Larvaların olarak izlenmesi Kalp Fonksiyonu Drosophila melanogaster Fizyolojik Çalışmaları

Drosophila, kalbin gelişimi, işlevi ve temelindeki pacemaker aktivitesinin araştırılması için genetik açıdan caziptir. Bu prosedür, hem sağlam hem de diseke edilmiş larva preparatlarının nasıl hazırlanacağını ve kalp hızının nasıl izleneceğini göstermektedir. Diseke edilmiş preparat, iyon kanalı fonksiyonlarına daha fazla erişim sağlamak amacıyla hücre dışı veya hücre içi potansiyellerin kaydedilmesine de olanak tanır.

Merhaba, ben Kentucky Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nden öğretim üyesi Robin Cooper. Bugün öğrencilerim Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward ve Easter Boku, size Drosophila larvalarında kalp atış hızını izlemek için kullanılan çeşitli prosedürleri gösterecekler. Aşağıdaki kısıtlanmamış yönteme, larvaların tek bir odak düzleminde görüntülendiği için "karınca çiftliği" (ant farm) adı verilmektedir.

Larvaların en iyi şekilde gözlemlenmesi için, 1 cm x 0,5 cm'lik bir dikdörtgen alan üzerinde en iyi uzamsal çözünürlük ve büyütmeyi sağlamak amacıyla 2x taban objektifli ve 0,5x tüp objektifli bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Fotoğraflar ve videolar, oküler montajlı bir kamera aracılığıyla kaydedilebilir. Bu yönteme başlamak için, bir larvayı ince bir besin tabakasıyla birlikte iki lam arasında sıkıştırın.

Lamlar, dört tarafında bulunan plastik ara parçalarla 1 ila 1,5 milimetre mesafeyle tutulur. Larvanın başının aşağıya doğru bakmasını sağlamak için preparatı birkaç dakika boyunca 20 ile 45 derece arasında eğik tutun. Kalp atışlarını izlemek için mikroskop aynasını, kalbin veya iki trakenin en iyi kontrastını sağlayacak şekilde ayarlayın.

Yapıştırma yöntemi, larvaların bir lam üzerine sabitlenmesi için kullanılan kalıcı bir montaj yöntemidir. Yapıştırma yöntemine başlamak için, temiz bir lamellenin üzerine bir lam yerleştirin. Lamelin bir köşesine küçük bir damla hızlı yapıştırıcı sürün.

Ardından, larvaları suyla durulayın. Fazla yiyeceği uzaklaştırmak için sıvıyı bir peçete veya kağıt havlu köşesiyle emdirin. Larva tamamen durulandıktan sonra, temiz bir cımbızla nazikçe kaldırıp mikroskop altında lamelden uzağa, lam üzerine yerleştirin ve larvaları karınları üzerine gelecek şekilde yönlendirin.

Midenin üzerinde ince siyah kılların bulunduğu hafif yatay oluklar yer alacaktır. Larvaların sırt kısmı yukarı bakmalıdır ve trakealar olan iki paralel çizgiye sahiptir. Yalnızca yapıştırıcıyı taşımaya ayrılmış ikinci bir pens seti kullanarak, lamın ucundaki damladan küçük bir miktar alın ve bunu karşı taraftaki köşeye yerleştirin.

Cımbızın ucunu kaplayacak kadar çok küçük bir miktar kullanın. Hayvanı alın ve karnı siyah ağza dönük olacak şekilde yapıştırıcının üzerine yerleştirin.

Kancalar, lamelin kenarında veya kenarına yakın olmalıdır; ağız kancaları ve kahverengi spiral yapının yapıştırıcıya temas etmemesi gerekir. Larvayı düzleştirmek için üzerine nazikçe bastırın.

Bir test maddesi uygulamak için, en iyi yöntem bir şırınga ile larvaların başı yakınına küçük damlacıklar bırakmaktır. Spirallerin bir dakika içindeki atım sayısını sayarak kalp atış hızını gözlemleyin. Daha uzun süreli gözlemler için larvalar bulundukları yerde beslenebilir ve dehidrasyonu önlemek amacıyla nemlendirilebilir; mikroskop altında kullanılabilir bir diseksiyon plakası hazırlamak için, bir parça manyetik bandın merkezine skalpel ile iki santimetre çapında bir delik açın ve bunu bir lam üzerine yapıştırın.

Sabitlemeyi kolaylaştırmak için bükülmüş ve ataçlara yapıştırılmış diseksiyon iğneleri kullanın. Diseksiyon sırasında, sağlam bir üçüncü evre yıldız larvayı diseksiyon plakasına yerleştirin. Sırt kısmı yukarı gelecek şekilde konumlandırıldığında, trake kutikül üzerinden görünür olmalıdır.

Larvaların ağız kancalarının her iki yanına iki adet ve spirallerin her iki yanına iki adet daha iğne yerleştirin. Ardından, larvaları nemli tutmak için salin ekleyin. Daha sonra, arka uç kısmından yatay bir insizyon yapın ve bunu, spirallerin yanından hayvanın başına doğru devam eden boylamsal bir kesi ile takip edin.

