Derin Kortikal Katmanlar bir micropism kullanarak in vivo Görüntüleme

Fare neokorteks takılı sağ açılı microprisms genellikle dilim içinde bulunan bir bakış açısı ile birden fazla kortikal katmanları derin görüntüleme için izin verir. Bir milimetrelik microprisms geniş bir alan-view (~ 900 mm) ve dendritik dikenler çözmek için yeterli uzaysal çözünürlük sunuyor. Biz katmanı V nöronal görüntüleme ve microprisms kullanarak neokortikal vasküler görüntüleme göstermektedir.

Floresan Mikroskopi teknikleri, özellikle beyin dokusu gibi yüksek ışık saçan malzemelerde, dokunun derinliklerindeki yapıları görüntüleme konusunda sınırlı bir yeteneğe sahiptir. İki foton mikroskobu durumunda bile, neokortikal yüzeyden 500 mikrondan daha derin olan nöral yapıların yüksek kaliteli in vivo görüntülerini üretmek çok zor olabilir. Burada yeşil çizgi 500 mikronluk bir derinliği gösterir.

Genel olarak, neokortikal tabaka dört, beş ve altıncı yüzeyden 500 mikrondan daha büyüktür. Neokortekse yerleştirilen bir milimetrelik cam mikro prizmanın, ışığı yüzeysel ve derin kortikal katmanlara nasıl girip çıkarabileceğini göstereceğiz. Bu tekniği bir farede kullanarak, bir milimetrelik bir görüş alanına sahip olmak ve altı kortikal katmanın tümünü, tipik olarak yalnızca dilimlenmiş beyin dokusunda bulunan bir görüntüleme perspektifinde aynı anda görselleştirmek mümkündür.

Mikro prizmalar, dendritik dikenleri ve mikro kılcal damarlardan kırmızı kan hücresi akışını çözebilen uzamsal çözünürlükleri korurken, uzun apikal dendritleri ve neokorteksteki karmaşık kan damarı ağı ile beşinci katman parametal hücre gövdelerini görselleştirebilen geniş bir görüş alanı sunar. Benim adım Thomas Chia ve Yale Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nde Profesör Michael Levine'in laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim. Bu videoda tartışacağımız protokol, bir fare neokorteksinde bir milimetre derinliğindeki yapıların floresan görüntülerini oluşturmak için bir milimetre dik açılı cam mikro prizmaların nasıl kullanılacağı üzerine olacaktır.

Kullandığımız Mikro prizmalar, Opto Sigma Corporation'dan satın alınan BK yedi camdan yapılmış bir milimetre dik açılı prizmalardır. Mikro prizmalar mümkün olduğunda forseps kullanılarak ele alınır. Mikro prizmanın hipotenüsü, 400 ila 2000 nanometre arasında% 97'den daha büyük bir yansıtma sağlamak için geliştirilmiş gümüş ile kaplanmıştır.

Bu, hem lazer uyarma ışığının hem de kabul edilen floresanın iç yansımasını sağlar. Küçük hayvan görüntüleme yeteneğine sahip özel yapım iki foton mikroskobu kullanıyoruz. Stereotaktik bir cihaza bağlı hayvan, üç eksenli motorlu bir sahneye yerleştirilir.

Mikroskop, tarama görüntüsünü çalıştıran bir Windows PC'ye bağlanır. Yazılım tarama görüntüsü, Polo Gudo ve diğerleri tarafından MATLAB'da yazılmış görüntü elde etme yazılımıdır. Mikro prizma görüntüleme için 10 24 x 10 24 veya beş 12 x beş 12 piksel çözünürlükte görüntüler topluyoruz.

Ek olarak, genellikle satır başına iki milisaniye veya satır başına dört milisaniye tarama yaparız. Bu protokolün önemli bir yönü, mikro prizmalarla birlikte kullanılan mikroskop objektiflerinin türüdür. Deneylerde iki tür amaç kullanılmıştır.

Soldaki objektif, geniş görüş alanları görüntüleme için düşük sayısal açıklıklı bir hava objektifidir, bu durumda dört x 0,28 NA Olympus objektifidir. Sağdaki objektif, sıfır ila iki milimetre camın neden olduğu küresel sapmaları en aza indirebilen bir cam düzeltme bileziğine sahip 40 x 0,60 yüksekliğinde bir NA hava objektifidir. Fareyi ameliyata ve mikro prizmanın yerleştirilmesine hazırlamak için ilk adım, hayvanı cerrahi prosedürler için uygun bir seviyeye uygun şekilde uyuşturmaktır.

İlk olarak, hayvanın ağırlığı belirlenen doza göre kaydedilir. Uygun miktarda bir ketamin ve ksilazin kokteyli bir şırıngaya çekilir. Anestezik ilaçlar, 28 gauge iğne kullanılarak bir IP enjeksiyonu yoluyla verilir.

Fare cerrahi prosedürler için uygun bir anestezi düzlemindeyken, hayvanın kafasındaki kılların çoğu 40 numara bıçaklı bir titreme kullanılarak tıraş edilir. Daha sonra, mikro prizmanın önüne geçebilecek tüylerden arındırılmış bir yüzey oluşturmaya yardımcı olmak için kafada kalan kıllara nare uygulanır. Görüntüleme sırasında, beş Dakika sonra, NA pamuk uçlu bir çubukla temizlenir, anestezi uygulanmış hayvan uygun şekilde bir fare stereotaktik cihazına yerleştirilir.

