeler ve diğer bir düşünün. Tüm enjektör dizi bu izafi mesafeleri X ve Y yönünde hareket eder, böylece stereotax eksenleri ayarlanır. Ikinci enjektör şimdi referans noktası ile uyumlu değilse, metal kanül gevşetti ve döndürülür. Enjektör dizisi doğru açılı kadar bu işlemi yinelemeli tekrarlanır. </li><li> Şırınga 2 ul noktası (veya daha fazla) kadar virüs enjektörler doldurmadan önce, enjektörler, silikon yağı ile doldurulur. Bu uç tıkanma herhangi bir hava kabarcıkları ya da önceden tanımlamak, şırınga arkasına silikon yağı ile dolum tüm sistemine sahip olmadan, Hamilton pompa kullanarak ileriye iterek yağ kolayca çıkarılabilir, böylece bir tampon bölge sağlar. </li><li> Parafilm steril bir parça kafatası konur, ve enjektörler Parafilm üzerine hafifçe düşürdü. Büyük ölçüde değişen derinliklerde, özel işlenmiş bir parçası (örneğin merdiven şeklindeki bir nesnenin) koordinatları için yükleme kolaylaştırabilir. </li><li> Aşağıdaki parçalar 1 ul virüs (küçük miktarlarda istendiğinde aşağıdaki miktarlarda küçülttüm olmalıdır) her yerinde yüklenecek olduğunu varsayalım. Her site&gt; 1 ul virüs enjekte olduğunu garanti etmek için, virüs 1.5 ul her enjektör ucunda Parafilm veya merdiven üzerine pipetlenir. </li><li> Hamilton pompa dolum oranı 1 ul / dk seti ile virüs 1.2 ul her enjektör içine doldurulur. </li><li> Uzun enjektör ucu bregma sıfırlanır ve sonra enjektör dizi bu enjektör X ve Y koordinatları kaydırılır. Tıkanma, çok derin hedefler bir sorun ise söz konusu olması halinde, diyelim ki, hatta beyin içine enjektör ipuçları yerleştirmeden önce, virüs tüm enjektör ipuçları ortaya çıkan görülebileceği kadar, pompa beslerken başlatmak için bazen tavsiye edilir. Bu enjektör ucunda herhangi bir hava kabarcığı kaldırır ve aynı zamanda herhangi bir tıkanma var olmasını sağlar. Tıkanma durumda, Hamilton pompa hafifçe tıkanma temizlemek için, kısa bir darbe daha yüksek bir hızda 2 ul / dak demlenmeye ayarlanır. </li><li> Sonra enjektör dizi Doğru Z-derinlik, 30-gauge iğne ile yapılan küçük deliklerden indirilir. </li><li> 1 ul virüs 0.1 ul / dk, her bir enjektör ile enjekte edilir. </li><li> Enjeksiyonları 30 dakika boyunca yalnız bırakılır. </li><li> Hamilton pompası enjektör dizisi yavaş yavaş beyin çıkarılan sonra, her enjektör tıkanma kontrol etmek için, 0.1 ul / dak aynı oranda demlenmeye ayarlanır. </li><li> Sonra enjektörler 2 ul / dak etanol 1.5 ul dolum ve beslerken tarafından temizlenir. </li><li> Son olarak, enjektörler, her Hamilton şırınga içinde 2 ul tampon bölge korumak için silikon yağı ile doldurulabilir. </li><li> Tüm ekipman kurumun biyogüvenlik ve hayvan kullanım protokolleri göre, işlem öncesi ve sonrasında sterilize edilmelidir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Paralel enjektör dizi bireysel kez uygulayıcısı beceri bağlıdır rağmen, kurulum ve kurtarma zamanı saymazsak, enjekte edenlerin sayısı ile eşit bir faktör tarafından kabaca bir ameliyat hızlandırır. 1 mikrolitrelik enjeksiyon için, biz genellikle yaklaşık çapı 1 mm (Şekil 1E) bir küre lentivirüs ifade gördüm. Enjeksiyon hassas ucu konumlandırma değişkenliği, deneme yargılanma, yaklaşık 45 mikron (ucunun pozisyonu amaçlanan ucunun mesafe standart sapma) olduğunu gibi oldu. <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. üçlü paralel enjektör dizi fotoğrafı aynı anda üç enjeksiyon için, üçlü bir enjektör yapılandırma gösteren paralel enjektör dizi sistemi, şematik, B, A Tasarım, uygulama ve paralel bir virüs enjektör dizi kullanın. Diyagramlanabilmiştir . <stRong&gt; C, üst anahat gösterilen stereotaksik kelepçe, D, tekniği, hasar en aza indirmek, beynin içine enjektör yerleştirilmesi için kafatasında delik verimli açılması için resimde: diş bir matkap ile, ince aşağı kafatası ~ 50 mikron kalınlık, daha sonra kullanmak channelrhodopsin-2 (ChR2) gösteren küçük bir kraniotomi açmak için keskin bir iğne ucu E, floresan görüntü GFP etiketli B&#39;de gösterildiği gibi üç enjektör dizisi ile hedef üç fare kortikal bölgelerde, hücrelerin

