NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini
November 4th, 2009
Microvolume örnekleri doğal yüzey gerilimi, küvet ya da kılcal damarların kullanmadan örnekleri korumak için kullanan bir spektrofotometre sistem tarafından sayısal. Ölçülebilir olan protein konsantrasyonları ve hız dinamik aralık, bu yöntem büyük ölçüde artmıştır.
NanoDrop teknolojisi, nükleik asitler ve proteinler gibi küçük miktarlardaki numuneleri tutmak ve ölçmek için fiber optiği ve yüzey gerilimini birleştirir. Küçük bir numune damlası doğrudan alt kaide üzerine pipetlenir. Bir üst optik kaide daha sonra bir sütun oluşturmak için numuneyi birbirine geçirir.
Kaide, optimum yol uzunluğunu ayarlamak için otomatik olarak hareket eder. Yol uzunluğunun kısaltılması, çoğu protein numunesi için seyreltme yapma ihtiyacını ortadan kaldırır, ölçüm saniyeler içinde gerçekleşir ve vis spektrum sonuçları görüntülenir. Merhaba, ben Thermo Fisher Scientific'in NanoDrop Laboratuvarları'ndan Lynn Kalhorn.
Bugün, yenilikçi bir mikro hacim spektrofotometresi kullanarak protein konsantrasyonunu belirlemek için bir prosedür göstereceğiz. NanoDrop 2000 C.NanoDrop 2000 C spektrofotometresi, küvet veya kılcal damar kullanmadan mikro hacimli numuneleri iki optik kaide arasında tutmak ve ölçmek için sıvıların yüzey gerilimine dayanan yenilikçi bir numune tutma sistemi kullanır. Mikro numune doğrudan algılama yüzeyinin üstüne yerleştirilir ve yüzey gerilimi ile optik fiberlerin uçları arasında bir sıvı sütunu oluşturulur.
Bu sıvı kolon dikey bir optik yol oluşturur. Bir ksenon flaş lambası ışık kaynağını sağlar ve numuneden geçen ışığı analiz etmek için doğrusal bir CCD dizisi kullanan bir spektrometre kullanılır. Küvetler gibi geleneksel muhafaza cihazlarının sistemden çıkarılmasının çeşitli avantajları vardır.
Ölçüm için çok az miktarda numuneye ihtiyaç vardır. Bir ila iki mikrolitrelik temizleme, optik yüzeylerin bir laboratuvar mendili ile silinmesini gerektirir ve ölçüm sırasında yol uzunluğu gerçek zamanlı olarak otomatik olarak değişir. Ek olarak, yol uzunluğunun kısaltılması, daha yüksek konsantrasyonların ölçülmesini sağlar ve bu da çoğu protein numunesi için seyreltme yapma ihtiyacını etkili bir şekilde ortadan kaldırır.
Kinetik çalışmalar gibi bir veterinerin gerekli olduğu durumlarda, NanoDrop 2000 C aynı spektrofotometrede bir vete seçeneği sunar. Bu protokol için, protein konsantrasyonunu belirlemek için mikro hacimli kaide seçeneğini kullanacağız. Protein A iki 80 yöntemi, triptofan, tirozin ve fenil alanin kalıntıları veya sistein, sistein, diss sülfür bağları içeren ve 280 nanometrede absorbans sergileyen saflaştırılmış proteinlere uygulanabilir.
Bu işleme başlamak için, ana menüden protein A two 80 uygulamasını seçin. Dalga boyu doğrulama penceresi görünürse, kolun aşağıda olduğundan emin olun, açılır listeden ölçülecek numune türünü seçin. Varsayılan ayar, bir EMİLANSIN mililitre başına bir miligrama eşit olduğu çoğu bilinmeyen protein karışımı için önerilir.
