Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Merhaba, ben Wisconsin Kan Merkezi'ndeki Kan Araştırma Enstitüsü'nden Akış Sitometrisi uzmanı Hope Campbell. Merhaba, ben Dr. Bonnie Dieter'in laboratuvarında lisansüstü öğrencisi olan STR Baso. Ben de Wisconsin Kan Merkezi'ndeki Kan Araştırma Enstitüsü'ndeyim.

Bugün, floresanla aktive edilen hücre ayıklama yöntemini kullanarak hücrelerin izole edildiği bir prosedür gerçekleştireceğiz. Bu prosedürü, lenfositlerin ve myeloid hücre popülasyonlarının fonksiyonlarını incelemek için laboratuvar ortamında kullanıyoruz. Hadi başlayalım.

Bu prosedürde, fare sitositlerinden B ve CD4 T hücreleri saflaştırılacaktır. Başlangıç hedef hücre sayısı, ihtiyaç duyulan hücre sayısı ve bu yöntemi kullanan cihazın geri kazanım oranı baz alınarak hesaplanmalıdır. B ve CD4 T hücreleri için tipik geri kazanım oranı %85 ila %90'dır. Başlangıç SP sitosit popülasyonu yaklaşık olarak %60 ila %70 B hücreleri ve %20 ila %30 T hücrelerinden oluşur.

Böylece, 100 × 10⁶ hücre ile başlarsanız, FACS işlemine başlamadan önce 50 ila 60 milyon B hücresi ve 20 ila 30 milyon T hücresi geri kazanabilirsiniz. Protokol için gerekli solüsyonlar ve reaktifler buz üzerine yerleştirilmelidir. Bunlar arasında %3 fetal calf serum içeren fosfat tamponlu salinden oluşan boyama tamponu, %3 fetal calf serum içeren Hank dengeli tuz çözeltisi veya HBSS içinde hazırlanmış 25 mM HEPES'ten oluşan süspansiyon tamponu, fetal calf serum içinde hazırlanmış 25 mM HEPES solüsyonu, boyama antikorları ve kompanzasyon boncukları yer almaktadır.

Bu protokol ayrıca şu malzemeleri ve reaktifleri gerektirir: 15 milliliter konik tüpler, 12 by 75 millimeter polistiren veya polipropilen akış tüpleri. Bir naylon hücre süzgeci, trien blue ve bir hemo cytometer; ayrıca bunu gerçekleştirmek için sıralama toplama tüpleri önceden hazırlanmalıdır.

Akış tüplerine 300 µL HEPES FCS çözeltisi veya 15 mL'lik konik tüplere 1 mL HEPES FCS çözeltisi ekleyin. Bunlar, toplama işlemi başlayana kadar buz üzerinde bekletilmelidir. İstenilen hücre popülasyonunun tek hücre süspansiyonunu oluşturarak işleme başlayın.

Bu prosedür kullanılarak izole edilen hücreler kültürlenecekse, tüm hücre hazırlama işlemleri bir doku kültürü kabininde gerçekleştirilmelidir. Steril teknik kullanarak, buz gibi soğuk boyama tamponu ekleyip tüpü birkaç kez tersyüz ederek hücreleri yeniden süspanse edin ve hücreleri bir kez yıkayın.

Ardından hücreleri 4 °C'de yaklaşık 250 ×g'de yedi ila sekiz dakika santrifüjleyin. Yıkama koşulları hücre tipine ve konsantrasyona göre değişiklik gösterebilir. Sitolojik örnekler için, 200 × 10⁶ hücreye kadar olan örnekleri 10 mL boyama tamponu ile yıkayın.

Hücre peleti bozulmayacak şekilde süpernatantı aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın. Ardından hücreleri, 100 µL başına en fazla 50 × 10⁶ konsantrasyonda, buz soğukluğundaki boyama tamponu içinde yeniden süspande edin. Hücre peletini, tüpü hafifçe sallayarak veya düşük hızda vorteksleyerek yeniden süspande edin.

Ardından, altı hücreden 0,25 ila 1 x 10 arasını buz üzerinde yeni bir 12 x 75 mm polistiren veya polipropilen akış tüpüne aktarın. Bunu, daha sonra boyanmamış kontrol örneği olarak kullanmak üzere kenara ayırın; ilk tüpe, istenen son konsantrasyona ulaşmak için hücre süspansiyonuna primer antikorlar ekleyin. Burada, B hücrelerini boyamak için PE Texas Red konjuge anti B220 antikorları, T hücrelerini boyamak için ise ZE konjuge anti TCR beta ve/veya 700 konjuge anti CD4 antikorları kullanılır; tüpün altına hafifçe vurarak veya yavaşça karıştırın.

Vorteksledikten sonra hücreleri buza yerleştirin ve karanlıkta 20 ila 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonu takiben, üst fazı dikkatlice uzaklaştırdıktan sonra, hücreleri 10 mililitre buz gibi soğuk süspansiyon tamponunda süspanse ederek ve daha önce olduğu gibi santrifüj ederek Resus ile yıkayın. Hücreleri ikinci kez yıkamak için bu adımı tekrarlayın.