<ol><li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. 2009 Feburary 26, Slat Lake City, Utah, , Computational and systems neuroscience. (2009).</li>
<li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li>
<li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity%2C+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li>
<li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li>
<li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li>
</ol>

Tüm işlemler Laboratuvar Hayvanları NIH Kılavuzu&#39;na uygun ve MIT Hayvan Bakım ve Kullanım ve Biyogüvenlik Komiteleri tarafından onaylanmıştır.

(Örneğin, 1,4,5,6,7,8 kısa ışık darbeleri yanıt olarak, geçici olarak hassas bir moda, son yıllarda, genetik olarak kodlanmış optik duyarlaştırıcılar bir dizi aktif hale nöronlar etkinleştirilmiş olması ve in vivo susturuldu , 11). Nöronlar memeli beyninde ışık hassaslaşmış olan bir önemli yöntem, fareler ile maymunlar arasında değişen hayvanların beyin opsins kodlayan genlerin sunabilirsiniz lentiviruses ve adeno-ilişkili virüs (AAV) gibi virüsler aracılığıyla güvenli ve kalıcı bir şekilde (örneğin, 2,9,10) . Virüsler, transgenik daha hızlı gerçekleştirme süresi, özellikle bu tür fareler ve maymunlar gibi genetik model organizma değildir organizmalar için izin ve opsins için transgenik senaryolarda mümkün olmayabilir yüksek ekspresyon düzeyleri etkinleştirebilirsiniz. Burada tek bir cerrahi adımda bütün 3 boyutlu beyin yapıları viral bir gen hedef sağlayan hızlı bir zaman çizelgesi oluşturma yeteneğine sahip paralel bir enjektör dizi, &quot;devre düzeyinde transgenik&quot;, göstermektedir. Enjektör dizi, her biri poliimid / erimiş silika besleyen her sürücü, bir şırınga, yüksek basınca dayanıklı konnektörü üzerinden kapiller bir veya daha fazla deplasmanlı pompalar oluşmaktadır. Kılcal damarların boyutlu ve daha sonra stereotaktik bir konumlandırma kurulu özel öğütülmesi ile belirtilen istenilen yerlerde takılı, böylece virüs veya diğer reaktifler beyin bölgelerinde istenilen şekilde ayarlanabilir teslim edilmek üzere izin. Cihazı kullanmak için, cerrah ilk yağı ile akışkan alt sistemi tamamen doldurur virüs kılcal damarların Dolgularda, cihaz beynin içine ekler, ve yavaş yavaş (&lt;0.1 mcL / dk) reaktifler aşılamaktadır. Bu teknoloji gibi yeni tür deneyler, karmaşık şekilli yapılar milisaniye davranış sırasında hassas zaman-zaman ölçeğinde kapatma (hipokampus gibi), yedeklemeli hareket edebilir ikili yapıların zamansal hassas inaktivasyon gibi geniş bir yelpazede (sağlayacaktır sol ve sağ amigdala) ve faz iki bağlı bölgelerde sürüş birden fazla ayrık beyin bölgelerinde (örneğin, pertürbasyon çapraz bölge senkronize her bölgede faaliyet bağlıdır nasıl çalışması, ya da bir alt kümesi susturmak ise bir bölgeye girdi uyarıcı ) çeşitli hedefleri olan bu girdilerin etkileri arabuluculuk için kritik anlamak için hedefler. Primat gibi büyük beyinler için, içinde yaşadığımız son zamanlarda optik hücre tipi özel nöral aktivasyon 3, büyük, karmaşık yapılar viral etiketlenmesi, davranışsal ilgili bir alanda faaliyet rahatsızlık vermesini isteyebilir göstermiştir. - Ilaçlar, nöromodülatör, nörotransmitterler, ya da hücreler, beynin karmaşık 3-D desenler, geçici olarak kesin bir şekilde paralel enjektör dizileri hemen hemen herhangi bir yük enjekte etmekte kullanılan olabileceğini unutmayın. Son olarak, translasyonel bir bakış açısıyla, hızlı, hasta özelleştirilmiş gen tedavisi ya da ilaç dağıtım cihazları hızla olabilir, potansiyel olarak kullanılması yoluyla, çeşitli patolojiler için yeni tedaviler destekleyen, bireysel beyin geometrileri maç için özel olarak tasarlanmış ve imal edilmiş optik kontrol moleküllerdir. Enjektör diziler hem de mekansal ve hacimsel olarak, kesin olmak için tasarlanmıştır. X ve Y yönünde, bu delikli enjektörler, enjektörler birbirine paralel tutulur, böylece sığacak kadar sadece büyük bir ucuz mini-mill kullanarak çok doğru yerleştirilmiş delik delme gerçekleştirilir, ve kesin bir konumu. Z-yönünde stereotaksik cerrahi kendisi ile eşdeğer bir hassasiyet seviyesini sağlayan, enjektörler, stereotaksik cihazları kullanırken kesilmiş bulunmaktadır. Hamilton pompasının yanı sıra, hassasiyet, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) alanına adapte sıfıra yakın ölü hacim konektörler, hacimsel hassasiyet ortaya çıkar. Enjektörler, güçlü ve kesin şeklini ve basınç altında boşluk korur yeterince sert erimiş silika kapiler boru, çelik kanüller gibi alternatifler büyük duvar kalınlığı olmadan yapılır. Paralel enjektör dizi deney çeşitli adapte küçük değişiklikler kolayca yapılabilir. Örneğin, küçük hacimli bir virüs ya da ince aralığı gerekiyorsa, daha küçük kılcal boru ilgili küçük bir matkap ucu ile birlikte, istihdam edilebilir. Gelecek cihazların boyutunu en aza indirmek için (belki serbestçe hareket eden hayvanların başlarına bu tür cihazların monte edilmesini sağlayan), paralel enjektörlerin sayısını artırmak için, mikroakışkan kanalları ve pompaları kullanabilir.

