Primer Uzatma Yakalama: Ağır Bozulmuş DNA Kaynakları Hedefli Sıra Alma

Bu video, son derece düşük kopya sayılı ve yüksek derecede fragmante olmuş DNA kaynaklarından hedef DNA dizilerinin geri kazanılmasını sağlayan primer uzatma yakalama veya PECA tekniğini açıklamaktadır. Bu tekniği, 40.000 yılı aşkın yaştaki neandertal kemiklerinden tam mitokondriyal genomları dizilemek için kullandık; bu yöntem, birçok bireyden herhangi bir küçük hedef bölgenin veya tek nükleotid polimorfizminin yakalanması için kullanılabilir. Bu prosedürdeki temel adımlar şunlardır: birincil DNA kütüphanesinin PCR amplifikasyonu, amplifiye edilen kütüphanenin kantitatif PCR ile miktarlaştırılması, amplifiye edilen kütüphane üzerinde hedef birincil uzatmanın yapılması, hedef dışı fragmanları uzaklaştırmak için birincil uzatma ürünlerinin boncukla yakalanması ve yakalanan ve yıkanan hedeflerin elüsyonu ve dizilenmesidir.

Merhaba, ben Leipzig'deki Max Plank Evrimsel Antropoloji Enstitüsü Genetik Bölümü'ndeki Shanti Payable Laboratuvarı'ndan Adrian Briggs. Bugün sizlere, antik kemikler gibi karmaşık ve yüksek derecede bozunmuş bir DNA kaynağından ilgilenilen spesifik DNA dizilerinin izole edilmesi prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, Homo neanderthalensis veya Neandertal insanın mitokondriyal genetik çeşitliliğini incelemek için kullandık.

Hadi başlayalım. Deneyimizde kullandığımız DNA, Neandertal coğrafi alanı genelindeki çeşitli bölgelerde bulunan, 40.000 ile 70.000 yıl öncesine ait Neandertal kemiklerinden elde edilmiştir. Bir kemik, yüzeyindeki yabancı DNA'ları temizlemek amacıyla ilk olarak gece boyunca UV ışığına maruz bırakılır.

100 ile 500 miligram arasında kemik tozu üretmek için ince bir matkap kullanılır; DNA, Nadine Rockland ve Michael Hof tarafından yazılan 2007 tarihli "comparison and optimization of ancient DNA extraction" makalesinde açıklanan prosedür kullanılarak kemik tozundan ekstrakte edilir. Ardından, tüm DNA fragmanlarının uçlarına evrensel adaptör primleme bölgeleri eklenerek DNA ekstraktı bir sekanslama kütüphanesine dönüştürülür; çünkü bir Neandertal kemiğinden üretilen 4 5 4 kütüphanesi, bazen sadece birkaç pikogram gibi çok küçük miktarlarda DNA içerir. Bu birincil DNA kütüphanesi, önce evrensel kütüphane primerlerine karşılık gelen emülsiyon PCR primerleri kullanılarak PCR ile amplifiye edilir.

Kütüphane amplifikasyonu için PCR karışımını hazırlamak üzere, bir PCR tüpünde şu reaktifleri birleştirin: 10 µL 10 X GAMP PCR tamponu, 10 µL magnezyum klorür, 2 µL BSA, 1 µL dNTP karışımı, 3'er µL 4 54 MPCR ileri ve geri primerleri, 1 µL Amplygold DNA polimeraz ve 25 µL kütüphane kalıbı. Son olarak, toplam hacmi 100 µL'ye tamamlamak için 45 µL PCR kalite suyu ekleyin. Amplygold DNA polimeraz oda sıcaklığında stabil olduğundan, buz üzerinde çalışmaya gerek yoktur.

PCR reaksiyonu hazırlandıktan sonra, PCR tüpünü termosikletöre yerleştirin; işleme 12 dakika boyunca 95 °C'de denatürasyon adımıyla başlayın, ardından 30 saniye 95 °C, bir dakika 60 °C ve bir dakika 72 °C şeklinde 14 döngü uygulayın. Bu 14 döngünün sonunda, 5 dakikalık 72 °C'lik bir son adım belirleyin; bu aşamadan sonra PCR tüpü, PCR amplifikasyonu tamamlanıp kullanılmaya hazır olana kadar süresiz olarak 10 °C'de bekletilebilir. Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak Kyogen MinLu spin kolon kullanılarak PCR ürününün saflaştırılmasını gerçekleştirin ve birincil uzatma ile ürün yakalama işleminden önce, DNA'yı MinLu kitiyle birlikte verilen 50 µL EB tamponu ile kolondan elüye edin.

Amplifiye edilmiş kütüphane ürününün miktarını belirlemek ve kalitesini kontrol etmek amacıyla, amplifiye edilmemiş ve amplifiye edilmiş kütüphane alikotlarına kantitatif PCR uygulanmalıdır. 14 döngü amplifiye edilmiş kütüphane, primer kütüphaneden birkaç bin kat daha fazla DNA içermelidir. Eğer öyle değilse, amplifikasyon koşulları kontrol edilmeli ve işlem tekrarlanmalıdır.

