Name: Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-21T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Öğrenin maya lipidomlarını nicel olarak değerlendirmek için elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi yöntemini. Bu hızlı ve hassas teknik, lipid tanımlama ve ölçümünde geleneksel yöntemlere göre üstün duyarlılık sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alain Tessier değerli tavsiyelerde, tartışmalar ve teknik destek için minnettarız. Biz üstün hizmetler için Concordia Üniversitesi Biyolojik Kütle Spektrometresi Uygulamaları Merkezi kabul etmiş sayılırsınız. Bu çalışma CIHR ve Kanada NSERC hibe ile desteklendi. VIT CIHR Yeni Araştırmacı ve Genomik Concordia Üniversitesi Araştırma Başkanı, Hücre Biyolojisi ve Yaşlanma.

Gereç ve yöntem <ol><li> Maya suşları ve büyüme koşulları Yabani tip suşu BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) (% 1 maya özü,% 2 pepton,% 2 glukoz), zengin bir YEPD ortamda yetişmiştir . Hücreler, 30 ° C dönüş 05:01 &quot;balon hacim / orta hacimli&quot; oranı Erlenmeyer matara 200 rpm&#39;de sallayarak kültüre edildi. </li><li> Lipid çıkarılması için maya hücreleri Depolama <ol><li> 50 ml hücre kültür 3000 xg&#39;de 5 dakika santrifüj yoluyla toplandı. </li><li> Iki kez soğuk su ile yıkanır. <ol style=" list-style-type:lower-alpha;"><li> 25 ml buz gibi su içinde süspanse edin pelet </li><li> 3000 xg&#39;de 5 dakika santrifüj Pelet hücreleri </li></ol></li><li> Eppendorf tüp pelet ve transfer süspanse edin </li><li> Pelet, santrifüj yoluyla, kullanılıncaya kadar -80 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 16.000 xg, supernatant ve donma kaldırmak. (Beher izopropil alkol kullanan, sıvı nitrojen de kullanılabilir -80 dondurucuda muhafaza) </li></ol></li><li> Reaktifler Biyoteknoloji sınıf kloroform ve metanol, Sigma-Aldrich. Serbest yağ asitleri ve triaçilgliseroller Larodan (Malmö, İsveç) satın alındı. Fosfolipidlerin çeşitli türler - fosfatidilkolin, phosphatidylethanolamine fosfatidilinositol, fosfatidilserin, phosphatidic asit ve cardiolipins de dahil olmak üzere - Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, ABD) elde edilmiştir. Fisher, Teflon kaplı kapaklar ile Yüksek hızda cam santrifüj tüplerine. </li></ol> Lipid çıkarma Bu Bligh ve Dyer 8 tarafından açıklanan protokol bir değişiklik. Çıkarılan lipidler ile tüm manipülasyonlar cam pipetler veya şırınga kullanılarak yapılmalıdır; kloroform ile temas eden plastik geniş bir arka plan sinyali yaratacak. MeOH - H 2 kloroform 3. adımda O ve 2:2:1.8 - MeOH-H 2 O adım 7 korunmuş kloroform 1:2:0.8 oranları gibi kesin miktarlar sürece kritik değildir. <ol><li> Buz gibi distile H 2 O. 1.6 ml donmuş hücreleri yeniden süspanse </li><li> Yüksek hızda cam santrifüj tüplerine 1.6 ml hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Kloroform ve MeOH (1:2) karışımı ve cam boncuklar hücre süspansiyonu 0.8 ml 6 ml ekleyin. </li><li> Vortex cam boncuk, 1 dakika boyunca iki kez hücre süspansiyonu. </li><li> 2 ml kloroform ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> Ara sıra karıştırma ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> Distile H 2 O 2 ml ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> Ara sıra karıştırma ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 3000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Tüm sıvı faz yeni bir yüksek hızlı cam santrifüj tüpü içine toplayın. </li><li> 3.2 ml kloroform adım 9 hücre pelet ekleyin. </li><li> 1 dakika boyunca iki kez Vortex. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 3000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Adım 10 ile sıvı faz süpernatant ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 3000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Üst faz (sulu) yeni bir yüksek hızlı cam santrifüj tüpü içine atın ve alt (organik) faz transfer. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 3000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Bir cam şişenin içine tüm süpernatantı transferi ve azot gazı altında kuru. </li><li> -20 ° C&#39;de 500 kloroform ul ve mağaza lipid filmi çözülür </li></ol> Kütle spektrometresi Lipidlerin Analizi -% 0.1 ile kloroform (1:1) (v / v) amonyum hidroksit, kloroform lipid standartlarının stok karışımı olarak Tablo 1, yanı sıra MeOH bir stok solüsyonu başına önceden hazırlanmış olmalıdır. <ol><li> Enjeksiyon için, önce, Tablo 1&#39;de verilen lipitlerin standart karışımı 10 ul ile 10 ul bir örnek birleştirir. 