<table><tbody><tr><td>Dremel Aleti</td><td>Araç</td><td>Dremel</td><td>3956-02</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Kesici</td><td>Araç</td><td>Universal Laser Systems</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak silikon tabancası</td><td>Araç</td><td>Stanley Bostitch</td><td>GR20</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyon/geri çekme şırınga pompası (Hamilton pompası)</td><td>Araç</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;Hamilton şırıngaları</td><td>Araç</td><td>Hamilton Co</td><td>701N</td><td>Enjeksiyon bölgesi başına bir adet gereklidir</td></tr><tr><td>Fare stereotaksik cihazı</td><td>Araç</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725D</td><td></td></tr><tr><td>Modela mini-mill</td><td>Araç</td><td>Roland</td><td>MDX-15</td><td></td></tr><tr><td>0.011&quot; mini freze için matkap ucu çapı</td><td>Araç</td><td>McMaster-Carr</td><td>8915A12</td><td></td></tr><tr><td>1/32&quot; mini-mill için matkap ucu çapı</td><td>Araç</td><td>McMaster-Carr</td><td>8848A35</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek hızlı dental drill</td><td>Araç</td><td>Vaşak</td><td>333</td><td></td></tr><tr><td>Dental frez aksesuarları</td><td>Araç</td><td>Pearson Değerlendirmeleri</td><td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td><td></td></tr><tr><td> </td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>1,5 mm dış çaplı (OD) paslanmaz çelik kanül</td><td>Materyal</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-15R</td><td></td></tr><tr><td>1-72 bağlama yivli makine vidası</td><td>Materyal</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>MX-0172B</td><td></td></tr><tr><td>1-72 altıköşe somun</td><td>Materyal</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HNX-0172</td><td></td></tr><tr><td>PCB prototip kartı, 1/32&quot; kalın</td><td>Materyal</td><td>Digi-Key</td><td>PC57-T-ND</td><td></td></tr><tr><td>Akrilik Levha, 1/8&quot; kalın</td><td>Materyal</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>HPLC konnektörleri</td><td>Materyaller</td><td>Upchurch Scientific</td><td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (bunların bazıları 10'lu paketler halinde satın alınabilir; sadece bir &amp;#8216;Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni sağlayın.&amp;rsquo; parça numarasının sonuna kadar)</td><td>F-252, P-627 ve P-235 hariç, her bölge için enjeksiyon başına bir adet gereklidir; bunlar yeniden kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Ergimiş silika kapiler tüp, dış çap: 245 &amp;mu;m, Kimlik: 100 &amp;mu;m</td><td>Materyaller</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000022-10M</td><td></td></tr><tr><td>5 dakikalık genel amaçlı epoksi</td><td>Materyal</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td>5 dakikalık genel amaçlı epoksi</td></tr><tr><td>Polietilen tüp .066 x .095 inç</td><td>Materyaller</td><td>VWR international</td><td>63018-827</td><td></td></tr></tbody></table>

bozulmamış 3-d beyin devrelerin hedefleme viral için Ölçeklenebilir akışkan enjektör diziler

