Floresan Aktive Hücre Ayırma (FACS) Özgül Hücre Nüfus Arıtma

Merhaba, ben Wisconsin Kan Merkezi'ndeki Kan Araştırma Enstitüsü'nden Flow Sitometri uzmanından Hope Campbell. Merhaba, ben STR Baso, Dr.Bonnie Dieter'in laboratuvarında yüksek lisans öğrencisiyim. Ayrıca Wisconsin Kan Merkezi Kan Araştırma Enstitüsü'ndeyim.

Bugün, floresan aktive hücre sınıflandırması kullanarak hücreleri izole eden bir prosedür yapacağız. Bu prosedürü lenfositlerin ve miyeloid hücre popülasyonlarının işlevini incelemek için bir laboratuvarda kullanıyoruz. Başlayalım.

Bu prosedürde B ve CD'de dört T hücresi fare sitlerinden saflaştırılacaktır. Hedef hücrelerin başlangıç sayısı, ihtiyaç duyulan hücre sayısına ve bu yöntem kullanılarak makinenin geri kazanım oranına göre hesaplanmalıdır. B ve CD dört T hücreleri için tipik geri kazanım oranı %85 ila 90'dır. Başlangıç SP sit popülasyonu yaklaşık %60 ila 70 B hücresi ve %20 ila 30 T hücresidir.

Böylece, 100 çarpı 10 üzeri altı hücre ile başlarsanız, gerçeklere başlamadan önce 50 ila 60 milyon B hücresini ve 20 ila 30 milyon T hücresini geri kazanabilirsiniz. Protokol için gerekli olan çözeltiler ve reaktifler buz üzerine yerleştirilmelidir. Bunlar arasında %3 fetal buzağı serum süspansiyonu ile fosfat tamponlu salinden oluşan boyama tamponu, Hank'in dengeli tuz çözeltisinde hazırlanan 25 milimolar HEP'lerden oluşan tampon veya fetal buzağı serumu A içinde hazırlanan %3 fetal buzağı serum A, 25 milimolar hep B çözeltisi içeren HBSS, fetal buzağı serumu boyama antikorları ve kompanzasyon boncukları bulunur.

Bu protokol ayrıca aşağıdaki sarf malzemelerini ve reaktifleri gerektirir. 15 mililitre konik borular, 12 x 75 milimetre polistiren veya polipropilen akış tüpleri. Bunu yapmak için bir naylon hücre süzgeci trien blue ve bir hemo sitometre sıralama toplama tüpleri de önceden hazırlanmalıdır.

300 mikrolitrede tüpleri akıtmak için FCS çözeltisi veya 15 mililitrelik konik tüplere HEP'ler FFC S çözeltisinin bir mililitresi. Bunlar, toplama işlemi başlayana kadar buzun üzerine yerleştirilmelidir. İstenen hücre popülasyonunun tek hücreli bir süspansiyonunu oluşturarak başlayın.

Hücreler izole edilirse, bu prosedür kullanılarak kültürlenecektir. Tüm hücre hazırlığı bir doku kültürü başlığında yapılmalıdır. Steril teknik kullanarak, hücreleri bir kez yıkayın, buz gibi soğuk boyama tamponu ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek hücreleri tekrar askıya alın.

Daha sonra hücreleri yaklaşık 250 GS dört santigrat derecede yedi ila sekiz dakika santrifüjleyin. Yıkama koşulları hücre tipine ve konsantrasyonuna göre değişebilir. Sitler için, 10 mililitre boyama tamponu ile altı hücreye 10 kez 200 kata kadar yıkayın.

Hücre peletinin bozulmadan kalması için süpernatanı aspirasyon ile dikkatlice çıkarın. Daha sonra hücreleri, 100 mikrolitre başına 50 kez 10 ila altıya kadar bir konsantrasyonda buz gibi soğuk boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Tüpü hafifçe vurarak veya hafifçe girdaplayarak hücre peletini yeniden süspanse edin.

Daha sonra altı hücrenin 0.25 ila bir çarpı 10'unu buz üzerinde yeni bir 12 x 75 milimetre polistiren veya polipropilen akış tüpüne aktarın. Ve bunu daha sonra ilk tüpe boyanmamış kontrol numunesi olarak kullanmak üzere bir kenara koyun, istenen nihai konsantrasyonu elde etmek için hücre süspansiyonuna birincil antikorlar ekleyin. Burada, PE Texas'ın kırmızı konjuge anti B iki 20 antikoru B hücrelerini boyamak için kullanılırken, ZI konjuge anti TCR R beta ve veya 700 konjuge anti CD dört antikoru, tüpün dibini fiske vurarak veya ışıkla karıştırılmış T hücrelerini boyamak için kullanılır.