01:01 kloroform, 200μL:% 0.1 NH 4 OH metanol. <ul><li> Örnek oranı standart gerektiği gibi değiştirilebilir. </li></ul></li><li> 1 ul / dk akış hızında bir nano-elektrosprey kaynak kodlu işletim ile donatılmış bir Micromass 2 Q-TOF kütle spektrometresi kullanarak lipidler giderin. <ul><li> Tam enstrüman parametreleri alet enstrüman değişecektir. Nano-elektrosprey kaynağı ile donatılmış bir Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, USA) için ayarları için Tablo 2&#39;ye bakınız. Biz, bir Q-TOF kütle spektrometresi tip yüksek çözünürlüklü avantajı olmasına rağmen, bu zorunlu değildir. </li></ul></li><li> Kazanılmasından sonra kütle spektrumları düzeltti, arka plan çıkarılır ve ortalanmış ve sonra pik listesini Excel&#39;e. Her lipid sınıfı doruklarına sonra kendi iç standart normalize edilirler. Uygulamaya bağlı olarak, deisotoping ve deconvolution olarak daha fazla post-processing gerçekleştirmek yapmak gerekli olabilir. </li></ol> Tablo 1. İç lipid standartları, konsantrasyonlardastandart karışımı ve bunların analizi için MS modu. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Lipid sınıf </td><td> Standart zinciri kompozisyon </td><td> Standart kütlesi </td><td> Konsantrasyon (mg / ml) </td><td> MS modu </td></tr><tr><td> Phosphatidic asit </td><td> 14:00 / 14:00 </td><td> 591,40 </td><td> 100 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Phosphatidylethanolamine </td><td> 14:00 / 14:00 </td><td> 634,45 </td><td> 200 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Fosfatidilinositol </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Fosfatidilserin </td><td> 14:00 / 14:00 </td><td> 622,37 </td><td> 40 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Kardiyolipin </td><td> 4x14: 0 </td><td> 619,92 </td><td> 100 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Serbest yağ asitleri </td><td> 19:00 </td><td> 297,28 </td><td> 100 </td><td> Negatif </td></tr><tr><td> Fosfatidilkolin </td><td> 14:00 / 14:00 </td><td> 650,48 </td><td> 100 </td><td> Olumlu </td></tr><tr><td> Triaçilgliseroller </td><td> 13:0 / 13:0 / 13:0 </td><td> 698,63 </td><td> 200 </td><td> Olumlu </td></tr></tbody></table> (Tablo 2). Aracı bir Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, ABD) ayarları, bir nano-elektrosprey kaynağı ile donatılmıştır. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Akış hızı </td><td> Koni gerilimi </td><td> Kılcal gerilimi </td><td> Çarpışma gaz </td></tr><tr><td> Pozitif mod </td><td> 1μl/min </td><td> -28 - </td><td> 3.0 kv </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Negatif modda </td><td> 1μl/min </td><td> 30 V </td><td> -3,2 Kv </td><td> 10 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lipokine%2C+a+lipid+hormone+linking+adipose+tissue+to+systemic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.</a> Cell. 134, 933-944 (2008).</li>
<li>Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+defines+the+interactome+of+the+major+ADP%2FATP+carrier+protein+of+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane.</a> J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).</li>
<li>Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signal+from+inside+the+peroxisome+initiates+its+division+by+promoting+the+remodeling+of+the+peroxisomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).</li>
<li>Russell, S. J., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of ageing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).</li>
<li>Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+storage+and+degradation+of+neutral+lipids+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).</li>
<li>Br&uuml, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp, F. T., Lehmann, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+biological+membrane+lipids+at+the+low+picomole+level+by+nano-electrospray+ionization+tandem+mass+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).</li>
<li>Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+%28ESI-MS%2FMS%29+analysis+of+the+lipid+molecular+species+composition+of+yeast+subcellular+membranes+reveals+acyl+chain-based+sorting%2Fremodeling+of+distinct+molecular+species+en+route+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
</ol>

