Antikor Profil Lusiferaz Immunoprecipitation Sistemleri (LIPS)

Bu video, LIPS işleminin gerçekleştirilmesinde yer alan adımları göstermektedir. Deney antijenleri, rekombinant Renilla luciferase veya rook antijen füzyonları olarak CO one hücrelerinde eksprese edilir. Ham ekstraktlar elde edilir ve saflaştırma işlemi yapılmadan kullanılır.

Lips analizi, ham karga antijen ekstraktlarının hasta SRA'sı ile inkübe edilmesiyle başlatılır. Mikrotiter kuyucuklardaki antikor-antijen karışımı, Protein AG boncuklarını içeren filtre plaka yıkandıktan sonra, IgG moleküllerini yakalamak amacıyla Protein AG boncukları içeren 96 kuyucuklu bir filtre plakaya aktarılır. Antikora bağlı karga antijeni, lüminol substratı eklenerek ölçülür ve ışık birimleri bir lüminometre ile tespit edilir.

Merhaba, ben Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırmalar Enstitüsü Duyusal Biyoloji Laboratuvarı'ndan Dr. Catherine Chang. Bugün size lips lusiferaz immünopresipitasyon sistemlerinin prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, hastalıkları ve/veya enfeksiyonları teşhis etmek amacıyla antikor titrelerini ölçmek için lips kullanıyoruz.

Alt tabaka tabakalı hastalık durumları, aşılama takibi ve antikor profillerinin oluşturulmasını içeren diğer uygulamalar mevcuttur. Öyleyse başlayalım. Transfeksiyona başlamadan önce, vanilla luciferase füzyonları için plazmidler, BMC biotechnology makalesinde açıklandığı şekilde önceden hazırlanır.

BYO etal 2005 plazmit DNA'sı, bir ila üç miligram verimle bir MIDI prep kiti kullanılarak hazırlanır ve -20 °C'de 1 mg/mL'lik bir stok çözelti olarak saklanır. Transfeksiyonda kullanılan Cost one hücreleri, standart doku kültürü protokolleri kullanılarak %10 FCS içeren DMEM'de kültüre edilir. Transfeksiyondan bir gün önce, Cost one hücrelerini yeni 100 x 20 mm'lik kaplara plaka başına yaklaşık 2 × 10⁶ hücre olacak şekilde paylaştırın ve ertesi güne kadar 37 °C'de inkübe edin.

Khost hücreleri %80 ila %95 konfluens düzeyinde olmalıdır. 4 °C'de saklanan FUgene 6 transfeksiyon reaktifinin oda sıcaklığına gelmesini bekleyin; bu sırada, transfekte edilecek her bir plazmid DNA için 1,5 mL'lik polipropilen mikrosantrifüj tüplerini, tüplerin yan duvarlarına dokunmamaya dikkat ederek etiketleyin. Halihazırda 94 µL optimum medya içeren tüplere 6 µL FUgene 6 ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Bir ila iki µg plazmid kodlu lusiferaz antijen füzyon konstrüktü ekleyin; tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın, kısa süreliğine santrifüjleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Tüm DNA füzyon altı optimum çözeltisini, cos. One hücrelerinin besiyerine eşit şekilde damlatarak hücrelere aktarın. Transfekte edilen cos bir hücrelerini iki gün boyunca inkübe edin ve ardından hasat edin. Füzyon proteinini hasat etmeye başlamak için besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri 6 mL PBS ile yıkayın.

Doku kültürü kabındaki tüm kalıntı PBS'yi pipetle uzaklaştırın, 1,4 milliliters soğuk lizis tamponu ekleyin ve hücreleri bir hücre kazıyıcı ile toplayıp lizatın yarısını hızla buz üzerindeki iki adet 1,5 milliliter mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri parçalamak için bir Branson SOLIDIFIER one 50 kullanılır. Hücre lizatını içeren mikrosantrifüj tüpünü buzun üzerine yerleştirin ve beş saniye boyunca pulse modunda çalıştırın.

Beş saniye ve beş saniye. Sırasıyla iki, iki ve dört sonikasyon ayarlarıyla. Hücre lizatını 12.500 RPM'de dört dakika boyunca santrifüjleyin.

Dört santigrat derecede santrifüj edilir. Tüp duvarındaki gevşek kalıntıları uzaklaştırmak için santrifüj işlemleri arasında tüpler nazikçe tersyüz edilir. Ardından, iki tüpteki süpernatant, peletten rahatsız etmeden dikkatle buz üzerindeki yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.

Lizatın ışık birimlerini veya lu değerini ölçmek için, yeni bir mikro santrifüj tüpünde bir mikrolitre lizatı sekiz mikrolitre PBS ile seyreltin; seyreltilmiş karışıma doğrudan 100 mikrolitre one celent ine substratı ekleyin ve bir tüp lüminometre kullanarak tüpteki lüminesansı hemen beş saniyelik okuma süresiyle ölçün. İnsan ve hayvan örnekleri ile çalışırken güvenlik önlemlerini almayı unutmayın. Antijen profilleme için hasta antikorlarının kaynağı olacak bir serum master plaka hazırlamak için, önce 96 kuyucuklu derin kuyulu polipropilen bir mikrotitrasyon plakasının her kuyucuğuna 450 mikrolitre tampon A ekleyin.

Bu adımda, gelecekteki SRA örnek ekleme işlemlerini ve lips assay'in diğer adımlarını izlemek için bir takipçi olarak görev yapması amacıyla tampon A'ya fenol kırmızısı boyası da eklenebilir. Ardından, 450 µL tampon içeren her bir kuyucuğa her örnekten 50 µL serum ekleyin. Not: Bu işlem, SRA'nın tampon içerisinde 1'e 10 oranında seyreltilmesidir.