Amplifiye edilmiş kütüphaneden ilgilenilen dizileri yakalamak için kullanılacak olan primer uzatma yakalama primerleri, ideal 60 °C erime sıcaklığıyla her bir hedef dizinin beş prime ucundaki 12 bazlık kuyruk dizisine ve istenen hedef bölgeye uygun normal PCR primerleri gibi tasarlanmalı ve beş prime ucunda bir biyotin kalıntısı içermelidir; 200 µM stoklardan hazırlanan tek bir multipleks karışımda 150'e kadar PEC primeri birlikte kullanılabilir. Primer uzatma reaksiyonu için, uygun bir PCR tüpüne 5 µL 10X GAMP PCR tamponu, 2,5 µL magnezyum klorür, 1 µL BSA ve 0,5 µL dNTP ekleyerek bir PCR karışımı hazırlayın. Toplam hacim 50 µL olacak şekilde, bu karışıma 5 µL primer uzatma yakalama primeri karışımı, 0,5 µL Taq gold DNA polimeraz, 2 µL 14 döngü amplifiye edilmiş kütüphane DNA'sı ve son olarak 31 µL PCR sınıfı su ekleyip karıştırın.

Amplifiye edilmiş kütüphane şablonu mikroliter başına 10¹² kopyıdan fazlasını içeriyorsa, reaksiyon karışımına 2 x 10¹² kopyıdan fazlasının eklenmemesi için şablon önce EB tamponu ile seyreltilmelidir. PCR tüpü hazırlandıktan sonra, tüp termosiklere yerleştirilmeli ve tek bir reaksiyon çalışması için ayarlanmalıdır. 95 °C'de 12 dakikalık denatürasyon ile başlanmalı, ardından 60 °C'de bir dakika ve primer ekleme için 72 °C'de beş dakika uygulanmalıdır.

Tek döngü tamamlandığında, PCR ürününü bir sonraki adıma kadar bekletmek için 72 °C'de tutun. Spesifik olmayan primer bağlanmasını önlemek için, reaksiyon karışımı termosikletörde 72 °C'de tutulurken, Kyogen Ute saflaştırma kitinden 150 µL PBI veya PB tamponunu doğrudan PCR reaksiyon tüplerine ekleyin. Bu işlem, sıcaklık hedef primerlerin spesifik olmayan uzaması için çok yüksekken polimerazı inaktive eder; tüpleri kapatın, kısa sürede vorteksleyin ve ardından bir masaüstü santrifüj ile sıvıyı çöktürün.

Qiagen PM Buffer gibi diğer bağlama tamponları sonraki yakalama işlemini etkileyebileceğinden, bu adımda yalnızca PBI veya PB tamponu kullanın. Ardından, karışımı PCR tüpünden çıkarın ve daha önce yapıldığı gibi üretici talimatlarına uygun olarak saflaştırma için Rogen MinLu spin kolonuna aktarın; kolondaki DNA'yı MinLu kiti ile birlikte verilen 30 µL EB tamponu ile elüye edin. PEC primerlerine bağlanmamış tüm fragmanları uzaklaştırmak için boncuk tabanlı bir yakalama adımı gerçekleştirilir.

İlk olarak, M 270 strip divide boncuk stok çözeltisini vorteksleyerek yeniden süspande edin ve örnek başına 25 µL'ye eşdeğer miktarda boncuk alın. Boncukları iki kez 500 µL 2x BW tamponu ile yıkayın ve başlangıçta alınan boncuk hacmi kadar 2x BW tamponu ile yeniden süspande edin. Süspansiyondan 25 µL hazırlayın.

Her bir örnek için, saflaştırılmış elüye DNA'nın 25 mikrolitresini 25 mikrolitre boncuk süspansiyonuna ekleyin ve kalan beş mikrolitreyi daha sonraki miktar belirleme işlemi için saklayın. DNA ve boncuk süspansiyonunu pipetleme ve perpet uçla karıştırarak harmanlayın, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir masaüstü rotatörde yavaşça döndürün. Karıştırma işleminden sonra içeriği yeni bir 1,5 mililitrelik PCR tüpüne aktarın.

Önceki rotasyon inkübasyon adımı sırasında, bazı hedef dışı DNA'lar tüp duvarına yapışmış olabilir. Bu nedenle, boncuk süspansiyonunun yeni bir tüpe aktarılması, bu hedef dışı DNA'ların nihai ürünlere karışma olasılığını önler. Isıl elüsyon adımı sırasında, manyetik partikül toplayıcı kullanılarak boncuklar peletlenir; 10 ila 20 saniye sonra tüm boncuklar duvara göç etmiş olacak ve geriye boncukları yıkamak için uzaklaştırılması gereken berrak bir süpernatan kalacaktır; tüpe 500 µL 1x BW tamponu ekleyin ve yaklaşık üç saniye boyunca düşük hızda vorteksleyin.

Tüp önce dik konumdayken, ardından ters çevrilmiş haldeyken, tüp duvarına yapışık herhangi bir boncuk kalmamış olmalıdır. Bir masaüstü santrifüj kullanarak, tüm sıvıyı tüp duvarlarından aşağı çekmeye yetecek kadar, bir ila üç saniye boyunca süspansiyonu santrifüjleyin. Tüpü tekrar MPC'ye yerleştirin ve tüm boncuklar tüpün kenarında toplanana kadar 10 ila 20 saniye bekleyin.