Son olarak, hücreleri buz gibi soğuk süspansiyon tamponu içinde yeniden süspande edin. Primer antikorlar bir florofora doğrudan konjuge edilmemişse, hücre süspansiyonuna işaretli sekonder antikorlar veya konjuge strep AVID ekleyin ve inkübasyonu takiben hücreleri buz üzerinde, karanlıkta 20 ila 30 dakika boyunca tekrar inkübe edin. Hücreleri buz gibi soğuk süspansiyon tamponu ile iki kez yıkayın.

Hücreleri buz gibi soğuk süspansiyon tamponunda yeniden süspanse ettikten sonra, tripan mavisi gibi canlılık boyası ve hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu ve canlılığını belirleyin. İzolasyon sırasında ölmüş olabilecek hücre kümelerinin FACS cihazını tıkamasını önlemek için, süspansiyon tamponu ekleyerek hücre konsantrasyonunu mililitre başına 10 ila 20 × 10⁶ hücreye ayarlayın.

Prosedür ve boyama. Sıralama protokolüne başlamadan hemen önce hücreleri bir damlatma süzgecinden geçirin. Süzgecin gözenek boyutu hücre tipine göre seçilmelidir; sitler için 40 micrometer gözenek boyutuna sahip bir süzgeç kullanılır.

Hacme bağlı olarak, filtrelenmiş hücreleri 15 litrelik konik tüpe veya 12 x 75 milimetrelik akış tüplerine toplayın. Sitometre sıralama prosedürü için hazırlanırken hücreleri buz üzerinde bekletin. Tek renkli pozitif kontroller olarak BD comp bead'ler kullanılıyorsa, analizde kullanılan her renk için bir kontrol tüpü ve bir adet boyanmamış negatif kontrol tüpü hazırlayın.

Boncuk süspansiyonları iyice vortekslendikten sonra, kullanılan her renk ve negatif kontrol için 100 µL süspansiyon tamponuna, negatif ve pozitif boncuk süspansiyonlarından birer damla ekleyin. Ardından, her pozitif kontrol tüpüne bir µL etiketli antikor ekleyin. Bu deneyde, bir tüp PE Texas'Red B iki 20 antikorları kullanılarak hazırlanır.

Bir tüpte fit ETCR beta antikorları ve diğerinde lor 700 CD four antikorları kullanarak, tüplerin altına hafifçe vurarak karıştırın ve oda sıcaklığında, karanlıkta 15 ila 30 dakika inkübe edin. Boncukları iki mililitre boyama tamponu ile bir kez yıkayın ve 200 Gs'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı aspirasyon yoluyla uzaklaştırın ve boncuk peletini 200 ila 500 µL boyama tamponu içinde yeniden süspande edin.

Akış sitometresinin tampon çözelti kurulumu üreticiye göre değişiklik gösterir ve yalnızca uygun şekilde eğitim almış personel tarafından gerçekleştirilmelidir. Buradaki hücre ayıklama prosedürü BD defects aria kullanılarak gerçekleştirilecektir. Ayıklama işleminden önce, ayıklanacak hücre tipine bağlı olarak uygun nozulu seçin.

FACS aygıtı için mevcut uç boyutları 70 µm, 100 µm ve 130 µm'dir. Nozul boyutu, sort edilecek hücre boyutunun en az üç katı olmalıdır; lenfositler için 70 µm nozul seçilmiştir. Aseptik hücre sort işlemi, cihazın aseptik sort seçeneği kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Bu seçenek kullanılarak, kılıf yolunun tamamı üreticinin talimatlarına uygun olarak %70 ethanol ile dekontamine edilir. Kılıf filtrelerinin değiştirildiğinden ve PBS'in steril PBS ile yenilendiğinden emin olun. Sitometre kullanıma hazır olduğunda, içinde heaps FCS bulunan önceden soğutulmuş toplama tüplerini uygun toplama cihazına yerleştirin.

Mevcut toplama düzenekleri, iki adede kadar 15 ml'lik konik tüp, dört adet 12x75 mm'lik tüp veya dört adet mikrotüp alabilir. 1,5 × 10⁶ hücreden daha az toplamak için 12x75 mm'lik tüpleri; 1,5 × 10⁶ ile 4,5 × 10⁶ arasında hücre toplamak için ise 15 ml'lik konik tüpleri kullanın.

Uygun toplama cihazını ayıklama toplama haznesine yerleştirin. Çok renkli ayıklamalar için yan akışları yerleştirilen toplama cihazına yönlendirin. Sitometre, öncelikle dedektörler arasındaki spektral örtüşmeyi hesaba katacak şekilde kalibre edilmelidir.

