Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme

Hücrelerin enkapsülasyonu için izlenen aşamalı süreç, hidrojel kalıpların ve diğer malzemelerin hazırlanması ve sterilizasyonu ile başlar; ardından hücrelerin, her bir jel seti için tüplere ayrılmış bireysel popülasyonlar halinde izolasyonu gerçekleştirilir. Daha sonra hücrelerin varlığında jelleştirme işlemi uygulanır ve bunu in vitro veya in vivo inkübasyon süreci takip eder. Hücre davranışına yönelik alt analizler; canlılık, morfoloji, proliferasyon ve diferansiyasyon testlerini içerebilir.

Merhaba, ben Pennsylvania Üniversitesi Biyoüretim Bölümü'nden Dr. Jason Burdick'in laboratuvarından Amidio Kahan. Bugün size doku mühendisliği için 3B hidrojellerde hücresel enkapsülasyon prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, hidrojel bileşiminin ve yapısının enkapsüle edilmiş hücrelerin davranışı üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıyoruz.

Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, PBS içinde %0.5 ağırlık oranında foto başlatıcı air cure 2 9 5 9 veya I 2 9 5 9 çözeltisi hazırlayın. Karıştırın ve 37 °C'de karanlıkta iki ila üç gün inkübe edin.

Hazır olduğunda, çözeltiyi sterilize etmek için bir şırınga filtresi kullanın ve oda sıcaklığında saklayın. Ardından, gösterilen miktarda polimer ve çapraz bağlayıcıyı hesaplamak için Microsoft Excel gibi bir hesap çizelgesi programı kullanın. Burada, akrilat reaktif gruplarıyla fonksiyonelleştirilmiş hiyalüronik asit bulunmaktadır.

Ayrıca amino asit sistin, arjinin, glisin ve aspartat içeren fonksiyonel yapışkan domainli pentan peptit miktarını hesaplayın. Sistin, polimere bağlama işlemi içindir. Gerekli polimer çapraz bağlayıcı ve pent miktarları belirlendikten sonra, bunları tartın ve her birini ayrı bir eppendorf tüpüne yerleştirin.

Hesaplama tablosunu buna göre düzenleyin. Elde edilen polimerin gerçek kütlesi için "Gel kalıplarının hazırlanması" adımına geçin. Bireysel olarak paketlenmiş steril uçları kesmek için bir jilet kullanın.

Bir mililitrelik tek kullanımlık şırıngalar. Foto desenli jeller için kullanılacak kalıpların düz bir kesime sahip olduğundan emin olun. Son olarak, şırınga kalıplarını, kapakları açık EOR tüplerini ve gerekli diğer tüm malzemeleri, biyolojik güvenlik kabinine entegre germisidal bir ışık kaynağının altında 30 dakika boyunca tutarak sterilize edin.

Sterilizasyon tamamlandığında, deney ekipmanlarının sterilizasyonunun ardından hücrelerin hazırlanmasına geçiniz. Steril kabin içinde çalışınız ve mikal tipi çapraz bağlama için kullanılan polimere steril TEA, serbest radikal çapraz bağlaması için kullanılan polimere ise steril PBS ekleyiniz. Askı grubu tüplerine uygun tampon çözeltiyi ekleyiniz ve vorteksleyiniz.

Sarkık kısmın polimere bağlanması için, peptitteki bir INE grubundan gelen tiyol aracılığıyla alkillenmiş hyaluronik aside bağlanmasını sağlamak amacıyla, sarkık kısmı polimer çözeltisine ekleyin ve parafilm ile kapatın. Kısaca, vortekslenmiş şekilde 37 °C'de karıştırarak inkübe edin. Sarkık kısım bağlanırken, enkapsüle edilecek olan hücreleri (insan mezenkimal kök hücreleri veya hMSC'ler), PBS ile yıkayarak hazırlayın.

Ardından oda sıcaklığında bir dakika boyunca tripsin ile inkübe edin, tripsini uzaklaştırın ve 37 °C'de beş dakika daha inkübe edin. Daha sonra tripsini nötralize etmek ve hücreleri plaka yüzeyinden ayırmak için HMSC büyüme medyumu ekleyin. Hücreleri bir hemositometre ile sayın.

Sayılan hücreleri, her bir jel seti için uygun sayıdaki porsiyonlara ayırın. Mililitre başına 10 milyon hücre yoğunluğunda, üç adet 50 microliter'lik jelden oluşan bir set için 1.5 milyon hücreyi ayrı bir konik tüpe ayırın. Uygulama zamanlaması nedeniyle, tek bir sette dörtten fazla jel hazırlamayın.

Ardından hücreleri 500 RCF'de altı dakika boyunca santrifüjleyin. Hücreler çökerken oda sıcaklığında, mical edisyon çapraz bağlanması için polimerizasyon karışımını hazırlayın. Uygun konsantrasyonu elde etmek için çapraz bağlayıcıya tampon ekleyin.

Işıkla başlatılan serbest radikal çapraz bağlanma için, önceden hazırlanmış I 2 9 5 9 çözeltisini polimer çözeltisine ekleyin. Nihai başlatıcı konsantrasyonunun ağırlıkça %0,05 olması için toplam jel set hacminin %10'u oranında ekleme yapın. Artık hücreler ve polimerizasyon karışımı, hidrojel içinde enkapsülasyon için hazırdır.

