Primer Uzatma Yakalama: Ağır Bozulmuş DNA Kaynakları Hedefli Sıra Alma

Bu video, son derece düşük kopya sayısına sahip ve yüksek düzeyde fragmente olmuş DNA kaynaklarından hedef DNA dizilerinin geri kazanılmasını sağlayan primer uzatma yakalama (primer extension capture - PECA) tekniğini açıklamaktadır. Bu tekniği, 40.000 yıldan daha eski Neandertal kemiklerinden tam mitokondriyal genomları sekanslamak için kullandık; ayrıca bu yöntem, birçok bireyden herhangi bir küçük hedef bölgenin veya tek nükleotid polimorfizmlerinin yakalanması için kullanılabilir. Bu prosedürdeki temel adımlar şunlardır: bir birincil DNA kütüphanesinin PCR amplifikasyonu, amplifiye edilmiş kütüphanenin kantitatif PCR ile miktar tayini, amplifiye edilmiş kütüphane üzerinde birincil uzatma, hedef dışı fragmanları uzaklaştırmak için birincil uzatma ürünlerinin boncukla yakalanması ve yakalanan ve yıkanan hedeflerin elüsyonu ile sekanslanması.

Merhaba, ben Leipzig'deki Max Planck Evrimsel Antropoloji Enstitüsü Genetik Bölümü'nde, Shanti Payable'ın laboratuvarından Adrian Briggs. Bugün size antik kemikler gibi karmaşık ve yüksek derecede degrade olmuş bir DNA kaynağından ilgi duyulan spesifik DNA sekanslarını izole etme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, Homo neanderthalensis veya Neandertal insanın mitokondriyal genetik çeşitliliğini incelemek için kullandık.

Haydi başlayalım. Deneyimizde kullandığımız DNA, Neandertal coğrafi alanı genelindeki çeşitli sahalarda bulunan, 40.000 ile 70.000 yıl arası yaşlardaki Neandertal kemiklerinden elde edilmiştir. Yüzeydeki her türlü yabancı DNA'yı temizlemek amacıyla, bir kemik önce gece boyunca UV ışığına maruz bırakılır.

100 ile 500 miligram arasında kemik tozu üretmek için ince bir matkap kullanılır; kemik tozundan DNA ekstraksiyonu, Nadine Rockland ve Michael Hof tarafından yazılan 2007 tarihli "comparison and optimization of ancient DNA extraction" makalesinde açıklanan prosedür kullanılarak gerçekleştirilir. DNA ekstresi daha sonra, tüm DNA fragmanlarının uçlarına evrensel adaptör priming bölgelerinin eklenmesiyle bir sekanslama kütüphanesine dönüştürülür; çünkü bir Neandertal kemiğinden üretilen 4 5 4 kütüphanesi, bazen sadece birkaç pikogram gibi çok küçük miktarlarda DNA içerir. Bu birincil DNA kütüphanesi, ilk olarak evrensel kütüphane primerlerine karşılık gelen emülsiyon PCR primerleri kullanılarak PCR ile amplifiye edilir.

Kütüphane amplifikasyonu için PCR karışımını hazırlamak üzere, bir PCR tüpünde şu reaktifleri birleştirin: 10 µL 10 X GAMP PCR tamponu, 2 µL magnezyum klorür, 2 µL BSA, 1 µL dNTP karışımı, 3'er µL 4 54 MPCR ileri ve geri primerleri, 1 µL AmplyGold DNA polimeraz ve 25 µL kütüphane kalıbı. Son olarak, toplam hacmi 100 µL'ye tamamlamak için 45 µL PCR grade su ekleyin. AmplyTech Gold DNA polimeraz oda sıcaklığında stabil olduğundan, buz üzerinde çalışmaya gerek yoktur.

