Name: Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: Öğrenin, fare embriyonik kök hücrelerinden nakledilebilir hematopoetik kök hücrelerin türetilmesi yöntemini. Bu protokol, ölümcül radyasyona maruz kalan farelerin hematopoietik sistemini yeniden oluşturarak kök hücre gelişimini araştırmaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Embriyonik Kök Hücre Farklılaşması <ol><li> ESC tripsin ile tedavi ile embriyonik kök hücreler (ESC) yakın bir konfluent balon toplayın. </li><li> Farklılaşma medya 5 ml hücreleri yeniden süspanse edin ve olmayan bir-jelatin kaplı T25 transfer. 37 ° C&#39;de 45 dakika için. Süpernatant Al ve santrifüj yoluyla hücreleri toplamak. Not: ESC kültürlerden gelen Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) olmayan jelatin kaplı T25 kolayca tutunur ve böylece bu kaplama adımı sırasında kültür tükenmiş. MEFS üzerinde kültür sizin ESC değilseniz, ön-plaka atlayabilirsiniz. </li><li> 333.333 cells/50 ml Farklılaşma medyada yeniden süspanse MEF-tükenmiş ESC. Bu yoğunlaşma, 100 ESC/15 ml sonuçlanır. </li><li> Kullanımı çok kanallı pipet, cells/15 15 cm 2 petri tabak 100 mL damla plaka ESC. 8 kanallı pipet ile, plaka başına 18-22 satır (plaka başına 5 ml hakkında) damla hakkında sığdırmak mümkün olmalıdır. Not: Bu protokol, damla 2-5 15 cm 2 yemekleri yeterli olandan daha fazla olacak ve 2-5 x 10 6 gün altı EB-kaynaklı hücrelerin boyun eğmek zorundadır . </li><li> Damla yavaşça ters plakaları çevirin. Için 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 ile 48 saat inkübe edin . </li><li> Havuz yavaşça 15 ml konik tüp plakaları ve transfer dönen düşer. 4-6 mL PBS plakalar durulayın ve 15 ml konik aynı eklemek. Not: beş damla plakalar asılı havuzu olabilir. EBS farklılaştırmaya devam ederler ve onlar da yoğunlaştığı takdirde büyük öbekler şeklinde eğilimi artacaktır. </li><li> Ağırlık (yaklaşık 10 dakika) tarafından toplanmış EBS yerleşmek için izin verin. EBS rahatsız olmadan süpernatant aspire. 10 ml Farklılaşma medya ve 10 cm yapışmaz petri tabak transfer yavaşça tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 50 rpm ve 37 ° inkübe plaka çalkalayıcı yerleştirin petri tabak ° C% 5 CO 2. </li><li> 24 saat sonra (farklılaşma dört gün), girdap plakaları petri merkezinde EBS konsantre. Dikkatle döviz, 5 ml taze Farklılaşma Medya ile medya% 50 (5 ml). İki gün daha inkübatör plakasını dönün. </li></ol> MSCV-HoxB4-IRES-GFP ile EB disosiasyon ve enfeksiyon <ol><li> Farklılaşma altı günü günde 15 ml konik tüp EBS aktarın. Yerçekimi ile yerleşmek için izin verin. </li><li> 10 ml PBS içinde aspire medya ve tekrar süspansiyon haline getirin. EBS yerçekimi ile yerleşmek için izin ver. Aspire PBS. </li><li> 250 ml disosiasyon enzim karışımı ve 1 mL PBS ekleyin. Bazen enzimler ve EBS karıştırmak için tüp dönen, 37 ° C su banyosunda 20 dakika inkübe edin. </li><li> 8 mL enzim disosiasyon tampon ekleyin. </li><li> EBS tamamen ayrışmış kadar karışımı (aşırı pipetleme EB-kaynaklı hücre hazırlama içinde ölüm artacak yaklaşık 10 kez) 5 ml pipet kullanarak Karışım. <ol><li> Karışım EBS ayrıştırmaları olarak hücreleri ile bulutlu olacak. </li><li> Öğütme sırasında konik tüp alt karşı pipet yerleştirmek disosiasyon büyük ölçüde kolaylaştıracak bir kuvvet oluşturacaktır. </li></ol></li><li> Santrifüj yoluyla hücreler toplayın. </li><li> 5 ml% 10 