Daha önce karakterize edilmiş saflaştırılmış bir protein ölçülüyorsa, kütle sönme katsayısı veya molar sönme katsayısı girilebilir. Protein konsantrasyonunu daha kesin bir şekilde belirlemek için, renk kodlu kutunun yanındaki açılır listeden konsantrasyon birimlerini seçin. Ardından, bir boşluk oluşturun.
Uygun bir tampon kullanarak, proteinin süspanse edildiği tamponu kullanmak önemlidir. Kullanılan tampon, numune çözeltisi ile aynı pH'a ve benzer bir iyonik kuvvete sahip olmalıdır. Farklı proteinler arasındaki yüzey gerilimindeki değişkenlik nedeniyle, uygun kolon oluşumunu sağlamak için iki mikrolitre numune yüklemenizi öneririz.
Yüklemek için, çözeltinin pipet ucunun dışına yapışmasını önlemek için çözeltiyi dışarı atarken düşük tutma pipet ucunu alt kaide yüzeyine dokunun, numunenin içine baloncuk girmesini ve patlamasını önlemek için tam numune miktarından daha azını dışarı atın. Numune yüklendikten sonra kolu indirin, boşa tıklayın. Boşaltma tamamlandığında, boş çözeltiyi alt ve üst kaidelerden silin.
Ölçüm için bir alikot almadan önce kuru bir laboratuvar mendili kullanarak, numunenin homojen olduğundan emin olmak önemlidir. Sıvıya mikro kabarcıklar girmesini önlemek için orta seviye bir RPM kullanarak nazikçe girdaplama yaparak numuneyi nazikçe ama iyice karıştırın. Uygun alana bir örnek kimlik girin.
Boşluk için daha önce gösterildiği gibi ilk numuneden iki mikrolitre yükleyin, kolu indirin ve tıklama ölçüsü Ölçüm tamamlandığında, numuneyi alt ve üst kaidelerden silin. Kuru bir laboratuvar mendili kullanarak, her ölçüm için iki mikrolitrelik yeni bir numune alikotu kullanarak diğer tüm numuneleri aynı şekilde ölçün. Ölçümler arasındaki optik kaideleri temizlemek için genellikle tüy bırakmayan sıradan bir laboratuvar mendili yeterlidir.
Uyumsuz olan ve kullanılmaması gereken tek çözücü hidroflorik asit çözeltileridir ve yüzey aktif maddeler içeren reaktifler zamanla ölçüm kaide yüzeylerini koşullandırabilir ve numune sıvı kolonunun oluşmasını önleyebilir. Alt kaide üzerindeki damlacığın düzleşmesi, optik yüzeyin yenilenmek için koşulsuz hale geldiğinin göstergesidir. Kaide yüzeyleri ya bir laboratuvar mendili kullanarak onları kuvvetlice parlatır ya da tercih edilen yöntem, belirtildiği gibi NanoDrop kaide yenileme bileşiği PR'yi kullanmaktır.
Numune, karakterize edilmemiş bir protein çözeltisi, hücre lizatı veya ham protein özütü ise, NanoDrop 2000 C'de bulunan önceden yapılandırılmış kolometrik yöntemlerden birini kullanmanızı öneririz. BCA testi burada gösterilecektir. BCA testi için gerekli reaktifler, termos bilimsel delici indirgeyici ajan uyumlu kit BCA, reaktif A, B, C, A, reaktif B ve sığır serum albümin standartlarında bulunur.
Standartlarımız, durumunuz için hangi test standartlarının uygun olduğunu belirlemek için pierce BCA literatürüne atıfta bulunduğundan, pierce'ın önceden seyreltilmiş albümin setini kullanacağız. Reaktifleri hazırlamak için önce tüm bilinmeyen proteinleri ve protein standartlarını oda sıcaklığına dengeleyin ve hafifçe girdaplama ile iyice karıştırın. Sıvıya mikro kabarcıklar girmesini önlemek için orta seviye bir RPM kullanın.