PCR reaksiyonu hazırlandıktan sonra, PCR tüpünü bir termosiklatöre yerleştirin; işlem 12 dakika boyunca 95 °C'lik bir denatürasyon adımıyla başlar ve ardından 30 saniye 95 °C, bir dakika 60 °C ve bir dakika 72 °C şeklinde 14 döngü ile devam eder. Bu 14 döngünün sonunda, beş dakikalık 72 °C'lik bir final adımı ayarlayın; PCR amplifikasyonu tamamlandıktan sonra PCR tüpü, kullanıma hazır olana kadar süresiz olarak 10 °C'de bekletilebilir. Ardından, PCR ürünü üretici talimatlarına uygun olarak Kyogen MinLu spin kolon kullanılarak saflaştırılır ve primer uzama ile ürün yakalama aşamalarından önce, MinLu kiti ile birlikte verilen 50 µL EB tamponu ile kolondan DNA elüe edilir.

Amplifiye edilmiş kütüphane ürününün miktarını belirlemek ve kalitesini kontrol etmek amacıyla, amplifiye edilmemiş ve amplifiye edilmiş kütüphane alikotları üzerinde kantitatif PCR gerçekleştirilmelidir. 14 döngü amplifiye edilmiş kütüphane, primer kütüphaneden birkaç bin kat daha fazla DNA içermelidir. Eğer içermiyorsa, amplifikasyon koşulları kontrol edilmeli ve işlem tekrarlanmalıdır.

Amplifiye edilmiş kütüphaneden ilgilenilen dizileri yakalamak için kullanılacak olan birincil uzama yakalama primerleri, istenen bir hedef bölgeyle eşleşecek şekilde, her bir hedef dizinin 5' ucundaki 12 bazlık kuyruk dizisine karşı 60 °C ideal erime sıcaklığında normal PCR primerleri gibi tasarlanmalı ve 5' ucunda bir biotin kalıntısı içermelidir; 200 µM stoklardan hazırlanan tek bir multipleks karışımda 150'e kadar PEC primeri birlikte kullanılabilir. Birincil uzama reaksiyonu için, uygun bir PCR tüpünde 5 µL 10 X GAMP PCR tamponu, 5 µL magnezyum klorür, 1 µL BSA ve 0.5 µL dNTP ekleyerek bir PCR karışımı hazırlayın. Toplam hacmi 50 µL'ye tamamlamak için 5 µL birincil uzama yakalama primeri karışımı, 0.5 µL Taq Gold DNA polimeraz, 2 µL 14 döngü amplifiye edilmiş kütüphane DNA'sı ve son olarak 31 µL PCR grade su ekleyip karıştırın.

Amplifiye edilmiş kütüphane şablonu mikrolitre başına 1x10¹² kopya değerinden fazlasını içeriyorsa, reaksiyon karışımına 2x10¹² kopyadan fazlasının eklenmemesi için şablon önce EB tamponu ile seyreltilmelidir. PCR tüpü hazırlandıktan sonra, tüp termosikletöre yerleştirilmeli ve tek bir reaksiyon çalışması için ayarlanmalıdır. İşlem, 95 °C'de 12 dakikalık denatürasyon ile başlar, ardından 60 °C'de bir dakika ve primer uzama için 72 °C'de beş dakika uygulanır.

Tek döngü tamamlandığında, PCR ürünü bir sonraki adıma kadar 72 °C'de bekletilir. Spesifik olmayan primer bağlanmasını önlemek ve doğrudan yakalamak için, reaksiyon karışımı termosiklette 72 °C'de tutulurken, Kyogen Ute saflaştırma kitinden 150 µL PBI veya PB tamponu PCR reaksiyon tüplerine ekleyin. Bu işlem, sıcaklık hedef primerlerin spesifik olmayan uzaması için çok yüksekken polimerazı inaktive eder; tüpleri kapatın, kısa bir süre vorteksleyin ve ardından masaüstü santrifüj ile sıvıyı çöktürün.