Santrifüj edilen hücrelerden süpernatantı aspire ederek başlayın. İlk aspirasyondan sonra sıvının çökmesini bekleyin ve hücre peletini bozmadan mümkün olduğunca fazla medyumu uzaklaştırmak için tekrar aspire edin. Hava kabarcıklarını önlemek için hücre peletini polimer çözeltisi ile resüspande edin.

Hücrelerin eşit şekilde dağılması için solüsyonu yavaşça yaklaşık 10 kez pipetle çekip bırakın. Kimyasal tip ekleme reaksiyonu için, polimer hücresine uygun hacimde çapraz bağlayıcı solüsyonu eklemek amacıyla geniş ağızlı bir pipet ucu kullanın. Karıştırın. Pipeti istenen tekil jel hacmine ayarlayın.

Homojenizasyon sağlamak için çözeltiyi pipetle aşağı yukarı hareket ettirin ve şırınga ucu kalıplarına aktarın. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için bu adımı hızlıca gerçekleştirin ve çapraz bağlanma için kültür kabininde 10 ila 30 dakika inkübasyona bırakın. Işıkla başlatılan serbest radikal çapraz bağlanması için.

Uygun hacmi şırınga ucu kalıplarına paylaştırın. Radikal çapraz bağlama için şırıngaları 365 nanometre dalga boyunda 10 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın. ACRL fonksiyonelleştirilmiş polimerler için santimetre kare başına dört miliwatt UV ışığı yaygın olarak kullanılır.

UV ışığına maruz bırakmadan önce hücre çökmesini en aza indirmek için bu adımı hızla gerçekleştirin. Çapraz bağlama işleminin ardından jelleri, inkübasyon ve analiz için besiyeri içeren bir doku kültürü plağının kuyucuklarına daldırın. Hidrojelin çapraz bağlanması ardışık olarak da yapılabilir.

Öncelikle, fonksiyonelleştirilmiş boya metolanmış rümini jel içerisine 20 nanomolar nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin. Boya, jelin radikal olarak çapraz bağlanmış bölgelerine tercihen dahil olduğu için desenlemenin görselleştirilmesine yardımcı olur. Ardından, aşağıdakiler için teorik çapraz bağların bir kısmını veren mik tipi polimerizasyon reaksiyonunu başlatın.

Serbest radikal çapraz bağlama için Adobe Photoshop veya Illustrator gibi bir programda tasarlanmış ve doğrudan şeffaf maskelere yazdırılmış bir maske kullanılması gerekecektir. Maske boyutları, yuvarlak şırınga üst kısmı ile uyumlu olmalıdır. Steril bir maskeyi doğrudan jel yüzeyine uygulamak için sterilize edilmiş cımbızlar kullanın ve jeli çapraz bağlamak için ışığa maruz bırakın.

Kapsüllemeden bir saat sonra HA tabanlı hidrojeller içindeki HMC'ler burada daha ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Sentezlenen hidrojeller genellikle şeffaf olduğundan, hücrelerin morfolojisi ışık mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir. Aynı hücrelerin canlılığı, kapsüllemeden 24 saat sonra floresan canlı-ölü boyama kiti kullanılarak görselleştirilmiştir.

Canlı hücreleri tespit etmek için kalsiyum M, ölü hücreler için ise ateryum homodimer kullandık ve %95'ten fazla canlılık gözlemledik. Ayrıca, hücrelerin assay reaktifini ne kadar iyi metabolize ederek renk değişimine yol açtığıyla ölçülen hücre proliferasyon seviyesini belirlemek için alamar blue assay uyguladık. Hücre boyama işlemi, parçalanabilir ve adhezif HA tabanlı bir hidrojel içine enkapsülasyondan yedi gün sonra, standart fiksasyon ve permeabilizasyon prosedürleri kullanılarak H HMC'ler üzerinde gerçekleştirildi.

Hücresel aktin, fluorescein ile işaretlenmiş phin kullanılarak ve çekirdekler dpi ile kısıtlanarak görünür hale getirilir. Hidrojel matrisi içindeki fokal yapışmaların görselleştirilmesi için cullin'e karşı immün boyama kullanılır. Histolojik boyama; radikal polimerize HMSC kapsüllü HA hidrojellerinin standart protokoller kullanılarakle dehidrasyonu, parafinle gömülmesi ve kesilmesi işlemlerinin ardından gerçekleştirilir.

Kültürde bir hafta geçtikten sonra, çekirdekleri işaretlemek için hematoksilin, bağ dokuyu işaretlemek için ASIN ve glikozaminoglikanlar için mavi boyalar ile boyama yapıldı. Enkapsüle edilmiş kök hücrelerin farklılaşmasını nicelleştirmek için Real-time PCR kullanılmıştır. Arka plan çıkarıldıktan sonra, ilgilenilen bir genin ekspresyon seviyesi, konstitütif olarak aktif bir housekeeping geni olan pasif referans sinyali ile karşılaştırıldığında, eşik floresansa ulaşılan döngü sayısı ile belirlenir. Böylece, hücrelerin 3D hidrojeller içine nasıl enkapsüle edileceğini ve hücrelerin jeller içindeki davranışlarının nasıl inceleneceğini göstermiş olduk.

Bu prosedürler kullanılırken, steril tampon çözeltilerin ve reaktiflerin uzun süre muhafaza edilmesiyle veya germisidal UV lamba ile sterilize edilerek materyallerin tamamen steril olduğundan emin olmak önemlidir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.