Kabarcıklar okumaları olumsuz yönde etkileyebileceğinden. Bu örnekte B.In 50'ye bir oranında reaktif A kullanılarak ölçülecek standartlar ve numuneler için yeterince taze çalışma reaktifi hazırlayın, referans beş standardı ve altı numuneyi kapsayacak şekilde üç mililitre çalışma reaktifi hazırlayacağız. Düzenli BCA testi daha geniş bir dinamik aralığı kapsar ve 20'ye bir reaktif / protein oranı kullanırken, mikro BCA testi daha hassastır ve bire bir reaktif / protein oranı kullanan daha dar bir dinamik aralığa sahiptir.
Düzenli BCA tahlilini gerçekleştirdiğimiz için, numuneye 20'ye bir oranında çalışma reaktifi hazırlayacağız. Tüm numuneleri ve standartları kapsayacak kadar tüp ile her tüpe 190 mikrolitre çalışma reaktifi ekleyin. Daha sonra, reaktif içeren tüplerin her birine 10 mikrolitre standart veya numune ekleyin.
Hafifçe girdap yaparak iyice karıştırın. Tüpleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, reaksiyonların yaklaşık 10 dakika oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
Protein A two 80 yönteminden farklı olarak, protein BCA yöntemi, numune protein konsantrasyonları ölçülmeden önce standart bir eğrinin oluşturulmasını gerektirir. Standart bir eğri oluşturmak için, ana menüden protein BCA yöntemini seçerek başlayın. Dalga boyu doğrulama penceresi görünürse, kolun aşağıda olduğundan emin olun.
Sağ bölme tablosuna her standart konsantrasyon için değerleri girin. Yazılım, referans ve yedi adede kadar ek standarda izin verir. Referans ve/veya standartlar kopyalar halinde ölçülebilir.
Uygun arabelleği kullanarak bir boşluk oluşturun. Renk metrik tahlilleri için boşluk genellikle deiyonize edilir. Su: Alt kaide üzerine iki mikrolitre su pipetleyin ve kolu indirin.
Boş tıklayın. Referans ve standartların sonraki tüm ölçümlerini kapsamak için yalnızca bir boşluk gereklidir. Alt kaide üzerine iki mikrolitrelik bir Eloqua sadece çalışan reaktif ve protein içermeyen tampon pipetleyerek referansı oluşturun.
Kolu indirin ve ölç'e tıklayın. Standartlar sekmesi altında, istenen standardı vurgulayın ve istenen standarttan iki mikrolitreyi alt kaide üzerine pipetleyin. Kolu indirin ve ölç'e tıklayın.
İşlemi tüm standartlar için tekrarlayın. Standart eğriyi görüntülemek için, Standart eğriyi görüntüle'yi tıklatın. Tüm standartlar ölçüldükten sonra numuneler düğmesine tıklayın.
Numune kimliğini girin, alt kaide üzerine iki mikrolitre numune yükleyin ve ölçüme tıklayın. Her ölçüm için iki mikrolitrelik taze bir numune alikotu kullanılmalıdır. Ölçüm tamamlandığında, kuru bir laboratuvar mendili kullanarak numuneyi alt ve üst kaidelerden silin.
Daha sonra, numunenin nihai konsantrasyonu standart eğri kullanılarak otomatik olarak hesaplandığı için sonuç elde edilir. Protein konsantrasyonunu belirlemenin iki yolunu gösterdik, ya doğrudan iki 80 ölçümü ya da her biri mikro hacimli NanoDrop 2000 C spektrofotometresini kullanan dolaylı bir renk metriği yöntemiyle. Bu kadar.
İzlediğiniz için teşekkürler.
Genel Bakış
NanoDrop 2000 C spektrofotometresi, proteinler ve nükleik asitlerin mikro hacim örneklerini geleneksel küvetler olmadan ölçmek için yenilikçi teknoloji kullanır. Bu yöntem, ölçüm hızını ve dinamik aralığı artırarak, verimli protein konsantrasyon tayini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Analitik Kimya
- Protein Analizi
Arka Plan
- NanoDrop teknolojisi, örnek tutma için fiber optik ve yüzey gerilimini kullanır.