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Nöral devreleri anlayışımız hızla karmaşık 3 genleri hedefleyen bir teknoloji ile büyük ölçüde kolaylaştırılmış olacaktır yaramak his, düşünce, duygu ve eylem, nörolojik ve psikiyatrik bozukluklar nasıl bozuk hesaplamaları nasıl arabuluculuk hızlı oluşturulmasını sağlayarak boyutlu sinir devreleri, &quot;devre düzeyinde transgenik.&quot; Biz son zamanlarda ışığa duyarlı proteinler için kodlama virüsler spesifik hücre tiplerinin milisaniyelik zaman çizelgesi aktivasyon duyarlı ve bozulmamış beyin susturma hangi yöntemler geliştirdik. Biz burada, beynin 3 boyutlu bir yapı içinde tanımlanan noktaları onlarca virüslerin (ya da diğer sıvılar) sunma yeteneğine sahip bir enjektör dizi tasarım ve uygulama mevcut (<strong&gt; Şekil. 1A, 1B</strong&gt;). Enjektör dizi, her biri poliimid / erimiş silika besleyen her sürücü, bir şırınga, yüksek basınca dayanıklı konnektörü üzerinden kapiller bir veya daha fazla deplasmanlı pompalar oluşmaktadır. Kılcal damarların boyutlu ve daha sonra stereotaktik bir konumlandırma kurulu özel öğütülmesi ile belirtilen istenilen yerlerde takılı, böylece virüs veya diğer reaktifler beyin bölgelerinde istenilen şekilde ayarlanabilir teslim edilmek üzere izin. Cihazı kullanmak için, cerrah ilk yağı ile akışkan alt sistemi tamamen doldurur virüs kılcal damarların Dolgularda, cihaz beynin içine ekler, ve yavaş yavaş (&lt;0.1 mikrolitre / dk) reaktifler aşılamaktadır. Enjektör dizi paralel doğa ışık tanımlanmış beyin devrelerinin aktivasyonunu ve susturulması etkinleştirmek için, optik duyarlaştırıcılar gibi viral payload ile tüm sinir devrelerinin, hızlı, doğru, ve sağlam etiketleme kolaylaştırır. Gibi beyin bölgelerinde istenilen setleri ışık teslimat için fiber optik dizileri gibi diğer teknolojiler ile birlikte, nedensel sinir fonksiyonları bozulmamış beyin sistematik problama sağlayan bir araç kutusu oluşturmak için umut. Bu teknoloji sadece memelilerde devre odaklı sinirbilim gibi sistematik yaklaşımlar açmak ve insan olmayan primatların gibi büyük hayvanlarda beyin bölgelerinin etiketleme kolaylaştırmak, ama aynı zamanda hücre özel optik kontrol protez için bir klinik translasyonel yolu açabilir olmayabilir olan hassas dirençli beyin bozuklukları gelişmiş tedavi sağlar. Son olarak, burada açıklandığı gibi bu tür cihazların kolaylaştırabilir tam-zamanlı kolay bir kullanıcı tarafından özelleştirilebilir moda 3 boyutlu yapılar için bu tür kök hücreler ve farmakolojik ajanlar gibi diğer taşıma kapasitesi, akışkan teslimat,.

Nöral devreleri kontrol ve analiz<em&gt; In vivo</em&gt; 3 boyutlu kümeler beyin bölgelerinde istenilen virüs ve diğer reaktifler teslim bir teknoloji ile daha da kolaylaşabilir. Biz karmaşık beyin devrelerinin optik manipülasyonu sağlayan akışkan enjektör dizi özelleştirilmiş imalat, ve viral kodlanmış optik duyarlaştırıcılar teslim göstermektedir.

Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler

Sinir devrelerinin; duyumu, düşünceyi, duyguyu ve eylemi destekleyen hesaplamaları nasıl yürüttüğüne ve nasıl bozulduğuna dair anlayışımız...

