Doku Mühendisliği 3D Hidrojeller Hücresel Kapsülleme
October 26th, 2009
Biz, sentetik hidrojeller içinde hücreler 3 boyutlu (3D) kapsülleme için protokolleri mevcut. Kapsülleme işlemi kapsüllü hücre davranışlarını değerlendirmek için iki yaygın olarak kullanılan çapraz bağlanma yöntemleri (michael-tipi hafif başlatılan ek ve serbest radikal mekanizmaları) yanı sıra bir dizi teknik özetlenmiştir.
Hücrelerin kapsüllenmesi için aşamalı işlem, hidrojel kalıpların ve diğer malzemelerin hazırlanması ve sterilizasyonu ile başlar, ardından hücrelerin her bir jel seti için tüplere ayrı popülasyonlara izole edilmesiyle devam eder. Daha sonra hücrelerin varlığında asyon gerçekleştirilir, ardından in vitro veya in vivo inkübasyon süresi uygulanır. Hücre davranışı için aşağı akış analizi, canlılık, morfoloji, proliferasyon ve farklılaşma testlerini içerebilir.
Pennsylvania Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü'nden Dr.Jason Burdick'in laboratuvarından merhaba Amidio Kahan. Bugün size doku mühendisliği için 3D hidrojellerde hücresel kapsülleme için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü, hidrojel bileşiminin ve yapısının kapsüllenmiş hücrelerin davranışı üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıyoruz.
Öyleyse başlayalım. Bu işleme başlamak için, PBS'de foto başlatıcı hava kürü 2 9 5 9 veya I 2 9 5 9'un ağırlıkça %0,5'lik bir çözeltisini hazırlayın. Karıştırın ve karanlıkta 37 santigrat derecede iki ila üç gün inkübe edin.
Hazır olduğunda, çözeltiyi sterilize etmek ve oda sıcaklığında saklamak için bir şırınga filtresi kullanın. Ardından, gösterilmesi gereken polimer ve çapraz bağlayıcı miktarını hesaplamak için Microsoft Excel gibi bir elektronik tablo programı kullanın. İşte akrilat reaktif gruplarla işlevselleştirilmiş hyaluronik asit.
Ayrıca amino asit sistin, arginin, glisin ve aspartat ile fonksiyonel yapışkan alanı içeren penant peptidinin miktarını da hesaplayın. Sistin, polimere bağlanmak içindir. Artık gerekli polimer çapraz bağlayıcı ve pent miktarları belirlendiğine göre, bunları tartın ve her birini bir einor tüpüne yerleştirin.
Hesaplama elektronik tablosunu buna göre ayarlayın. Elde edilen gerçek polimer kütlesi için, devam edin Jel kalıpları hazırlamak. Ayrı ayrı sarılmış sterilin uçlarını kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.
Bir mililitre tek kullanımlık şırıngalar. Fotoğraf deseninden jellere kadar kullanılacak kalıplar için düz bir kesim yapıldığından emin olun. Son olarak, şırınga kalıplarını, EOR tüplerini, kapakları açık olarak ve diğer gerekli malzemeleri, biyolojik güvenlik kabinine yerleştirilmiş mikrop öldürücü bir ışık kaynağının altına 30 dakika boyunca yerleştirerek sterilize edin.
Sterilizasyon tamamlandıktan sonra, deney ekipmanının sterilizasyonunu takiben hücreleri hazırlamaya devam edin. Davlumbazda çalışın ve mikal tip çapraz bağlamada kullanılan polimere steril TEA ve serbest radikal çapraz bağlama için kullanılan polimere steril PBS ekleyin. Sarkıt parça tüplerine ve girdaba eşleşen tampon EKLEYİN.