Diğer bağlama tamponları (Qiagen PM Tamponu gibi) sonraki yakalama sürecini etkileyebileceğinden, bu adımda yalnızca PBI veya PB tamponu kullanın. Ardından, karışımı PCR tüpünden çıkarın ve üretici talimatlarına uygun olarak daha önce yapıldığı şekilde saflaştırma için Rogen MinLu spin kolonuna aktarın; DNA'yı, MinLu kiti ile birlikte verilen 30 µL EB tamponu ile kolondan elüe edin. PEC primerlerine bağlanmamış tüm fragmanları uzaklaştırmak için boncuk tabanlı bir yakalama adımı gerçekleştirilir.

İlk olarak, M 270 strip divide boncuk stok çözeltisini vorteksleyerek yeniden süspande edin ve örnek başına 25 µL'ye eşdeğer miktarda boncuk alın. Boncukları 500 µL iki katı BW tamponu ile iki kez yıkayın ve başlangıçta alınan boncuk hacmi kadar iki katı BW ile yeniden süspande edin. Süspansiyondan 25 µL hazırlayın.

Her bir örnek için, saflaştırılmış elüye DNA'nın 25 mikrolitresini 25 mikrolitre boncuk süspansiyonuna ekleyin ve kalan beş mikrolitreyi daha sonraki miktar belirleme işlemi için saklayın. DNA ve boncuk süspansiyonunu pipetle yukarı-aşağı çekerek ve perpet uçla karıştırarak harmanlayın, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir tezgah üstü rotatörde yavaşça döndürün. Karıştırma işleminden sonra, içeriği yeni bir 1,5 mililitrelik PCR tüpüne aktarın.

Önceki rotasyon inkübasyon basamağı sırasında, bazı hedef dışı DNA'lar tüp duvarına yapışmış olabilir. Bu nedenle, boncuk süspansiyonunun yeni bir tüpe aktarılması, bu hedef dışı DNA'ların nihai ürünlere karışma olasılığını önler. Isıl elüsyon basamağı sırasında, manyetik partikül toplayıcıyı kullanarak boncukları çöktürün; 10 ila 20 saniye sonra tüm boncuklar duvara göç edecek ve geriye boncukları yıkamak için uzaklaştırılması gereken berrak bir supernatant kalacaktır; tüpe 500 µL bir kat BW tamponu ekleyin ve düşük hızda yaklaşık üç saniye boyunca vorteksleyin.

Tüp hem dik konumdayken hem de ters çevrildiğinde, tüp duvarına yapışmış hiçbir boncuk kalmamalıdır. Masaüstü santrifüj kullanarak, tüm sıvıyı tüp duvarlarından aşağı indirmeye yetecek kadar, bir ila üç saniye boyunca süspansiyonu çöktürün. Tüpü tekrar MPC'ye yerleştirin ve tüm boncuklar tüpün kenarında toplanana kadar 10 ila 20 saniye bekleyin.

Ardından SUP süpernatanını uzaklaştırın. İlk yıkama işlemi tamamlanmıştır. Bu prosedürü, son bir kez BW yıkaması ve süpernatan uzaklaştırmasını takiben dört kez daha tekrarlayın.

500 µL bir kat sıcak yıkama tamponu ekleyin. Süspansiyonu, daha önce olduğu gibi kısa süreli vorteksleyerek ve santrifüj ederek karıştırın; ardından tüpü bir termal blok çalkalayıcıda 65 °C'de 1000 RPM hızında iki dakika boyunca çalkalayın ve termal bloktan çıkardıktan sonra bir dakika içinde süpernatant kalıntılarını gidermek için kısa süreli santrifüj uygulayın. Bu adım, PEC primerlerine bağlanmış olabilen ancak primer uzatma adımında uzatılmamış fragmanları uzaklaştıracaktır; pelletini 30 µL EB tamponu içinde yeniden süspanse edin ve karışımı yeni bir 1,5 mL'lik PCR tüpüne aktarın.