Ardından SUP süpernatanını uzaklaştırın. İlk yıkama işlemi tamamlanmıştır. Bu prosedürü, son bir kez BW yıkaması ve süpernatan uzaklaştırmasının ardından dört kez daha tekrarlayın.

500 µL bir katı sıcak yıkama tamponu ekleyin. Süspansiyonu, daha önce yaptığınız gibi kısa süreli vorteksleme ve santrifüjleme yaparak karıştırın ve ardından tüpü, termal blok sarsıcıda 1000 RPM'de, 65 °C'de iki dakika boyunca sallayın; termal bloktan çıkarıldıktan sonra bir dakika içinde kısa bir santrifüjleme yaparak süpernatant kalıntılarını uzaklaştırın. Bu adım, PEC primerlerine bağlanmış olabilen ancak primer uzatma adımında uzatılmamış olan fragmanları uzaklaştıracaktır; pellet'i 30 µL EB tamponu içinde yeniden süspande edin ve karışımı taze bir 1,5 mL PCR tüpüne aktarın.

Tüpü termal döngüleyici cihazda 95 °C'de üç dakika boyunca inkübe edin. Boncukları manyetik partikül toplayıcıda çöktürün. Süpernatantın tamamen berraklaşması 10 ila 20 saniye sürmelidir; ardından S süpernatantını yeni ve etiketlenmiş bir tüpe aktarın.

Herhangi bir boncuk transfer etmemeye dikkat edin. Yakalanmış DNA fragmentleri ürününü içeren süpernatantı saklayın. Boncuklar bu aşamada atılabilir.

Yakalanan ürünü amplifiye etmek için, ikinci bölümde yapıldığı gibi toplam 100 microliter hacminde bir PCR karışımı hazırlayın ve aynı PCR döngü koşullarını uygulayın. Yakalanan ürünün PCR amplifikasyonu tamamlandıktan sonra, ikinci bölümde daha önce yapıldığı gibi Qiagen Ute spin kolonu kullanarak saflaştırma işlemini gerçekleştirin; DNA'yı kolondan 50 microliter Eeb Buffer ile elüe edin, ürün artık yüksek kapasiteli dizileme için hazırdır. Tüm Neanderthal mitokondriyal genomunu kapsayacak şekilde 574 PEC primeri tasarladık.

Bunları dört multipleks karışıma ve Avrasya'nın dört farklı bölgesinden gelen, 40.000 ile 70.000 yıl öncesine tarihlenen beş Neandertal fosili kütüphanesinde iki seri primer uzatma yakalama aşamasına ayırarak, birey başına 170.000 ile 500.000 arasında sekans ürettik ve sonuçları bir mitokondriyal referans sekansına hizaladık. PEC prosedürünün mitokondriyal DNA'yı büyük ölçüde zenginleştirdiğini ve her birey için mitokondriyal DNA genelinde ortalama 18 ile 56,3 kat arasında bir kapsama ile tam kapsayıcılık sağladığını bulduk. Bu sonuçlarla, her bir birey için yüksek kaliteli ve tam bir mitokondriyal genom sekansı oluşturabildik.

Ardından, bu dizilerin günümüz insanlarının dünya genelindeki örnekleri ve en yakın yaşayan akrabalarımız olan şempanze ve bonobolarla filogenetik karşılaştırmasını gerçekleştirdik. Bu işlem, Neandertal mitokondriyal DNA'sının modern insanlara yakın olduğu ancak onlardan belirgin şekilde farklı olduğu yönündeki önceki bulguları doğrulamıştır. Ayrıca, Neandertal dizilerinin kendi arasındaki karşılaştırması, Neandertallerde, günümüzdeki dünya genelindeki insanlara göre daha düşük ve günümüz Avrupalılarına benzer şekilde aşırı derecede düşük bir genetik çeşitlilik olduğunu ortaya koymuştur.

Bu kanıtlar, Neandertal dizilerindeki protein evriminin analiziyle birleştirildiğinde, Neandertallerin uzun süreli düşük bir popülasyon büyüklüğüne sahip olduğunu göstermektedir; bu durum, Neandertal popülasyon yoğunluğunun modern insanların ulaştığı seviyelere hiçbir zaman ulaşmadığını öne süren arkeolojik kanıtlarla tutarlıdır. Yüksek çıktılı sekanslama hazırlığı kapsamında, hedef dizileri çoğaltmak ve yakalamak için primat ekstansiyon yakalamanın nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür takip edilirken, termosikletteki tüm sıcaklık spesifikasyonlarına uymak önemlidir; ancak primerlerin farklı tavlama sıcaklıklarına sahip olabileceğini, bu nedenle tavlama sıcaklığını kullandığınız özel primerlere göre ayarlamanız gerekebileceğini unutmayın ve tüm yıkama basamakları sırasında mümkün olduğunca fazla sıvıyı uzaklaştırmaya dikkat edin.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.