Genellikle, ana plakanın son iki kuyucuğuna SRA eklenmez; çünkü bu kısımlar, ana plaka gelecekteki kullanım için saklanmadan önce tampon boşlukları için ayrılmıştır. Plaka, bir rotatör platformu üzerinde bir ila iki saat boyunca kapsamlı bir şekilde çalkalanır. 650 RPM hızda, serum dört derece Celsius'ta en az bir ay veya daha uzun süre stabil kalır ve lips analizi yapılmadan önce saklanacaksa, buharlaşmayı önlemek için plaka parafilm ile mühürlenebilir; örnek tanımlama numaralarını ve ana plaka üzerindeki ilgili kuyucuklarını içeren bir elektronik tablo düzenleyin. Serumları test etmek için çalışma plakası olarak polipropilen 96 sığ kuyucuklu mikrotiter plakalar kullanılır.

İlk adımda, sekiz kanallı bir mikropipet kullanarak 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 40 µL tampon A ekleyin. Ardından, ana plakadan 10 µL seyreltilmiş serum alarak sekiz kanallı bir mikropipet yardımıyla doğrudan çalışma plakasının her bir kuyucuğuna ekleyin. Kullanımdan sonra ana plakayı parafilm ile mühürleyin, ana plakanın kapağını kapatın, ardından Saran wrap ile sarıp 4 °C'de saklayın.

Ardından, her bir kuyucuğa 50 µL tampon A içerisinde 1 x 10⁷ LU eklenecek şekilde karga antijen özütü içeren bir master mix hazırlanır. Bu master mix karışımını hazırlayın ve her bir kuyucuğa 50 µL karga antijen karışımı pipetleyin. Plakayı polistiren bir plaka kapağı ile kapatın ve 100 RPM hızındaki döner çalkalayıcıda bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, oda sıcaklığında, PBS içindeki %30'luk ultra link protein ag boncuk süspansiyonundan 1,5 mililitrelik bir alikotu buzdolabından çıkarın. Yeni bir 96 kuyucuklu filtre HTS plakasının her bir kuyucuğunun altına beş mikrolitre ekleyin. Bir saatlik plaka inkübasyonundan sonra, 100 mikrolitrelik rook antijen antikor reaksiyon karışımını, A kanallı bir mikro pipet kullanarak protein ag boncukları içeren 96 kuyucuklu filtre HTS plakalarına aktarın; 96 kuyucuklu filtre plakasını oda sıcaklığında, 100 RPM'de, döner bir çalkalayıcıda bir saat daha inkübe edin.

Ardından, Biome FX otomasyon istasyonu kullanılarak filtre plaka yıkanır. Bir vakum manifoldu ile her kuyucuk önce sekiz kez 100 µL tampon A ile, ardından iki kez 100 µL PBS ile yıkanır; son yıkamanın ardından vakum kapatılır. Filtre plaka çıkarılır ve plakanın alt ve üst kısmındaki nemin tamamen giderildiğinden emin olunarak bir yığın kağıt havlu veya filtre kağıdı ile kurulanır. Plakadaki her bir kuyucuğun lüminesansını belirlemek için Burt hold LB nine 60 Centro Microplate lüminometresi kullanılır.

Cihazı açın ve enjektörü distile su ile durulayın. Enjektör yıkama döngüsünü kullanarak; cihazı hazırlamak ve çalıştırmak için, üretici talimatları takip edilerek Promega ranil substrat kiti ile hazırlanan INE substratı kullanılır; genellikle bir plaka için altı mililitre substrat karışımı gereklidir. Substrat karışımını lüminometreye yükleyin; substrat enjeksiyonu ve plaka okuma ayarlarını içeren program dosyasını açın.

Bu ölçümler için 50 µL substrat enjekte edilir. Plaka iki saniye boyunca çalkalandıktan sonra, beş saniyelik lüminesans okuması yapılır.

Çalışma sonrası plak okumasını başlatan programı çalıştırın ve luminometrede sızıntı oluşmasını önlemek için mikrotitre filtre plağını derhal çıkarın. Veriler, daha sonra analiz edilmek üzere microwind programından otomatik olarak Excel formatına aktarılır. Aynı serumlarla yapılan iki farklı çalışmanın sonuçlarının ortalaması alınır.

Her örnek için lu titrasyon değerlerinin oluşturulması önerilir. Tekrarlanan örnekler, iki çalışma arasında titrasyon değerlerinde yüksek uyum göstermelidir. Veri çizimi için lu titrasyon değerleri, burada gösterildiği gibi tampon körlerini çıkarmak amacıyla daha fazla ayarlanabilir.

Analizin duyarlılığı ve özgüllüğü, kontrol örneklerinin ortalamasına üç veya beş standart sapma eklenerek elde edilen kesim değerleri kullanılarak da hesaplanabilir. Antikor titrelerinin LIPS kullanılarak nasıl ölçüleceğini göstermiş olduk; LIPS minimal analiz optimizasyonu gerektirir ve basitliği sayesinde herhangi bir antijen için iki haftadan kısa sürede yüksek kaliteli veriler üretmek amacıyla kullanılabilir. İnsan serumu ile çalışırken, uygun güvenlik önlemlerini almayı hatırlamak önemlidir.

Unutmayın ki, lift yöntemi oldukça ölçeklenebilirlebilir ve bu sayede manuel yıkama kullanarak az sayıda örneği veya robotik bir çalışma istasyonu kullanarak tam bir plakayı ölçmek için kullanılabilir. Bu çok yönlülüğü ile lift yönteminin seroantijenik analizlerde oldukça yararlı olacağını, hastalık analizlerinde ve genel olarak halk sağlığında geniş etkileri olacağını düşünüyoruz. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, antikor profilleme deneylerinizde başarılar dileriz.