Cerrahi prosedürler ve görüntüleme seansları sırasında hayvan, 36 santigrat dereceye ayarlanmış su dolu bir ısıtma yastığı üzerinde tutulur. Hayvanın kafası düzgün bir şekilde yerine sabitlendiğinde, kafatasının medial çizgisinden aşağı doğru temiz bir kesi yapılır. Cildi ayırmak için, pamuklu uçlu bir çubuğa az miktarda %3 Hidrojen peroksit yerleştirilir ve kafatası ile cilt arasındaki zarları temizlemek için kafatasına uygulanır.

Hidrojen Peroksit ayrıca, kraniyotominin nerede yapılacağını ve mikro prizmanın nereye yerleştirileceğini bilmede önemli bir dönüm noktası olan BMA'nın ortaya çıkmasına yardımcı olur. Kraniotomi başlamadan önce, kulak çubukları ve ısırma çubuğu, açıkta kalan kafatasını temel olarak masa ile aynı hizada olacak şekilde eğmek için uygun şekilde ayarlanır. Bu, kraniyotomi için daha iyi bir platform sağlar.

Kraniyotomiler için bir Dremel aletine küçük bir diş çapağı bağlanır. Hızı yaklaşık 7.000 ila 10.000 RPM olarak ayarladık. Diş çapağı, kemikte kare bir oluk oluşana kadar kafatası boyunca sıyrılır.

Meydanın kenarları yaklaşık iki ila üç milimetre uzunluğundadır ve ortalanmıştır. 1.5 milimetre coddle ve bir milimetre lateral rema, kafatasından küçük bir açıklık açılana kadar kemiği inceltmeye devam eder. Bir çift forseps kemik flebini kaldırabilir.

Mikro prizma kortekse yerleştirilmeden önce duranın çıkarılması gerekir. Kanama en iyi şekilde kanın yüzeyde birkaç dakika pıhtılaşmasına izin verilerek kontrol edilir. Daha sonra, prizmanın korteks ile hizalanmasına yardımcı olmak için pıhtılaşmış kan cerrahi bir sünger kullanılarak çıkarılır.

Mikro prizmanın dikey yüzü forseps üzerindeki kulplara paralel olarak sıralanmıştır. Prizma düzgün bir şekilde tutulduğunda, tüm mikro prizma, prizmanın üst kısmı neokortikal yüzeyle aynı hizaya gelene kadar yerleştirilir. Burada neokortekste duran prizmayı görebiliriz.

Doğru yerleştirildiğinde, mikro prizma uygun konumda kalmalıdır. Ortaya çıkan herhangi bir kanama minimaldir ve küçük bir cerrahi süngerle emilebilir. Prizma yerleştirildikten sonra, hayvan hayvanla görüntülemeye hazırdır.

Düşük büyütme objektifi altında, lazer rasterin beynin yüzeyindeki mikro prizma üzerinde tarandığı görülebilir. İşte sarı floresan proteini eksprese eden transgenik farelerden alınan görüntülerin bazı temsili örnekleri. Mikro prizmalar kullanılarak beşinci katman kortikal nöronlarda, beşinci katmanda, kortikal yüzeyin yaklaşık bir milimetre altında büyük parametal hücre gövdelerinin bir koleksiyonu görülebilir.

Ayrıca, cam düzeltme bileziği ile yüksek sayısal açıklıklı bir objektif kullanarak Tufts'a ayrılmadan önce tüm yüzeysel katmanlar boyunca uzanan apikal dendritler de görülür, bu durumda dendritik dikenleri çözmek mümkündür. Beşinci katman parametal nöronların apikal dendritlerinde, dendritik dikenler mikron altı yapılardır ve birkaçı görüntüde sarı ok uçları kullanılarak tanımlanmıştır. Kortikal kan damarları, yerleşik kuyruk damarı enjeksiyon teknikleri kullanılarak floresein dekstran gibi bir floresan boya ile de etiketlenebilir.

Bu tekniği kullanarak, derin katmanlardan PIA'ya doğru uzanan ve mikro kılcal damarlar ağını oluşturmak için dallanan daha büyük kalibreli damarlar görülebilir. Neokorteksteki bu hassas mikro kılcal damar ağı, yüksek sayısal açıklık objektifi kullanılarak en iyi şekilde takdir edilir. Ek olarak, çizgi taraması ile derin neokortikal kılcal damarlardan kırmızı kan hücresi hızını ve akısını ölçmek mümkündür.

Kırmızı çizgi, mikro prizmadan kılcal görüntü üzerindeki çizgi tarama desenini gösterir. Kırmızı kan hücreleri floresan boyayı almadıkları için koyu çizgiler olarak görünürler. Alttaki görüntü, bir AE'de uzamsal boyut ve diğerinde zamansal boyut olan bir çizgi taramasının sonucudur.

Bundan AE'ler, kırmızı kan hücrelerinin kılcal damar boyunca akısını ve hızını hesaplayabilir. Bir hayvanda bir mikro prizma kullanıldıktan sonra, birkaç kez tekrar kullanılabilir. Bununla birlikte, kalan biyolojik materyali çıkarmak için uygun şekilde temizlenmesi gerekir.

Bu, prizmanın küçük bir hacimde hidroklorik aside daldırılması ve ardından metanole daldırılmasıyla gerçekleştirilebilir. Temiz mikro prizma daha sonra özellik kullanımına kadar lens kağıdına sarılabilir. Bu, farelerde in vivo kortikal görüntüleme için mikro prizmalar kullanma protokolümüzü sonlandırıyor.

Bir görüntüleme deneyinde mikro prizmaların kullanılması nispeten basittir ve neokorteks üzerinde in vivo çalışmalar söz konusu olduğunda birçok avantaj sunar. Umarız bunu ilginç bir teknik olarak bulmuşsunuzdur ve gelecekte laboratuvarınızda kullanabileceğiniz bir tekniktir. İzlediğiniz için teşekkürler ve iyi şanslar.