Kolye parçasını çözmek için, kolye parçasını polimere tutturmak için peptit üzerindeki bir INE grubundan bir tiyol yoluyla alkillenmiş hyaluronik aside bağlanır, polimer çözeltisine ekleyin ve param ile kapatın. Kısaca vorteksleyin ve karıştırarak 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri hazırlarken, kolye parçası takılırken, kapsüllenecek hücreleri tryis, insan mezenkimal kök hücreleri veya HMC'leri PBS ile yıkayarak hazırlayın.
Daha sonra tripsin ile oda sıcaklığında bir dakika inkübe edin, tripsini çıkarın, 37 derecede beş dakika daha inkübe edin. Daha sonra tripsini nötralize etmek ve hücreleri plakanın yüzeyinden serbest bırakmak için HMSC büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri bir hemo sitometre ile sayın.
Sayılan hücreleri, her bir jel seti için uygun sayıyı içeren bölümlere ayırın. Mililitre başına 10 milyon hücre yoğunluğunda üç adet 50 mikrolitrelik jel seti için, 1,5 milyon hücreyi ayrı bir konik tüpe ayırın. Asyon zamanlaması nedeniyle tek bir sette dörtten fazla jel hazırlamayın.
Daha sonra hücreleri altı dakika boyunca 500 RCF'de santrifüjleyin. Oda sıcaklığında, hücreler dönerken, mikal baskı çapraz bağlama için polimerizasyon karışımını hazırlayın. Uygun konsantrasyonu elde etmek için çapraz bağlayıcıya tampon ekleyin.
Işıkla başlatılan serbest radikal çapraz bağlama için, önceden hazırlanmış I 2 9 5 9 çözeltisini polimer çözeltisine ekleyin. Ağırlıkça %0,05'lik bir nihai başlatıcı konsantrasyonu için toplam jel ayar hacminin %10'unda. Artık hücreler ve polimerizasyon karışımı, hidrojel içinde kapsüllenmeye hazırdır.
Snat'ı santrifüj hücrelerinden aspire ederek başlayın. İlk aspirasyondan sonra sıvının çökelmesini bekleyin ve hücre peleti Resüsünü bozmadan mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarmak için yeniden aspire edin. Hava kabarcıklarını önlemek için hücre peletini polimer çözeltisi ile askıya alın.
Çözeltiyi yaklaşık 10 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin, bu hücreleri eşit şekilde dağıtmak için yeterli olmalıdır. Mikal tip ekleme reaksiyonu için, polimer hücresine uygun hacimde çapraz bağlayıcı çözeltisi eklemek için geniş delikli bir pipet ucu kullanın. Pipeti istenen jel hacmine ayarlayın.
Homojenize etmek için çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyin ve Eloqua'yı şırınga ucu kalıplarına yerleştirin. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin ve çapraz bağlama için kültür başlığında 10 ila 30 dakika inkübasyona izin verin. Işık için serbest radikal çapraz bağlanma başlatıldı.
Uygun hacmi şırınga ucu kalıplarına alın. 365 nanometreye 10 dakikalık bir maruz kalma ile radikal çapraz bağlama için şırıngaları UV ışığına maruz bırakın. Santimetre kare başına dört miliwatt UV ışığı, ACRL işlevselleştirilmiş polimerler için yaygındır.
UV ışığına maruz kalmadan önce hücre çökelmesini en aza indirmek için adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin. Çapraz bağlamayı takiben, jelleri inkübasyon ve analiz için ortam içeren bir doku kültürü plakasının kuyucuklarına daldırın. Hidrojelin çapraz bağlanması da sırayla yapılabilir.
İlk olarak, işlevselleştirilmiş boya metollü rumini, jeldeki 20 nanomolar'lık bir nihai konsantrasyona ekleyin. Boya, tercihen jelin radikal olarak çapraz bağlı bölgelerine dahil olduğu için desenlemeyi görselleştirmeye yardımcı olur. Ardından, aşağıdakiler için teorik çapraz bağların bir kısmını veren mikrofon tipi polimerizasyon reaksiyonu ile başlayın.
