Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

İlk olarak, konfluen bir T 25 umsl alıyoruz. Önce PBS ile yıkıyorum ve ardından birkaç damla TR ekleyip birkaç dakika bekletiyorum. Hücrelerin plakadan ayrılmaya başladığını görebiliyorum, yani işlem neredeyse tamamlandı.

Tamam, şimdi tripsinizasyonla ayrıştırılmış göz hücrelerini toplayacağım; koloni kümelerini parçalamak ve onları UN plağına yerleştirmek için tripsinize maruz kalmış hücreleri kısa bir süre için pipetle hafifçe karıştırmak iyi bir fikirdir. Bunlar inkübatörde yaklaşık 30 ila 45 dakika bekletilecektir. Şimdi, hücreleri toplamak için santrifüjle çöktüreceğim ve ardından aspirasyon yapacağım.

Hücreleri sayabilmek için birkaç dakika içinde resüspansiyon yapacağım. Resüspansiyonu gerçekleştirdim ve sayımı yaptım; şimdi bir alikot alıyorum ve bu alikotu 50 mL'ye tamamlayacağım. Hücrelerin sağlıklı olduğundan emin olmak için damla başına yüz hücre elde etmemi sağlayacak uygun konsantrasyonu bu şekilde ayarlayacağım. Artık bir rezervuarımız var.

Bunları tekrar hafifçe çalkalayıp rezervuarımıza boşaltıyoruz. Tamam, bu zaten programlanmış. İşte oldu.

Şu an oldukça düzgün görünüyor. Ters çevirip bir kenara ayırın. Her birkaç plakada bir, sıvının biraz çalkalanması için plakayı hafifçe eğiyorum.

Tamam, böylece beş plaka oldu. Şimdi bunları inkübatöre yerleştireceğim. Bunlar, iki gün önce hazırladığımız asılı damlalarımızdır.

Toplama işlemi için damlacıkları toplamak amacıyla plakaları sallamanız yeterlidir. Her şeyi toplayacağım ve EV'leri çok fazla bozmamak için bunu nazikçe yapmaya çalışacağım; beş veya altı ml PBS alıp plakaları yıkayacağım. Ardından bunları en az 10 dakika bekleteceğiz ve EV'ler yer çekimiyle çökecektir.

EBS'lerin çöktüğünü görsel olarak onayladığınızda, süpernatantın çoğunu, ancak tamamını değil, çünkü örneğinizi bozmak istemezsiniz, uzaklaştırırsınız. Tamam. Artık altıncı güne kadar bekletin. Bunlar, altı gün önce embriyonik kök hücrelerden hazırlanan embriyo cisimcikleridir ve genellikle bunları toplamak için plakaları hafifçe dairesel hareketlerle sallarız.

Plakaları çalkaladığınızda, hücreler tabağın merkezine doğru toplanır ve onları düzeltmek biraz daha kolaylaşır. Şimdi, hücrelerin yerçekimi ile tüpün dibine çökmesini bekleyin; ardından medyumu uzaklaştırın ve 10 mL, yaklaşık 10 ila 12 mL PBS ile bir kez yıkayın. Tamam, şimdi bunları bir dakika bekletelim.

Şimdi sadece P'yi çıkaracağım. Ardından 250 µL enzim karışımımızı ekliyoruz ve bir mililitre ekleyip bunları 37 °C'lik su banyosuna yerleştiriyoruz. Arada bir, belki birkaç kez yanına gelip, çöken EDTA'yı karıştırmak için tüpleri hafifçe sallayacağım. Şu anda gpro'dan temin ettiğimiz, enzim içermeyen bu hücre ayrıştırma tamponuna sahibiz.

Her tüpe bundan yaklaşık 8 mL ekleyeceğiz. Ardından, hücreleri ayrıştırmak için 5 mL'lik bir pipetle tekrarlayan hareketler yapacağız; bu işlem sırasında karışım oldukça bulanıklaşacaktır. Bu durum, hücrelerin besiyerinde dağıldığını gösteren görsel bir işarettir. Şimdi hücreleri triklüzyon yöntemiyle sayacağım; eğer bir enfeksiyon gerçekleştiriyorsanız veya MOI hesaplıyorsanız, hücreleri saymanız oldukça önemlidir.