Girdap daha sonra hücreleri buzun üzerine yerleştirin ve karanlıkta 20 ila 30 dakika kuluçkaya yatırın. İnkübasyonun ardından, etiketli hücreleri Resüs ile yıkayın, süpernatantın dikkatli bir şekilde çıkarılmasından sonra, daha önce olduğu gibi 10 mililitre buz gibi soğuk süspansiyon, tampon ve santrifüj içinde süspanse edin. Hücreleri ikinci kez yıkamak için bu adımı tekrarlayın.

Son olarak, hücreleri buz gibi soğuk süspansiyon Tamponunda yeniden süspanse edin. Birincil antikorlar doğrudan bir floro dörtlüsüne konjuge değilse, hücre süspansiyonuna eşlenik olarak etiketli ikincil antikorlar veya strep AVID ekleyin ve tekrar hücreleri, inkübasyonu takiben 20 ila 30 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri buz gibi soğuk süspansiyon tamponu ile iki kez yıkayın.

Resustan sonra hücreleri buz gibi soğuk süspansiyon tamponunda askıya alın. Trian mavisi ve hemo sitometre gibi hayati bir boya kullanarak hücre konsantrasyonunu ve canlılığını belirleyin. Faks makinesinin izolasyon sırasında ölmüş olabilecek hücre kümeleriyle tıkanmasını önlemek için süspansiyon tamponu ekleyerek hücre konsantrasyonunu mililitrede 10 ila 20 kez 10 ila altıncı hücreye ayarlayın.

Prosedür ve boyama. Sıralama protokolüne başlamadan hemen önce hücreleri bir damlama süzgecinden süzün. Süzgecin gözenek boyutu hücre tipine bağlı olarak seçilmelidir, sitler için 40 mikrometre gözenek boyutuna sahip bir süzgeç kullanılır.

Filtrelenmiş hücreleri, hacme bağlı olarak 15 litrelik konik bir tüpte veya 12 x 75 milimetre akış tüplerinde toplayın. Ve sitometre sıralama prosedürü için kurulurken hücreleri buzun üzerine yerleştirin. BD comp boncuklarını tek renk pozitif kontroller olarak kullanıyorsanız, tahlilde kullanılan her renk için bir kontrol tüpü ve lekesiz bir negatif kontrol tüpü hazırlayın.

Boncuk süspansiyonlarını iyice girdapladıktan sonra bir tane ekleyin, negatif ve pozitif boncuk süspansiyonlarının her birini, kullanılan her renk ve negatif kontrol için 100 mikrolitrelik bir süspansiyon tamponuna bırakın. Daha sonra, her pozitif kontrol tüpüne etiketli antikorun bir mikrolitresini ekleyin. Bu deneyde, PE Texas'Red B iki 20 antikoru kullanılarak bir tüp hazırlanır.

Biri uygun ETCR beta antikorları ve diğeri lor 700 CD kullanan dört antikor, tüplerin dibini fiske vurarak karıştırılır ve oda sıcaklığında karanlıkta 15 ila 30 dakika inkübe edilir. Boncukları iki mililitre boyama ile bir kez yıkayın, tamponlayın ve 200 Gs'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspirasyonla çıkarın ve boncuk peletini 200 ila 500 mikrolitre boyamada yeniden süspanse edin.

Akış sitometresinin tampon kurulumu üreticiye bağlı olarak değişir ve yalnızca uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından yapılmalıdır. Buradaki hücre sıralama işlemi, BD kusurları aria kullanılarak gerçekleştirilecektir. Sıralamadan önce, sıralanacak hücre tipine bağlı olarak uygun nozulu seçin.

Gerçekler aria için mevcut boyutlar 70 mikrometre, 100 mikrometre ve 130 mikrometredir. Meme boyutu, lenfositler için sıralanacak hücrenin boyutunun en az üç katı olmalıdır, 70 mikrometre meme seçilir. Aseptik hücre sınıflandırması, cihazın aseptik sıralama seçeneği kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Bu seçeneği kullanarak, tüm kılıf yolu, üreticinin talimatlarına göre %70 etanol ile dekontamine edilir. Kılıf filtrelerini değiştirdiğinizden ve PBS'yi steril PBS ile değiştirdiğinizden emin olun. Sitometre kullanıma hazır olduğunda, yığın FCS içeren önceden soğutulmuş toplama tüplerini uygun toplama cihazına yerleştirin.

Mevcut toplama cihazları iki adede kadar 15 mililitrelik konik tüp tutabilir. Dört adet 12 x 75 milimetre tüp veya dört mikro tüp. 1,5 kattan daha azını toplamak için 12 x 75 milimetre tüpler, altıncı hücrelere 10 ila 1,5 kat, altı ila 4,5 çarpı, altıncı hücrelere 10 ila 15 mililitre konik tüpler kullanın.

Uygun toplama cihazını sıralama toplama haznesine yerleştirin. Çok renkli sıralamalar için yan akışları kurulu toplama cihazına yönlendirin. Sitometre önce dedektörler arasındaki spektral örtüşmeyi hesaba katacak şekilde kalibre edilmelidir.