- Küçük örnek hacimlerinin (1-2 µL) doğrudan ölçülmesini sağlar.
- Küvetlerin ortadan kaldırılması, örnek gereksinimlerini ve temizleme süresini azaltır.
- Sistem, seyreltme gerektirmeden yüksek konsantrasyonları ölçebilir.
Çalışmanın Amacı
- NanoDrop 2000 C kullanarak protein konsantrasyonunu belirleme prosedürünü göstermek.
- Mikro hacim spektrofotometrisinin avantajlarını vurgulamak.
- Cihazın etkili kullanımı için kılavuzlar sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Örneğin doğrudan optik kaide üzerine pipetleme.
- Uygun bir tamponla kalibasyon için boş bir kutu kullanma.
- Protein konsantrasyonu için 280 nm'de absorbans ölçümü.
- Karakterize edilmemiş proteinler için BCA gibi renkli analizleri kullanma.
Ana Sonuçlar
- NanoDrop 2000 C, hızlı ve doğru protein konsantrasyonu ölçümleri sağlar.
- Yüzey gerilimi, analiz için mikro hacim örneklerini etkili bir şekilde tutar.
- Gerçek zamanlı yol uzunluğu ayarı, ölçüm doğruluğunu artırır.
- Ölçümler arasında minimal örnek temizleme gerekir.
Sonuçlar
- NanoDrop 2000 C, araştırma ortamlarında protein analizi için değerli bir araçtır.
- Tasarımı, ölçüm sürecini basitleştirir ve örnek israfını azaltır.
- Renkli yöntemler, çeşitli protein örneklerine uygulanabilirliğini genişletir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Microvolume protein quantification addresses the challenge of limited sample availability in early-stage discovery, enabling precise target validation with minimal material. The NanoDrop 2000c enhances predictive confidence by delivering rapid, reproducible concentration data without dilution, supporting go/no-go decisions in lead identification. Its real-time path length adjustment and broad dynamic range improve assay standardization across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of purified protein samples using A280 absorbance for rapid assessment of expression and purity.
- Operational Value: Reduces sample consumption to 1-2 µL, preserving precious material for downstream assays.
- Predictive Value: Supports functional target validation by providing accurate concentration inputs for activity and binding studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of standardized protein inputs for biochemical and cell-based assays via precise quantification.
- Operational Value: Eliminates cuvette use and dilution steps, accelerating assay setup and improving reproducibility.
- Scalability: Enables high-throughput readiness through rapid measurement and simple wipe-clean protocol between samples.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by enabling quantification of protein standards and samples in BCA-based assays.
- Preclinical Model Relevance: Ensures accurate dosing in functional studies by providing reliable concentration data for lysates and extracts.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies through precise protein normalization.
Pipeline & Workflow Integration
The NanoDrop 2000c fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation, supporting consistent protein quantification across stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling accurate normalization of protein samples in pathway and interaction studies.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible protein inputs for enzyme, binding, and functional screens.
- Analytics: Provides quantitative A280 and colorimetric readouts that allow comparison across conditions and samples.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via reliable quantification in BCA assays for standard curves and sample analysis.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared, reusable platform for protein quantification across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing variability in protein input quantification.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through automated path length adjustment and minimal sample handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample waste and accelerating measurement timelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable concentration data for go/no-go decisions in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory training in pipetting and sample handling for microvolume techniques.
- Depends on access to a NanoDrop 2000c spectrophotometer and compatible laboratory wipes for surface maintenance.
- Necessitates cross-team standardization on blanking procedures and buffer matching for accurate results.
- Involves adaptation considerations for viscous or surfactant-containing samples that may affect surface tension-dependent column formation.
- Includes practical limitations such as incompatibility with hydrofluoric acid and surfactant-rich reagents that can degrade optical surfaces over time.
