Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

Bu protokol, maya lipidinin ana bileşenlerini hızlı bir şekilde analiz etmeyi sağlar. Maya hücrelerinin hasat edilmesi ve yıkanmasıyla başlar. Yıkanan hücreler bir ila iki kloroform, metanol karışımına yerleştirilir ve cam boncuklarla parçalanır.

Kloroform ve su ilavesi iki fazı ayırır. Organik faz toplanır, kurutulur ve lipit film daha sonra kütle spektroskopisinden önce depolanmak üzere kloroform içinde çözülür. Ekstrakte edilen lipitler kloroform ve metanol içinde amonyum hidroksit ile seyreltilir ve iç standartların bir karışımı eklenir.

Lipid çözeltisi artık doğrudan kütle spektrometresine enjekte edilebilir. Merhaba, ben Concordia Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ndeki Vladimir Teco'nun laboratuvarından Simon Bork. Bugün size kütle spektroskopisi kullanarak maya lipitlerini ölçmek için bir yöntem göstereceğim.

Bu prosedürü laboratuvarımızda, farklı büyüme koşulları altında maya lipidindeki değişiklikleri incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, resus önceden hazırlanmış donmuş maya peletlerini 1.6 mililitre buz, soğuk damıtılmış su içinde askıya alır ve 1.6 mililitre hücre süspansiyonunu yüksek hızlı cam santrifüj tüplerine aktarır.

Bu prosedür boyunca, ekstrakte edilmiş lipitlerle yapılan tüm manipülasyonların cam pipetler veya şırıngalar kullanılarak yapıldığını unutmayın. Plastikler büyük bir arka plan sinyali oluşturacağından, kloroform ile temas ederlerse, hücre süspansiyonuna bir ila iki oranında altı mililitre kloroform metanol karışımı ve bir einor tüpünde ölçülen 0.8 mililitre cam boncuk ekleyerek lipit ekstraksiyonunu başlatın. Suda asılı kalan kloroform, metanol ve maya için bir ila iki ila 0.8 oranı korunduğu sürece kesin hacimler kritik değildir. Girdap.

Hücre süspansiyonu ve cam boncuklar her seferinde bir dakika boyunca iki kez karıştırılır, iki mililitre kloroform ekleyerek ve hafifçe karıştırarak devam edin, ardından ara sıra karıştırarak oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Beş dakikalık inkübasyondan sonra, iki mililitre damıtılmış su ekleyin ve hafifçe karıştırın. Daha sonra, ara sıra karıştırarak oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Burada da, belirli bir hacimden ziyade kloroform, metanol ve su için iki ila iki ila 1.8 oranını korumak daha önemlidir. İkinci inkübasyon tamamlandığında. Oda sıcaklığında 3000 Gs'de beş dakika santrifüjleyin, bu ilk ekstraksiyondan elde edilen tüm süpernatanı yeni bir yüksek hızlı cam santrifüj tüpüne toplayın ve ikinci bir lipit ekstraksiyonu için kalan hücre peletlerine 3.2 mililitre kloroform ekleyin.

Eklenen kloroform ile hücre peletlerini her seferinde bir dakika boyunca iki kez vorteksleyin. Daha sonra 3000 Gs'de beş dakika santrifüjleyin Oda sıcaklığında, bu ikinci ekstraksiyondan süpernatanı, ilk ekstraksiyondan sonra toplanan süpernatana ekleyin. Daha sonra toplanan süpernatanları beş dakika santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında 3000 Gs'de, ekstrakte edilen lipitler şimdi daha düşük organik fazda çözülür. Üst sulu fazı atın ve alt fazı yeni bir yüksek hızlı cam santrifüj tüpüne aktarın. Kütle spektrometresi santrifüjünde daha temiz spektrumlar üretmek için, oda sıcaklığında 3000 Gs'de beş dakika boyunca organik faz ve tüm süpernatanı bir cam şişeye aktarmak.

Çözünmüş lipitleri nitrojen altında kurutun, kurutulmuş lipit filmi 500 mikrolitre kloroformda çözün ve numuneleri kütle spektrometresi ile analiz etmeye hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Ekteki yazılı protokolde bulunan tablo bir'de listelendiği gibi kloroformdaki lipitlerin standart bir karışımını hazırlayarak başlayın. Her lipit farklı bir sınıfı temsil eder.

Bu çözelti, ekstrakte edilen lipitlerin kütle spektrometresine enjeksiyonundan önce daha sonra kullanılmak üzere eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. Numunenin 10 mikrolitresi 10 mikrolitre standart lipit karışımı ile birleştirildi. Standart-numune oranının gerektiği gibi değiştirilebileceğini unutmayın.

Dakikada bir mikrolitre akış hızında çalışan bir nano elektrosprey kaynağı ile donatılmış bir mikro kütle Q ila F iki kütle spektrometresi kullanarak numune ve standart lipit karışımını çözün. Ayarlar, beraberindeki yazılı protokolün ikinci tablosunda detaylandırılmıştır. Q'dan F'ye kütle spektrometresinin yüksek çözünürlüğünün kullanılması avantajlı olsa da, zorunlu bir gereklilik değildir.

Kesin cihaz parametreleri kütle spektrometreleri arasında değişecektir. Veri toplandıktan sonra, kütle spektrumları yumuşatılır, arka plan çıkarılır ve tepe noktaları ortalanır. Son olarak, tepe listesini excel'e aktarın.

Ardından, her bir lipit camın tepe noktalarını iç standartlarına göre normalleştirin. Uygulamaya bağlı olarak, de izotop ve dekonvolüsyon gibi daha fazla son işlem yapılması gerekebilir. Bu yöntem, maya lipidinin ana bileşenlerinin hızlı ve derinlemesine belirlenmesini sağlar.

Burada, de izotop de kıvrımlı ve iç standardına göre normalleştirilmiş bir lipiti vurguladık. Az önce size maya lipitlerini nasıl izole edeceğinizi ve elektros ekran iyonizasyon kütle spektroskopisi kullanarak maya lipidini nasıl belirleyeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü uygularken, plastik kullanımından kaçınmayı ve numunenizi doğrusal konsantrasyon aralığında tutmayı unutmamak önemlidir.

Bu yöntem oldukça esnektir ve birimlerin çoğunda gerektiği gibi değiştirilebilir. Bu ekstraksiyon protokolü, ince tabaka kromatografisi ve çok boyutlu kütle spektroskopisi gibi diğer lipid analizi yöntemleri için de uygundur. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.