Burada gösterilen örnek, fit E ve pe'nin emisyon spektrumları arasındaki örtüşmeyi örneklendirmektedir. Koyu gölgeli alanda gösterilen bu örtüşmeye spillover (sızıntı) denir. Burada PE sızıntısı fit E kanalında, fit e sızıntısı ise PE kanalında tespit edilecektir.

Bir floroforun başka bir kanalındaki kalıntı floresansını ortadan kaldırmak için bu taşmanın düzeltilmesi gerekir. Taşmanın düzeltilmesi işlemine kompanzasyon denir; manuel kompanzasyon gerçekleştirmek için sitometri yazılımını kullanarak, ileri saçılım FSC ve yan saçılım SSC'yi görüntülemek için bi-varyant bir grafik ve kullanılacak her florofor için bir histogram içeren bir şablon oluşturun.

Bu grafiklerin kurulum yöntemi kullanılan yazılıma göre değişiklik gösterir. Negatif kontrol tüpünü sitometrenin yükleme portuna yerleştirin ve örnek çalışırken veri alımını başlatın. İlgi duyulan popülasyonu ölçek üzerine yerleştirmek için FSC ve SSC değerlerini ayarlayın.

Ardından, negatif popülasyonu veya otofloresansı histogramın en sol kısmına yerleştirmek için floresan PMT ayarlarını düzenleyin. Negatif kontrol tüpünü kaydedin. Negatif kontrol tüpünü sitometre yükleme portundan çıkarın ve yerine ilk pozitif kontrol com tüpünü yerleştirin.

Şimdi veri toplama işlemini başlatın. Bu işlemi, her bir tüp için verileri kaydederek tüm pozitif kontrol tüpleri için tekrarlayın. Her bir pozitif kontrol için, histogramda kaydedilen olayların etrafına bir aralık kapısı (interval gate) veya kutu çizin.

Ardından, histogramın negatif kısmına başka bir aralık kapısı (interval gate) çizin. Manuel kompanzasyon yaparken, pozitiflerin medyanı negatiflerin medyanına eşit olana kadar ayarlayarak deneyde kullanılan her bir fluroforu dikkate alın. Medyanı ayarlamak için, her bir floresan parametre için medyanlar mümkün olduğunca yakın şekilde eşleşene kadar spektral örtüşme değerlerini yükseltin veya düşürün.

Pozitif ve negatif kontrol örneklerle belirlenen ayarları kullanarak, deneysel örnek için gait ayarlarını belirleyerek sıralama prosedürü için hazırlık yapın. Sıralanacak hücrelerin bulunduğu tüpü sitometre yükleme portuna yerleştirin ve saniyede 9.000 ile 10.000 olay hızında veri toplamaya başlayın. İleri saçılım ile yan saçılımı görüntülemek için bir nokta grafiği (dot plot) seçin.

İleri saçılma, hücre boyutunun genel bir göstergesidir ve x eksenine yerleştirilir; yan saçılma ise hücre granülaritesinin bir göstergesidir ve Y eksenine yerleştirilir. Şimdi ilgi duyulan popülasyonu kapılayın (gate). Kapılar belirlendikten sonra, sitometrenin yükleme portu sıcaklığının dört derece Celsius'a ayarlandığından emin olun.

Ardından deneysel örnek tüpünü yükleme portuna yerleştirin. Sıralama seçeneğine basın ve toplama işlemine başlayın; toplama tüpleri doldukça buz üzerinde tutulmalıdır. İstenen sayıda hücre toplanana veya örnek tüpü boşalana kadar sıralamaya devam edin.

Ardından, sıralama butonunu tekrar seçerek sıralamayı durdurun ve örneği yükleme portundan çıkarın. Sonra, toplama tüpünü doğrudan sitometrenin yükleme portuna yerleştirin ve 500 ile 1000 olay elde edin. T hücreleri için sıralamada kullanılan ayarların aynısı kullanıldığında, sıralama işlemi saflığı %21'den %99'a çıkarmıştır. B hücreleri için ise, %5 olan başlangıç B hücresi popülasyonu sıralama sonrası %98'e yükselmiştir.

Böylece, FACS kullanarak sitositlerden b ve t hücresi popülasyonlarının nasıl saflaştırılacağını göstermiş olduk. Tek hücre süspansiyonu oluşturulabildiği ve uygun antikorların mevcut olduğu durumlarda, FACS'ın herhangi bir hücre popülasyonunu saflaştırmak için kullanılabileceğini unutmayın. Ayrıca, floresan işaretleyicilerle genetik olarak işaretlenmiş hücreler, antikor kullanmaya gerek kalmadan kolayca saflaştırılabilir.

Ayrıca, deneyleriniz için her zaman uygun kontroller kullandığınızı hatırlayın; doğru florokromları kullandığınızdan emin olmak için akış sitometrisi lazer konfigürasyonunuzu her zaman kontrol edin ve popülasyonlarınızı düzgün bir şekilde çevreleyecek uygun kapılamalar (gate) kullandığınızdan emin olun. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.