İki dikdörtgen akrilik parça lazerle kesilir ve ardından stereotaksik klempi oluşturacak şekilde birleştirilir; bu klemp, enjektör dizisini stereotaksik düzeneğe göre sıkıca tutmaya yarar. Bir şırınga pompası, istenilen beyin devresi için polietilen tüplere bağlı şırıngalarla doldurulur. Fused silica tüplerin yerleştirileceği ve böylece enjektörlerin oluşturulacağı delikleri açmak için bir freze kullanılır.Enjektörler, klempe tersinir şekilde monte edilir ve ardından ilgilenilen beyin devrelerini hedefleyecek şekilde düzeltilir. Her bir enjektör, tek bir polietilen kanala bağlanmıştır. Sistemin kullanıma hazırlanması, şırıngalar aracılığıyla sistemin silikon yağı ile doldurulmasını ve ardından enjektörlere akışkan reaktiflerin yüklenmesini içerir.Ardından paralel enjektör beyin hedeflerine yerleştirilir ve reaktifler infüze edilir. Merhaba, ben MIT Sentetik Nörobiyoloji Grubu'ndan Stephanie Chan. Şimdiye kadar, uzamsal olarak karmaşık beyin devrelerinde gen ekspreslemek, ya transgenik hayvanların yavaş ve maliyetli bir şekilde oluşturulmasını ya da her seferinde tek bir tarafın yapılması gereken zahmetli viral enjeksiyon sürecini gerektiriyordu.Bugün sizlere, beyindeki karmaşık üç boyutlu desenlere sıvı iletebilen paralel bir enjektör dizisinin nasıl oluşturulacağını ve kullanılacağını göstereceğiz. Tüm hedeflere aynı anda ulaşmak için virüsleri bir dizi enjektör aracılığıyla paralel olarak ileterek devreye özgü transgenik fareleri hızla üretmek için bu diziyi kullanıyoruz. Enjektörümüz, herhangi bir sıvı reaktifi beyin bölgelerinin karmaşık bir dağılımına iletmek için kullanılabilir.Bugünkü amacımız, belirli devrelerdeki spesifik hücre tiplerini zamansal olarak hassas bir şekilde açıp kapatabilmek için ışığa duyarlı proteinleri kodlayan virüsleri iletmektir. Laboratuvarımızda bu teknolojiyi, ışığı devreye özgü bir şekilde ileten optik fiber dizileriyle birlikte kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.İlk olarak, enjektör dizisini tutan ve stereotaksik cihaza monte edilebilen bir stereotaksik klempi oluşturuyoruz. Klempi yapmak için şu malzemeler gereklidir: Bir ucu düzleştirilmiş, 1,5 milimetre dış çaplı (OD) iki inçlik çelik kanül, yaklaşık 0,5 x 0,5 santimetre boyutunda küçük bir PCB Protoboard parçası ve iki özdeş dikdörtgen.İki akrilik dikdörtgenin her biri, 1/8 inç kalınlığındaki akrilik levhadan 1/2 x 3/8 inç boyutunda kesilmelidir. Karşılıklı köşelerden iki adet dairesel delik açın. İlk deliğin çapı 1,5 mm olmalı ve metal kanülü sıkıca tutacak kadar küçük olmalıdır.İkinci deliğin çapı 1/16 inç olmalıdır. Metal kanülü bir dikdörtgenin 1.5 millimeter deliğine, ardından ikinci dikdörtgenin 1.5 millimeter deliğine yerleştirin; bir hokey sopası şekli oluşturmak için kanülün alt ucunu alt dikdörtgenin alt yüzeyiyle hizalayın ve iki dikdörtgen arasına ara parçayı yerleştirin. Bu işlem sırasında, ara parçayı iki dikdörtgen arasında sıkıca tutarken parçaları bir arada tutmak için modelleme kili kullanmak faydalıdır.Kanül ve 1,5 milimetrelik deliklerin etrafına sıcak silikon uygulayarak bu yapıyı birbirine sabitleyin. Silikon kuruduktan sonra ara parçanın dikdörtgenlere yapışmamasına dikkat edin. 1/16'lık deliğin üzerine 1/72'lik bir altıgen somun yerleştirin ve ardından dikdörtgenlerin karşı tarafından 1/72'lik bir vida sıkarak sabitleyin.Somunu dikdörtgene sabitlemek için kenarlarına küçük miktarlarda beş dakikalık epoksi damlatın. Epoksinin somun dişlerine veya vidaya girmemesine dikkat edin. Epoksi sertleştikten sonra, dikdörtgenlerin üst tarafındaki 1/16 inçlik deliğe bir 1-72 vida yerleştirin ve vidayı somuna vidalayın.Modelleme kilini kaldırın ve vidayı sıkarak ara parçasının yerinde sıkıca tutunduğunu doğrulayın. Enjektör dizisi sistemi, beyindeki hemen hemen her koordinat setine göre özelleştirilebilir. Öncelikle, ilgili türün bir beyin atlasında istenen enjeksiyon bölgelerinin koordinatlarını belirleyin ve bunları stereotaksik cihaz tarafından kullanılan uygun koordinatlara dönüştürün.Bu gösterimde bir fare kullanacağız ve üç enjeksiyon bölgesi olacak, dolayısıyla enjektörler için üç tüp bulunacaktır. X, y ve Z