Serbest radikal çapraz bağlama: Adobe Photoshop veya Illustrator gibi bir programda tasarlanmış ve doğrudan saydamlık maskelerine basılmış bir maske kullanılması gerekecektir. Maske boyutları yuvarlak şırınga üst kısmına uygun olmalıdır. Steril bir maskeyi doğrudan jel yüzeyine uygulamak için sterilize edilmiş cımbız kullanın ve jeli çapraz bağlamak için ışığa maruz bırakın.
Burada ayrıca, kapsüllemeden bir saat sonra HA bazlı hidrojeller içindeki HMC'ler gösterilmektedir. Sentezlenen hidrojeller tipik olarak şeffaf olduğundan, hücreler ışık mikroskobu kullanılarak morfoloji için görselleştirilebilir. Aynı hücreler, bir floresan canlı ölü boyama kiti kullanılarak kapsüllemeden 24 saat sonra canlılık açısından görselleştirildi.
Canlı hücreleri tespit etmek için kalsiyum M ve ölü hücreler için atherium homodimer kullandık ve% 95'ten fazla canlılık gözlemledik. Ayrıca, hücrelerin tahlil reaktifini ne kadar iyi metabolize ettiği ve bir renk değişikliğine neden olduğu ile ölçülen hücre proliferasyon seviyesini belirlemek için alamar mavisi testini kullandık. Hücre boyama, parçalanabilir ve yapışkan HA bazlı bir hidrojel içinde kapsüllemeden yedi gün sonra ve standart fiksasyon ve geçirgen prosedürler kullanılarak H HMC'ler üzerinde gerçekleştirildi.
Hücresel akton, floresein etiketli phin ve dpi ile sınırlandırılmış çekirdekler kullanılarak görülebilir. Cutlin hastalığına karşı immün boyama, hidrojel matrisi içindeki fokal adezyonların görselleştirilmesi için kullanılır. Histolojik boyama, standart protokoller radikal polimerize HMSC kapsüllenmiş HA hidrojeller kullanılarak dehidrasyon, parafin gömülmesi ve hidrojellerin kesitlerinin alınmasını takiben gerçekleştirilir.
Kültürde bir hafta sonra, çekirdekleri işaretleyen hemat toin ve bağ dokusu A'yı işaretleyen ASIN ve glikozaminoglikanlar için mavi lekeler ile boyandı. Gerçek zamanlı. PCR, kapsüllenmiş kök hücrelerin farklılaşmasını ölçmek için kullanılır Arka plan çıkarıldıktan sonra, ilgilenilen bir genin ekspresyon seviyesi, yapısal olarak aktif bir temizlik geni olan pasif bir referans sinyali ile karşılaştırıldığında eşik floresansına ulaşılan döngü numarası ile belirlenir. Bu yüzden size hücreleri 3D hidrojellerde nasıl kapsülleyeceğinizi ve jellerdeki hücrelerin davranışını nasıl inceleyeceğinizi gösterdik.
Bu prosedürleri kullanırken, steril tampon çözeltilerini ve reaktifleri uzun süreli tutarak veya mikrop öldürücü UV lambası ile sterilize ederek tam sterilite malzemelerinin sağlanması önemlidir. İşte bu kadar. Yıkadığınız için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
Genel Bakış
Bu makale, sentetik hidrojeller içinde hücrelerin 3D kapsüllenmesi için protokolleri sunar ve çapraz bağlanma ve hücre davranışı değerlendirme yöntemlerini ayrıntılı olarak açıklar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyomühendislik
- Doku Mühendisliği
Arka Plan
- 3D hücre kapsüllenmesi, doku mühendisliği uygulamaları için kritik öneme sahiptir.
- Hidrojeller, hücre büyümesi ve farklılaşması için destekleyici bir ortam sağlar.
- Farklı çapraz bağlanma yöntemleri hücre davranışı üzerinde etkisi olabilir.