Sadece uygun konsantrasyondaki virüs, besiyeri, hücreler ve protein sülfat içeren büyük bir karışım hazırlayacağım. Ve ardından, hücrelerin süspansiyondan çıkması konusunda tekrar takıntılı olduğum için hücrelerden emin olacağım. Bu yüzden her zaman, ayrıca çok fazla sıçratmamaya dikkat ederek 2.500 rpm'de santrifüj ediyorum.

Böylece, tüm yıkama sıvılarını saklayarak 10. gündeki hücrelerimizi topluyorum. Eskiden propidium iyodür (PI) kullanırdım ancak 7'niz o kadar parlak değil. Bu nedenle diğer kanallara çok fazla sızmıyor ve çok daha temiz.

Şimdi değişkeni alıyoruz ve bu, hacim nedeniyle iğnedeki kaybı önlemek için iyi bir yöntemdir. Ben Shannon McKinney Freeman. Boston Çocuk Hastanesi'ndeki George Families Life laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım.

Bugün, fare embriyonik kök hücrelerinden transplantasyon yapılabilir bir hücre popülasyonunun, yani transplantasyon yapılabilir hematopoetik sistemin nasıl türetileceğini inceleyeceğiz. Bu deneyi neden yapıyoruz? Bildiğimiz üzere, bu sistemi kullanarak, öncelikle, öldürücü radyasyon uygulanmış fareleri kurtarabilen, hematopoetik sistemlerini uzun süre boyunca, yani organizmanın yaşamı boyunca ve periferik kanın tüm soy hatlarında yeniden oluşturabilen, hematopoetik kök hücre aktivitesine sahip bir hücre popülasyonunu embriyonik kök hücrelerden türetmek amacıyla nihai protokol geliştirilmiştir.

Protokolün geliştirilme nedeni budur. Şimdi, elde ettiğimiz bu genişletilmiş hücre popülasyonu içerisinde, hematopoetik kan kök hücresi aktivitesini gerçekte yöneten hücre popülasyonunun fenotipini anlamak için daha ileri deneyler yapıyoruz. Çünkü popülasyonun oldukça heterojen olduğunu ve fareleri gerçekte kurtaran hücrenin, bu hücre popülasyonu içerisinde son derece nadir olduğunu biliyoruz.

Bu nedenle, bu oldukça heterojen hücreler arasından saflaştırabilmek için temel olarak fenotipini tanımlamaya çalışıyoruz. Ardından, fonksiyonel olarak, bütün kemik iliğinden elde edilebilecek gerçek bir hematopoetik kök hücre ile nasıl karşılaştırıldığını anlamakla en çok ilgileniyoruz. Gelişimsel olarak eşit yeniden yapılandırma yeteneğine sahip mi, yetişkin kemik iliği HSC'sini yansıtıyor gibi görünüyor mu?

Veya belki de bir hematojenik kök hücreye daha çok benzeyebilir. Erken gelişimi örneğin GM'de veya fetal karaciğerde bulabilirsiniz. Dolayısıyla, nihayetinde anlamaya çalıştığımız şey budur ve bu soruları anlamak istiyoruz çünkü sonuç olarak, bu protokolün insan embriyonik kök hücreleri ile yapmak istediğimiz benzer çalışmalara bilgi sağlamasını istiyoruz.

Matematik sistemiyle edindiğimiz bilgilerin, gelecekteki deneylere büyük fayda sağlayacağını düşünüyoruz. Bence burada birkaç nokta var. Öncelikle bu, hem iyi bir in vitro modeli hem de gelişim için iyi bir in vivo modelidir.

Öncelikle hematopoetik kök hücrelerin gelişimini anlamaya çalışıyoruz. Bu nedenle, ektopik gen ekspresyonu için oldukça minimal olan ve bu durumların hematopoetik kök hücre gelişimini nasıl etkilediğini inceleyebildiğimiz güzel bir sistemdir. Bu durum, temel bilim açısından oldukça faydalıdır.