koordinatları, bir fare beyin atlasının medial lateral, anterior, posterior ve/veya ventral koordinatlarına karşılık gelecektir. Ardından, Harvard Apparatus'tan alınan şu örneğe benzer bir enjeksiyon geri çekme şırınga pompasına üç adet 10 µL'lik Hamilton şırıngası yerleştirin; her bir Hamilton şırıngasının iğnesine, her bir polietilen tüp için doksan santimetrelik polietilen tüp parçalarını güvenli bir şekilde sabitleyin.Bir F 2 52 tüp kovanını açık uca geçirin ve P 2 35 somun ile P 200 fal kullanarak bir P 6 27 tüp adaptörüne bağlayın. Özelleştirilmiş enjektör dizisini oluşturmak için, 1/32 inç kalınlığındaki bir PCB protoboard alanına üç delik açmak üzere bir modela mini mill ve 0,011 inç çaplı bir matkap ucu kullanın. Üç deliği, kartı frezeden çıkarmadan önce enjeksiyon bölgelerinin ilgili X ve Y koordinatlarına göre açın; ardından 1/32 inç çapındaki bir matkap ucu kullanarak küçük deliklerin etrafına dikdörtgen şeklinde bir alan açın.Ardından, her bir enjektör, sıkıca tutunmalarını ve birbirlerine paralel olmalarını sağlamak için her bir deliğe yarıya kadar yerleştirilir. Enjektör dizisini oluşturmak için onları levhaya epoksi ile sabitleyin. Enjektör dizisini stereotaksik klemense takmak için.Protoboard'un bir köşesini akrilik dikdörtgenlerin arasına yerleştirin ve stereotaksik kelepçenin vidasını sıkın. Ardından, kelepçenin metal kanülünü, stereotaksların bağlantı mekanizmasını kullanarak stereotaksa sabitleyin. İzleyen adımlar, diğer enjektörlere çarpmadan düz bir kenarla yandan yaklaşılabilen dış enjektörlerden biri için mikroskop altında gerçekleştirilir.Protoboard'un alt kısmının ötesine uzanan ucu kesin. Ucu bir dremel aleti ile düzleştirin. Ardından, stereotaksik kolun menzili içinde sabit bir referans noktası seçin ve enjektör dizisini, dış enjektörün düzleştirilmiş ucunun bu referans noktasında olacağı şekilde hareket ettirin.Kendi koordinatlarıyla birlikte ikinci bir enjektör seçin. Enjektör dizisini, birinci ve ikinci enjektör koordinatları arasındaki yükseklik veya Z yönündeki bağıl fark kadar Z ekseni boyunca hareket ettirin. Bu ikinci enjektörü, ucu referans noktası yüksekliğine gelecek şekilde kesin ve bir Dremel aleti ile düzleştirin.Enjektör ucu ile referans noktasının karşılaştırılmasını kolaylaştırmak için enjektör dizisi X ve Y yönlerinde hareket ettirilebilir. Geriye kalan enjektörler için bu düzeltme işlemi tekrarlandıktan sonra, enjektör dizisi tüm sisteme monte edilmeye hazır hale gelir. Tüm sistemin montajı, önceden oluşturulmuş stereotaktik klempi ve özelleştirilmiş enjektör dizisini gerektirir.Enjektör dizisi sterilize edildikten sonra, her bir enjektörün kırpılmamış olan arka ucunu mavi bir F two 40 tüp kılıfına yerleştirin. Bir P 2 35 somun ve P 200 ferrule kullanarak, enjektörün arka ucunu polietilen tüp aracılığıyla Hamilton pompasına halihazırda bağlı olan dişli adaptöre sabitleyin. 27 gauge bir iğne ile, tüm sistemin Hamilton şırıngalarından enjektör uçlarına kadar tamamen dolmasını sağlayacak şekilde Hamilton şırıngalarının arkasından steril silikon yağı enjekte edin.Hava kabarcığı oluşmamasına çok dikkat edilmelidir, aksi takdirde enjekte edilen virüs hacmi yanlış olacaktır veya virüs hiç enjekte edilemeyebilir. Hamilton şırıngaları Hamilton pompasına yerleştirilirken, şırıngalarda mümkün olan en yüksek silikon yağı hacmi korunur. Deneyin ikiden fazla şırınga gerektirmesi durumunda, burada yaptığımız gibi Hamilton pompasına ara parçalar yerleştirilebilir.Alternatif olarak, bir seferde 10 şırıngaya kadar tutabilen çoklu raf yükseltme kiti Harvard apparatus'tan satın alınabilir. Virüsü fare beynine enjekte etmek için, hayvan protokolünüze uygun şekilde analjezikler uygulayarak başlayın. Anestezi altındaki fareyi stereotaksik cihaza yerleştirin ve hayvanın yeterince anestezi aldığını ayak parmağı sıkıştırma testiyle doğrulayın.Ardından, gözlerin arasından kulakların arasına kadar derinin orta hattı boyunca tek bir insizyon yapın. Kafatasını açığa çıkarmak için deriyi geri çekin ve fasyayı temizleyin. Stereo mikroskoba uçlu bir cam pipet takın.Kulak çubuklarının konumlarını, bgma ve lambda aynı yüksekliğe