Bir dorsal pini kaldırın ve kütikülün altına kancalayın. Yaymak için pini kullanın. Vücut boşluğunu açın.

Diğer üç pin ile işlemi tekrarlayın. Hayvan pinlerle sabitlenip açıldıktan sonra, trakeaya veya kalbe zarar vermemeye dikkat ederek iç organları çıkarın. Beyin ve bazı yağ cisimcikleri dahil bazı yapılar kalbe bağlıdır ve çıkarıldıklarında kalbe zarar verebilirler.

Diseksiyondan sonra preparatın üç ila beş dakika boyunca HL three salin banyosunda dinlenmesine izin verin; hücre içi ve alan kayıtları, farmakolojik ajanlar doğrudan kalbe uygulanırken bu preparat üzerinde gerçekleştirilir. Bu diseksiyon adımının toplam süresi üç ila altı dakikadır. Elektriksel pacing uygulamak için öncelikle fokal elektrotlar hazırlanmalıdır; fokal elektrot yapmak için, ateşle cilalamak amacıyla cam bir elektrodu ısıtma elemanının üzerinden geçirin ve yaklaşık 45 derecelik kademeli bir büküm yapın, ardından oda sıcaklığındaki HL three salin ile doldurulmuş fokal elektrodu, ucu aşağı bakacak şekilde manipülatöre monte edin.

Stimülatör telinin elektrot içindeki saline temas ettiğinden ve stimülatörün kapalı olduğundan emin olun. Mikroskoba taze bir kalp diseksiyon hazırlığı sabitleyin. Topraklama telini salinenin içine yerleştirin.

Pinlere dokunmamaya ve preparasyonu bozmamaya dikkat edin. Manipülatörü kullanarak elektrodu salin çözeltisinin içine indirirken odak noktasını elektrot üzerinde tutun. Salin çözeltisine girdikten sonra, elektrot ucunu lümen kalbe paralel olacak şekilde konumlandırın ve kalbe hafifçe temas ettirin.

Elektrot yerleştirildikten sonra, stimülatör frekansını iki hertz'e ayarlayın ve voltajı en düşük ayara getirin. Stimülatörü açın. Frekansı yaklaşık olarak üç hertz'e ayarlayın ve kalp atış hızı stimülatörün ritmiyle eşleşene kadar voltajı yavaşça artırın.

Ritim artık stimülatör aracılığıyla manipüle edilebilir. Kontraksiyonu veya elektriksel iletimi etkileyip etkilemediklerini görmek için bileşikler eklenebilir. Alan potansiyeli kayıtları gerçekleştirmek için, bir makro patch kayıt elektrodunu banyo ortamı ile doldurun ve bir bileşik mikroskop üzerindeki manipülatöre monte edin.

Elektrodu bir amplifikatöre ve kayıt düzeneğine bağlayın. Manipülatörü kullanarak elektrodun lümenini, mikroskoba sabitlenmiş bir diseksiyon hazırlığının kalbi üzerine indirin. Elektrod ucuyla kalbe çok hafifçe dokunun.

Kalbin başka bir bölgesinden alan potansiyellerini kaydetmek için alan kayıtları yapılabilir. Elektrodun ucunu nazikçe kaldırın ve manipülatör yardımıyla yeni bir bölgeye taşıyın, ardından uç alan potansiyeli kayıtlarını tekrarlayın. Larva miyositlerinin transmembran potansiyellerini ölçmek için kalpteki elektriksel sinyallerin hızının ve süresinin hassas bir şekilde izlenmesini sağlayın.

Öncelikle, 3 M potasyum klorür ile doldurulmuş keskin bir elektrodun lümeninin, dikeyden yaklaşık 45 derecelik bir açıyla kalbe karşı düz olduğundan emin olun. Doğru şekilde konumlandırıldıktan sonra, elektrot ucuyla kalbe nazikçe dokunun ve ucu bir hücrenin içine hafifçe vurun. Elektrot kırılmadıysa tekrar kullanılabilir.

Hücre içi kayıtlar, iyon kanalı mutasyonlarının veya kanal modülatörlerinin etkilerini incelemek amacıyla aksiyon potansiyelinin iyonik temelini ve potansiyellerin karakteristik şekillerini ölçmeye olanak tanır. Böylece, kalp kayıtlarının nasıl yapılacağını, ayrıca hücre içi ve alan potansiyellerinin nasıl alınacağını göstermiş olduk. Bu teknikleri, farmakolojik manipülasyonlar ve gen değişikliklerinin yanı sıra kalp üzerindeki değişimleri incelemek için kullanabilirsiniz.

Bu prosedür gerçekleştirilirken, kalbe bağlı olan ilişkili bir yapıyı çekmemek veya odak elektrodu ile çok sert bastırmamak önemlidir. Ayrıca yapıştırma yönteminde, ağzın veya kürenin kapanacak şekilde yapıştırılmamasına dikkat edin. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.