Ancak nihayetinde, insan hücrelerinden nakledilebilir metabolik kök hücreler elde etmek amacıyla klinik olarak kullanılabilecek bir tür hücre tabanlı terapi geliştirmek istiyoruz. Fakat bu, muhtemelen gelecekte gerçekleşecek bir hedef. Aslında, en zor kısmın hücrelerin kendilerini elde etmek değil olduğunu keşfettik; titiz deneyler sonucunda, hücrelerin alıcı hayvanlarımızı yeniden yapılandırmasını sağlamakta zorlandığımız bir dönem olduğunu gördük.

Ve sonunda keşfettiğimiz şey, alıcıların ablasyonuna çok dikkat etmemiz gerektiğiydi çünkü bu hücreler yeterli kapasiteye sahip değildi. Genellikle, kemik iliği türevli hücrelerle farelere transplantasyon yaptığınızda, fareleri ablate etmek için 10 veya 11 Gray radyasyon uygularsınız ve kemik iliği hematopoetik kök hücreleri hayvanları bu durumdan kurtarmada oldukça yetkindir. Ancak, genişlettiğimiz bu hücre popülasyonunun, hayvanları bu kadar yüksek dozda radyasyondan kurtarma kapasitesinin olmadığı ortaya çıktı.

Bu nedenle, hayvanların boyutuna dikkat ederek ışınlama dozunu çok dikkatli bir şekilde ayarlamamız gerekti. Çünkü hayvanlar çok büyük olduğunda ve aynı dozu kullanmaya çalıştığımızda, etkili bir şekilde ablasyon yapılamadığını gördük. Öte yandan, hayvanları yeterince ışınlamazsanız, hücreler daha dirençli konakçılarla rekabet edemezler.

Aslında, bunun önemli bir değişken olduğunu ve bu hücrelerin ab aktivitesini gözlemlememizi zorlaştırdığını anladığımızda, temel olarak ışınlama dozunu titrasyonla belirledik ve ayrıca hayvanın yaşının ve ağırlığının çok anlamlı olduğunu fark ettik; deneylerimiz ancak bu noktadan sonra oldukçale tekrarlanabilir şekilde çalışmaya başladı. Keşfettiğimiz şey, yaklaşık 20 gram, yani 15 ila 20 gram arasındaki hayvanlar kullanıldığında ve 9.25 gray ile ablasyon yapıldığında, bunun bu hücrelerin fareleri yeniden yapılandırmak için ihtiyaç duydukları avantajı sağlayan mükemmel doz olduğu yönündedir. Evet, bence bu en önemli değişkenlerden biriydi.

Diğer önemli husus ise enjekte ettiğiniz hücre sayısı olacaktır. Model organizmamızı ışınlamak için kullandığımız bu özel koşullar altında titrasyon yaptık. Ayrıca farelere enjekte ettiğimiz bu fraksiyona ayrılmamış, heterojen hücre havuzunun sayısını da titredik.

Temel olarak, hayvanları kurtarmak için yaklaşık 2 milyon ila 5 milyon hücre gibi bir minimum doza ihtiyaç olduğunu saptadık. Bundan daha az enjekte ederseniz, hayvanlar kurtarılmıyor. Bence bu durum, muhtemelen bu heterojen kompartıman içinde kurtarmayı sağlayan hücrenin nadirliğini gösteriyor.

Bu nedenle, en önemli değişkenlerin enjekte ettiğiniz hücre sayısı olduğunu ve kullandığınız nakil modeli ne olursa olsun, hücrelerin yeniden oluşmak için ihtiyaç duydukları avantajı sağlayacak kadar, ancak onları kurtarmaya yetmeyecek kadar fazla olmaması için tüp içindeki hücreleri yeterince azalttığınızdan emin olmanız gerektiğini düşünüyorum. Bunlar, ana ve temel değişkenler olmuştur.