hizalanana ve bunları birbirine bağlayan çizgi stereoaks cihazının Y eksenine paralel olana kadar ayarlayın. Cam pipetin ucu bgma üzerindeyken stereoaks cihazını sıfırlayın ve ardından ucu, enjeksiyon bölgelerinden birinin x ve Y koordinatlarında, kafatasının biraz üzerine konumlandırın. Bir diş matkabı kullanarak, çok ince bir kemik tabakası kalana kadar kafatasını ucun altından dikkatlice delin; ardından 30 gauge bir iğne ile, dura materi açığa çıkarmak için doğru x ve y koordinatlarındaki tabakadan küçük bir parçayı nazikçe kaldırın.Bu delik, enjektörlerden birinin bu şekilde sığabileceği kadar büyük olmalıdır. Kafatasında, her bir enjeksiyon bölgesine karşılık gelen x ve y koordinatlarında 0.25 milimetre genişliğinde küçük delikler açılır. Delme işlemi tamamlandıktan sonra, cam hizalama pipeti atılır ve özelleştirilmiş enjektör dizisi, stereotaksik klempi kullanarak stereotaksa takılır.Enjektör dizisinin açısını doğru şekilde ayarlamak için, belirli bir referans noktasına göre kalibre edilecek iki dış enjektör seçin. Enjektörlerden biri referans noktasıyla eşleştirildikten sonra, bu enjektörün enjeksiyon bölgeleri ile diğerleri arasındaki bağıl X ve Y mesafelerini dikkate alın. Enjektör dizisini, bu bağıl mesafeler kadar x ve y yönlerinde hareket ettirin. Eğer ikinci enjektör referans noktasıyla hizalanmamışsa, metal kanül gevşetilir ve döndürülür.Enjektör dizisi doğru açılanana kadar bu işlemi tekrarlayın. Hamilton pompasının doldurma hızını dakikada bir mikrolitreye ayarlayın ve şırıngalar iki mikrolitre noktasına veya daha fazlasına ulaşana kadar enjektörleri silikon yağı ile doldurun. Bu işlem, uçtaki hava kabarcıklarının veya tıkanıklıkların, daha önce açıklanan yöntemle şırıngaların arkasından tüm sistemi silikon yağı ile yeniden doldurmaya gerek kalmadan, Hamilton pompası kullanılarak yağın ileri itilmesiyle kolayca giderilebilmesi için yeterli miktarda yedek yağ sağlar.Kafatası üzerine temiz bir parafilm parçası yerleştirin ve enjektörleri yavaşça parafilmin üzerine indirin. Her bölgeye bir mikrolitre virüs iletilmesi planlanıyorsa, her bölge için dakikada bir mikrolitre olan aynı dolum hızıyla parafilmin üzerine 1,5 mikrolitre virüs pipetleyin. Her bir enjektöre 1,2 mikrolitre virüs doldurun.En uzun enjektörün ucunu bgma'da sıfırlayın ve ardından enjektör dizisini o enjektörün x ve Y koordinatlarına kaydırın. Z derinliğini düzeltmek için enjektör dizisini 30 gauge iğnelerle açılan küçük deliklerden aşağı indirin. Her bir enjektör üzerinden dakikada 0,1 µL veya daha yavaş bir hızla bir µL virüs enjekte edin.Enjeksiyonların yayılması için 30 dakika boyunca bekleyin. 30 dakika sonra, enjektör dizisini beyinden yavaşça çıkarın. Ardından, her bir enjektörde tıkanıklık olup olmadığını kontrol etmek için Hamilton pompasını dakikada 0,1 µL hızda infüzyon yapacak şekilde ayarlayın.Ardından, iki mikrolitre etanolü dakikada iki mikrolitre hızla yeniden doldurup infüze ederek enjektörleri temizleyin. Son olarak, her bir Hamilton şırıngasındaki iki mikrolitrelik tampon bölgeyi korumak için enjektörleri silikon yağı ile yeniden doldurun. Bu şekil, fare beyninin farklı bölgelerine viral reaktifler iletmek için az önce gösterilen ve üç kanül içeren enjektör dizisinin kullanım sonucunu göstermektedir.Bu durumda, virüsün genetik yükü floresan molekül GFP'yi içerir ve bu da tek bir adımda işaretlenmiş hücrelerin üç floresan hacmiyle sonuçlanır. Prensip olarak, bir virüs enjektör dizisi oluşturmak için rastgele sayıda kanül kullanılabilir. Burada, örneğin, hipokampusun ca1 bölgesini bilateral olarak hedeflemek için uygun olan 16 enjektörlü bir enjektör dizisi yer almaktadır.Bugün size gösterdiğimiz protokolü kullanarak, beyne üç boyutlu bir desenle virüs iletebilir ve etkili bir şekilde devre düzeyinde transgenikler oluşturabilirsiniz. Ayrıca, paralel enjektör dizisi, herhangi bir sıvı reaktifi beyne iletmek için kullanılabilir; bu da örneğin, başı sabitlenmiş davranış sergileyen bir hayvanda, spesifik nöral devrelere dopaminerjik agonistlerin desen şeklinde iletilmesine olanak sağlayabilir. İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