Tüpü termal döngüleyici cihazda 95 °C'de üç dakika boyunca inkübe edin. Boncukları manyetik partikül toplayıcıda çöktürün. Süpernatanın tamamen berraklaşması 10 ila 20 saniye sürmelidir; ardından S süpernatanını yeni, etiketlenmiş bir tüpe aktarın.

Herhangi bir boncuk aktarmamaya dikkat edin. Yakalanan DNA fragmanı ürünlerini içeren süpernatanı saklayın. Boncuklar bu aşamada atılabilir.

Yakalanan ürünü amplifiye etmek için, ikinci bölümde yapıldığı gibi toplam 100 microliters hacminde bir PCR karışımı hazırlayın ve aynı PCR döngü koşullarını uygulayın. Yakalanan ürünün PCR amplifikasyonu tamamlandıktan sonra, yine bölüm ikide yapıldığı gibi Qiagen Ute spin kolonu kullanarak saflaştırma işlemini gerçekleştirin; DNA'yı kolondan 50 microliters Eeb Buffer ile elüye edin, ürün artık yüksek verimli sekanslama için hazırdır. Tüm Neandertal mitokondriyal genomunu kapsayacak şekilde 574 PEC primeri tasarladık.

Bunları dörtlü multipleks karışımlara ve Avrasya genelindeki dört farklı bölgeden gelen, 40.000 ile 70.000 yıl öncesine tarihlenen beş Neandertal fosilinden elde edilen kütüphaneler üzerinde iki seri primer uzama yakalama (PEC) turuna ayırdık; böylece birey başına 170.000 ile 500.000 arasında sekans ürettik ve sonuçları bir mitokondriyal referans sekansla hizaladık. PEC prosedürünün mitokondriyal DNA'yı devasa ölçüde zenginleştirdiğini ve her birey için mitokondriyal DNA boyunca ortalama 18 ile 56,3 kat arası kapsama ile tam kapsama sağladığını saptadık. Bu sonuçlarla, her bir birey için yüksek kaliteli, eksiksiz bir mitokondriyal genom sekansı oluşturabildik.

Ardından, bu sekansların günümüz insanlarının dünya genelindeki örneklemi ve en yakın yaşayan akrabalarımız olan şempanze ve bonobo ile filogenetik karşılaştırmasını gerçekleştirdik. Bu işlem, Neandertal mitokondriyal DNA'sının modern insanlara yakından ilişkili olduğu ancak onlardan açıkça farklı olduğu yönündeki önceki bulguları doğrulamıştır. Ayrıca, Neandertal sekanslarının kendi aralarındaki karşılaştırması, Neandertallerde günümüz dünya genelindeki insanlardan daha düşük ve günümüz Avrupalılarına benzer şekilde son derece düşük bir genetik çeşitlilik olduğunu ortaya koymuştur.

Bu kanıtlar, Neandertal dizilerindeki protein evriminin analiziyle birleştirildiğinde, Neandertallerin uzun vadeli düşük bir popülasyon büyüklüğüne sahip olduğunu göstermektedir; bu durum, Neandertal popülasyon yoğunluğunun modern insanların ulaştığı seviyelere hiçbir zaman ulaşmadığını öne süren arkeolojik kanıtlarla tutarlıdır. Yüksek verimli dizilemeye hazırlık amacıyla hedef dizileri çoğaltmak ve yakalamak için primat ekstansiyon yakalamanın nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, termosiklatördeki tüm sıcaklık spesifikasyonlarına uymak önemlidir; ancak primerlerin farklı tavlama sıcaklıklarına sahip olabileceğini, bu nedenle tavlama sıcaklığını kullandığınız özel primerlere göre ayarlamanız gerekebileceğini unutmayın ve mümkün olduğunca fazla sıvıyı uzaklaştırmak için tüm yıkama basamakları sırasında dikkatli olun.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.