Bu yöntem, maya lipidome hazır, ucuz malzemeler kullanılarak hızlı bir nicel değerlendirme sağlar. Bu lipitlerin lityum hidroksit ile amonyum hidroksit yerini tespit edilebilir olsa da, yöntemi, diacylglycerols, ergosterols ve ergosteryl esterleri hariç maya hücreleri bulunan lipid türlerinin çoğunun kimlik sağlar. Açıklanan yöntem konsantrasyonu doğrusallık büyüklüğü 2 ila 3 siparişleri (lipid türler bağlı olarak) yayılarak, mcg / ml olarak düşük konsantrasyonlarda lipid tanımlanması ve ölçülmesi sağlar. Fosfatidilinos...

nicel değerlendirme elektrosprey İyonizasyon kütle spektrometresi kullanarak maya lipidome

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipidler biyomoleküllerin ana sınıfları ve önemli roller zarı dinamikleri, enerji depolama oynamak ve sinyalizasyon<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Maya<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Açıklamalı genomu ve çok basit lipidome olan bir genetik ve biyokimyasal manipulable tek hücreli ökaryot, çok hücreli ökaryotlarda çeşitli lipid türlerin biyolojik fonksiyonları çalışmak için değerli bir model<sup&gt; 2,3,5</sup&gt;.<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zinciri esas olarak 16 veya 18 karbon atomu ve uzunlukları ya sıfır ya da bir derece doymamışlık Lipidlerin 10 ana sınıfı vardır<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Lipid tanımlanması ve ölçülmesi için mevcut yöntemler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi, ince tabaka kromatografisi, floresan mikroskopi ve MS tarafından takip gaz kromatografisi gibi iyi kurulmuş ama önce düşük hassasiyet, Lipidlerin yetersiz ayrı çeşitli moleküler formları, lipid derivitization gerektirir analiz, ya da oldukça zaman alıcı olabilir. İşte biz bu yapısal sınırlamaları, maya hücreleri lipid tüm tamamlayıcı tanımlanması ve ölçümü için anket-tarama ESI / MS kullanarak çözmek için bizim deneysel yaklaşımın ayrıntılı bir açıklama mevcut. Açıklanan yöntemi, veri toplama sürecinin hızlandırılması ve böylece büyük ölçüde, maya hücreleri kurtarıldı karmaşık lipid karışımları kromatografik ayırma gerektirmez. Bu yöntem, g / ml gibi düşük konsantrasyonlarda lipid tanımlanması ve ölçülmesi sağlar ve tüm maya hücreleri ve saflaştırılmış organelleri lipidomes değerlendirilmesi başarıyla tatbik edilmiştir. Lipidler çıkarma lipid analizi bu yöntemi kullanarak bütün maya hücreleri 2-3 saat sürer. Bu bir nano-elektrosprey kaynağı ile donatılmış bir Q-TOF kütle spektrometresi ayıklanır ve kurutulmuş lipitlerin her örneği çalıştırmak için sadece 5-10 dakika sürer.

Biz maya kullanarak anket-tarama elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI / MS) gibi çok sayıda lipid türlerinin belirlenmesi için yeni bir nicel lipidomics yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, şu anda, lipidler, hassasiyet ve hız çeşitli moleküler formları çözmek için yeteneği lipid tanımlanması ve ölçülmesi için kullanılabilir yöntemleri aşıyor.

Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

Lipitler, biyomoleküllerin ana sınıflarından biridir; membran dinamikleri, enerji depolama ve sinyal iletiminde önemli roller oynarlar1-4. Tomurcuklanan maya ...

Bu protokol, maya lipid profilinin ana bileşenlerinin hızlı bir şekilde analiz edilmesine olanak tanır. İşlem, maya hücrelerinin hasat edilmesi ve yıkanmasıyla başlar. Yıkanmış hücreler, bir iki oranındaki kloroform ve metanol karışımına yerleştirilir ve cam boncuklar kullanılarak lizize edilir.Kloroform ve su eklenmesi iki fazı birbirinden ayırır. Organik faz toplanır, kurutulur ve ardından lipid filmi, kütle spektroskopisi öncesinde saklanmak üzere kloroform içinde çözülür. Ekstrakte edilen lipidler, amonyum hidroksit ile kloroform ve metanolde seyreltilir ve dahili standartların bir karışımı eklenir.Lipid solüsyonu artık doğrudan kütle spektrometresine enjekte edilebilir. Merhaba, ben Concordia Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ndeki Vladimir Teco laboratuvarından Simon Bork. Bugün size kütle spektroskopisi kullanarak maya lipidlerini miktar belirleme yöntemini göstereceğim.Laboratuvarımızda, farklı büyüme koşulları altında maya lipidlerindeki değişimleri incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, daha önce hazırlanmış dondurulmuş maya peletlerini 1,6 mililitre buz gibi soğuk distile su içinde yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonun

a-quantitative-assessment-yeast-lipidome-using-electrospray

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada Saccharomyces cerevisiae protein kompleksleri tanımlamak için yeni bir nicel proteomik tekniği açıklar. Bu çalışmada, yüksek özgüllük ile bir ER protein, Scs2p bağlayıcı ortakları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi tarafından takip yakınlık arıtma ile birlikte SILAC yöntemi kullandık.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Cryolysis, üre solubilziation, HILIC fraksiyonasyon ve fosforile peptidlerin IMAC zenginleştirme kullanarak kantitatif fosforilasyon prosedürü açıklaması.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Lipid damlacıkları Hepatit C virüsü (HCV), dahil olmak üzere çeşitli patojenlere replikasyonu için önemli organellerdir. Bu ilişkili proteinler kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole edilmesi için bir yöntem tarif; bu tür virüs enfeksiyonu, çevresel stres veya ilaç tedavisi gibi koşullar, çeşitli altında kullanılabilir.

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Burada, floresan mikroorganizma ve tomurcuklanan Maya hücrelerinin floresans mikroskopisi görüntülerinin otomatik algılama ve niceliksel tanımı ile ilgili bir MATLAB uygulaması sunuyoruz.

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Burada, nötr lipitlerin ayrılması için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilen 14C-asetik asit ile mayanın metabolik etiketlemesi için bir protokol sunulmaktadır.

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ile peptitler ve proteinlerin analizi için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir.

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

Kararlı İzotop Standartlar ve Anti-Peptid Antikorlar (SISCAPA) kendi proteinler için vekilleri olarak peptidler kantitatif ölçüm sağlamak için kararlı izotop dilüsyon kütle spektrometresi (MRM-MS) ile peptitler çiftler yakınlık zenginleştirme yakalayın. Burada kısmen otomatik bir biçimde manyetik parçacıklar kullanarak protokol açıklar.

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

MALDI-TOF kütle spektrometresi başarıyla protein kinaz Pak2 aktivasyon amid hidrojen / döteryum değişimini izlemek için kullanılmıştır.

Pak2 Etkinleştirme Amid Hidrojen / Döteryum Alım Satım &amp; MALDI-TOF Kütle Spektrometre Analiz

Öğrenin maya lipidomlarını nicel olarak değerlendirmek için elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi yöntemini. Bu hızlı ve hassas teknik, lipid tanımlama ve ölçümünde geleneksel yöntemlere göre üstün duyarlılık sunar.

Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

Daha fazla video keşfet