Burada gösterilen örnek, fit E ve pe'nin emisyon spektrumları arasındaki örtüşmeyi göstermektedir. Koyu gölgeli alanda gösterilen bu örtüşmeye yayılma denir. Burada PE yayılması fit E kanalında tespit edilecek ve fit e yayılması PE kanalında tespit edilecektir.

Bu yayılma, bir kat dördüncüsünün başka bir kanalda kalan floresansını ortadan kaldırmak için düzeltilmelidir. Yayılmayı düzeltme işlemine, manuel telafi gerçekleştirmek için tazminat denir. İleri saçılma FSC'sini ve yan saçılma SSC'sini görüntülemek için iki değişkenli bir çizim ve kullanılacak her fluro için bir histogram içeren bir şablon oluşturmak için sitometri yazılımını kullanın.

Bu grafikleri kurma yöntemi, yazılıma bağlı olarak değişir. Negatif kontrol kom tüpünü sitometrenin yükleme portuna yerleştirin ve numune çalışırken veri toplamaya başlayın. FSC ve SSC'yi, ilgilenilen popülasyonu ölçeğe yerleştirecek şekilde ayarlayın.

Ardından, negatif popülasyonu veya otofloresanı histogramın en sol kısmına yerleştirmek için floresan PMT ayarlarını yapın. Negatif kontrol tüpünü kaydedin. Negatif kontrol tüpünü sitometre yükleme portundan çıkarın ve ilk pozitif kontrol kom tüpü ile değiştirin.

Şimdi satın almaya başlayın. Pozitif kontrol tüplerinin her biri için bu işlemi tekrarlayın ve her tüp için verileri kaydedin. Her pozitif kontrol için, histogramda kaydedilen olayların etrafına bir aralık kapısı veya kutu çizin.

Ardından histogramın negatif kısmına başka bir aralık kapısı çizin. Manuel telafi yaparken, pozitiflerin medyanını negatiflerin medyanına eşit olana kadar ayarlayarak deneyde kullanılan her fluro'yu hesaba katın. Medyanı ayarlamak için, her floresan parametresinin medyanları mümkün olduğunca yakından eşleşene kadar spektral örtüşme değerlerini daha yüksek veya daha düşük olarak ayarlayın.

Pozitif ve negatif kontrol numuneleri ile oluşturulan ayarları kullanarak, deney numunesi için yürüyüş ayarlarını belirleyerek sıralama prosedürüne hazırlanın. Sıralanacak hücre tüpünü sitometre yükleme portuna yerleştirin ve saniyede dokuz ila 10.000 olay hızında bir hız kullanarak edinime başlayın. Öne doğru dağılıma karşı yan dağılıma karşı görüntülemek için bir nokta grafiği seçin.

İleri saçılma, hücre boyutunun genel bir göstergesidir ve x eksenine yerleştirilirken, yan saçılma hücre ayrıntı düzeyinin bir göstergesidir ve Y eksenine yerleştirilir. Şimdi ilgilenilen nüfusu kapılayın. Kapılar belirlendikten sonra, sitometrenin yükleme portunun sıcaklığının dört santigrat dereceye ayarlandığından emin olmak için kontrol edin.

Ardından deneysel numune tüpünü yükleme portuna yerleştirin. Sıralama seçeneğine basın ve alıma başlayın: toplama tüpleri doldukça buzun üzerine yerleştirilmelidir. İstenilen sayıda hücre toplanana veya numune tüpü boşalana kadar sıralamaya devam edin.

Ardından sıralama düğmesini tekrar seçerek sıralamayı durdurun ve numuneyi yükleme portundan çıkarın. Ardından, toplama tüpünü doğrudan sitometrenin yükleme portuna yerleştirin ve 500 ila 1000 olay elde edin. T hücreleri için sıralama için kullanılan aynı ayarları kullanarak, sıralama prosedürü saflığı %21'den %99'a çıkardıB hücreleri için, %5'lik başlangıç B hücresi popülasyonu, sıralamadan sonra %98'e çıkarıldı.

Bu yüzden size az önce b ve t hücresi popülasyonunu sitelerden faks ile nasıl saflaştıracağınızı gösterdik. Unutmayın, tek hücre süspansiyonu üretilebilirse ve uygun antikorlar mevcutsa, gerçekler herhangi bir hücre popülasyonunu saflaştırmak için kullanılabilir. Ek olarak, floresan belirteçlerle genetik olarak istiflenen hücreler, antikor kullanılmadan kolayca saflaştırılabilir.

Ayrıca, deneyleriniz için her zaman uygun kontrolleri kullanmayı unutmayın ve doğru florokromları kullandığınızdan emin olmak için her zaman akış sitometrisi lazer konfigürasyonunuzu kontrol edin ve popülasyonlarınızın etrafında düzgün bir şekilde bulunmaları için uygun kapıları kullandığınızdan emin olun. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.