scalable-fluidic-injector-arrays-for-viral-targeting-intact-3-d-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu makalede, 50 mikron lümen cam kılcal iğneler yapmak için bir yöntem gösteriyor. Bu teknik, beyin hasarı önemli ölçüde azaltır, ilaç pasif difüzyon en aza indirir ve kemirgen beyin içine hassas bir hedefleme sağlar.

İlaçlar, Viral Vektörler, veya Hücre Transplantasyon teslimi için Microinjections Derin Beyin Yapıları Hedefleme

Burada görsel korteks nöronlar ve glia floresan etiketlenmesi için AAV vektörleri intrakranial enjeksiyon sunuyoruz.

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Kaynak: Pereira, M. et. al., Viral Vektörlerin İntraserebral Enjeksiyonu ile Yerleşik Glial Hücrelerin İnternöronlara İn Vivo Doğrudan Yeniden Programlanması. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, Cre'ye bağımlı nöronal yeniden programlama ve floresan raportör genleri glial hücrelere iletmek için transgenik bir farenin serebral korteksine adeno-ilişkili bir virüsün stereotaksik enjeksiyonunu göstermektedir.

Bir fare modelinde glial hücre yeniden programlaması için viral vektörlerin stereotaksik enjeksiyonu

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz.  Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Beyin de in vitro veya ektopik analizler tarafından temsil edilmeyen nitelikleri ile benzersiz bir sitedir. Tekrarlanabilir bulunduğu yere ve büyüme özelliklerine sahip Ortotopik fare modelleri güvenilir bir stereotaksik tespit aracı ve bir düşük basınç şırınga pompası kullanılarak kafatası içine uygulanan enjeksiyonları ile oluşturulabilir.

Oluşturma Anatomik Doğru ve İnsan Beyin Tümörleri Reproducible İntrakraniyal Ksenograftlar

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Burada, biz manyetik rezonans göstermektedir (Mr)-güdümlü konveksiyon gelişmiş teslim (Ced) viral vektörler içinde korteks içine etkili ve basitleştirilmiş bir yaklaşım olarak makak beynin büyük kortikal alanlarda arasında optogenetik ifade elde etmek.

Online MRG görüntüleri rehberlik altında Rhesus Macaque korteks için optogenetik Adeno-ilişkili Viral vektör konveksiyon geliştirilmiş teslim

Burada açıklanan, açılı bir koronal yaklaşım kullanarak zorlu ve ulaşılması zor beyin bölgelerini (mekansal sınırlamalar nedeniyle) hedef alabilen stereotaktik bir prosedürdür. Bu protokol hem fare hem de sıçan modellerine uyarlanabilir ve kanül implantasyonu ve viral yapıların mikroenjectionları da dahil olmak üzere çeşitli nörobilimsel uygulamalara uygulanabilir.

Çok Yönlü Nörobilim Teknikleri için Uyarlanabilir Açılı Stereotaktik Yaklaşım

Bu protokol, beyin dilimlerinde tek nöral kök hücre ve nöroniçine mikroenjeksiyon için robotik bir platform kullanımını göstermektedir. Bu teknik çok yönlüdür ve yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip dokudaki hücreleri izleme yöntemi sunar.

Robotik Mikroenjeksiyon Kullanarak Beyin Dilimlerinde Tek Nöral Kök Hücre ve Nöronların Manipülasyonu

Şu anda uygulandığı gibi, insan olmayan primatlarda optogenetik, viral vektörlerin beyne enjekte edilmesini gerektirir. Optimal bir enjeksiyon yöntemi güvenilir olmalı ve birçok uygulama için, postmortem histolojide kolayca ve açık bir şekilde tanımlanan keyfi derinlikteki bireysel bölgeleri hedefleyebilmelidir. Bu özelliklere sahip bir enjeksiyon yöntemi sunulmaktadır.

Anestezi Uygulanmış ve İnsan Dışı Primat Beyne Uyanan Optogenetik için AAV Vektörlerinin Enjeksiyonları

Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, serbestçe davranan farelerde nöronal dinamikleri ve mikro devreleri incelemek için güçlü bir tekniktir. Bu protokol, bir miniskop kullanarak iyi in vivo kalsiyum görüntüleme elde etmek için beyin ameliyatları yapmayı açıklar.

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

Öğrenin, paralel akışkan enjektör dizisi kullanarak bozulmamış 3-D beyin devrelerine viral teslimatı nasıl gerçekleştirilir. Bu yöntem, optogenetik manipülasyon ve sinir devresi analizi için transgenik fare modellerinin hızlı oluşturulmasını sağlar.

Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler

Daha fazla video keşfet