- Bu yöntemleri anlamak, doku mühendisliği stratejilerini geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Hidrojeller içinde hücreleri kapsülleme prosedürlerini belirlemektedir.
- Farklı çapraz bağlanma tekniklerini karşılaştırmaktır.
- Kapsüllenmiş hücrelerin çeşitli koşullardaki davranışını değerlendirmektir.
Kullanılan Yöntemler
- Hidrojel kalıplarının hazırlanması ve sterilizasyonu.
- Hücre popülasyonlarının izolasyonu ve hazırlanması.
- Michael tipi ekleme ve ışıkla başlatılan serbest radikal mekanizmaları kullanarak çapraz bağlanma.
- Hücre canlılığı, morfoloji, proliferasyon ve farklılaşmanın sonraki analizi.
Ana Sonuçlar
- Hidrojeller içinde hücrelerin başarılı bir şekilde kapsüllenmesi sağlanmıştır.
- Farklı çapraz bağlanma yöntemleri hücre davranışını etkilemiştir.
- Kapsüllenmiş hücrelerin canlılığı ve morfolojisi değerlendirilmiştir.
- Hidrojel bileşimi ve yapısının sonuçları etkilediği gösterilmiştir.
Sonuçlar
- Kurulan protokoller çeşitli doku mühendisliği uygulamaları için kullanılabilir.
- Çapraz bağlanma etkilerini anlamak, hücre davranışı optimizasyonu için hayati öneme sahiptir.
- Gelecekteki çalışmalar bu bulgulara dayanarak doku mühendisliği tekniklerini geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
3D hydrogel encapsulation enables physiologically relevant cell culture models that improve predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. By mimicking native tissue microenvironments, this approach supports more translatable assessments of stem cell behavior, differentiation, and response to bioactive cues. It addresses a key discovery-stage challenge: reducing biological ambiguity when evaluating therapeutic candidates in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a tissue-like 3D context that better reflects in vivo conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing observation of cellular phenotype, viability, and differentiation under controlled matrix properties.
- Predictive Value: Improves confidence in lead identification by linking hydrogel composition to stem cell behavior and lineage specification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems suitable for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables quantitative readouts such as proliferation (via Alamar Blue), viability (live/dead staining), and morphology, supporting assay reproducibility.
- Platform Utility: Compatible with multiple crosslinking mechanisms (Michael-type addition, free radical) and polymer types (e.g., hyaluronic acid, PEG), allowing assay adaptation across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains biological relevance from discovery through preclinical validation by preserving stem cell multipotency and differentiation capacity in degradable, adhesive hydrogels.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of cellular behavior over time (e.g., one-week culture) to inform go/no-go decisions based on matrix-mediated effects on proliferation and lineage commitment.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through immunostaining of focal adhesions (e.g., vinculin) and histological analysis of glycosaminoglycan deposition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modalities requiring assessment of cell-matrix interactions and differentiation potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled study of how hydrogel structure influences stem cell fate and mechanotransduction.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D cultures with quantifiable outputs for viability, proliferation, and morphological analysis.
- Analytics: Generates measurable readouts including gene expression (via qPCR), protein localization (immunostaining), and metabolic activity, facilitating comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through degradation-adaptive hydrogels and extracellular matrix-like cues that model tissue remodeling.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, modular capability applicable across multiple projects in regenerative medicine, disease modeling, and mechanistic screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in stem cell responses to biomaterial cues.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined sterilization, crosslinking, and cell encapsulation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing earlier, more physiologically relevant functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their performance in tissue-mimetic environments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, hydrogel chemistry, and stem cell culture.
- Depends on access to UV light sources for photoinitiated crosslinking and standard tissue culture equipment.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel formulation and cell preparation protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring across different stem cell types or polymer backbones.
- Includes practical limitations such as gel settling timing constraints and the need for rapid processing to ensure uniform crosslinking.