IMDM içinde süspanse edin hücreleri EB-türetilmiş ve tripan mavisi dışlama kullanarak saymak Not: farklılaşma gün dört ve altı gün arasında, EBS cavitate, altı günde, apoptoz ve hücre death.Thus büyük miktarda sonuçları EB-türetilen hücrelerin% 30 yukarı tripan mavi ile leke olabilir. </li><li> Süspanse edin EB-elde edilen 100.000 hücre hücre / 2 mL% 10 IMDM + viral supernatant gibi bir İçişleri Bakanlığı 5-10 nihai konsantrasyonu 8 mg / ml protamin sülfat achieved.Add. Not: plaka dört adet 6-iyi levhalar (2 ml / varsayarak) yeterli EB / viral supernatant karışımı hazırlayın . </li><li> Levha 2 mL EB / viral supernatant karışım başına iyi OP9 stroma hücreleri (aşağıya bakınız) ile ön kaplama dört 6 kuyucuğu. </li><li> 2500 devirde 90 dakika süreyle oda sıcaklığında plakaları santrifüjleyin. 37 ° inkübatör plakaları transfer ° C,% 5 CO 2. </li><li> 4-6 saat sonra, plakalardan supernatant hasat ve santrifüj yoluyla durdurulması kalan herhangi bir potansiyel hücreleri toplamak. </li><li> 48 ml% 10 IMDM yeniden süspanse pellet (küçük olabilir) + sitokinler. Uygulama 2 mL / enfeksiyon yapıldı ve süpernatant toplanan edildiği orijinal dört 6-kuyucuğu için tabanda. Not: Sürekli kullanım sırasında taze% 10 IMDM + sitokinler hazırlar. </li><li> Plakalar için 37 ° C&#39;de% 5 CO 2 ile yedi gün inkübe edin . Kolonileri gün dört sonrası enfeksiyon ve büyük ve yedi gün iyi biçimli görünür olmalıdır. Sağlam bir genişleme / yedi günde 40-60 koloniler boyun eğmek zorundadır. </li><li> Gün yedi post-enfeksiyon, tripsin ile tedavi bütün kuyulardan (OP9 stroma dahil) tüm hücreleri toplamak ve havuz. Not: süpernatant veya tripsin treatment.At Bu noktada kültür sırasında istihdam PBS yıkar atmayın, bazı koloniler sadece gevşek yapışmış olabilir ve birçok hücre floa vardırting suspension.Collect ve havuz tüm yıkar ve supernatant potansiyel olarak değerli hücreler atılır sağlamak. </li><li> 8 ml taze% 10 IMDM yeniden süspanse hücreler + sitokinler. 2 mL / şişesi dört T75 şişeler içine dağıtın. Her balona ilave bir 13 mL% 10 IMDM + sitokinler ekleyin. 37 ° ° C&#39;de üç gün için% 5 CO 2 (toplam on gün sonrası enfeksiyon). </li></ol> Kültür ve kaplama OP9 stroma <ol><li> % 20 a-MEM standart protokollere göre OP9 stroma koruyun. Confluency için yetiştirilen OP9 hücrelerin özellikleri değişecektir. Her zaman 1:3 &#39;ten daha fazla bölünmüş confluency% 80 ayrıldı. </li><li> 25.000 /% 20 a-MEM dört adet 6-iyi plakaları MSCV-HoxB4 IRES-GFP, plaka OP9 hücreleri ile altı gün EB-kaynaklı hücrelerin enfeksiyonu önce 24 saat. </li></ol> Koleksiyon, bölme ve transplantasyon <ol><li> Tripsin ile on gün ile tedavi için OP9 stroma hücreleri genişletilmiş toplayın. Hücreleri saymak. Not: süpernatant veya PBS atmayın tripsin tedavisi sırasında istihdam yıkar. Kültür, bu noktada, bazı koloniler sadece gevşek yapışmış olabilir ve suspension.Collect ve havuz, potansiyel olarak değerli hücreler atılır olduğundan emin olmak için tüm yıkar ve supernatant yüzen birçok hücre vardır. Not: iyi bir genişleme toplam 160-200 x 10 6 hücre, 40-50 x 10 6 hücre / enfekte orijinal 6-plaka arasında boyun eğmek zorundadır. </li><li> Hücreler protokolde bu noktada standart tekniklere göre manyetik boncuk seçimi veya FACS ile fraksiyone olabilir. </li><li> Transplantasyonu için retro-orbital veya kuyruk damar enjeksiyonu ile hücreler, ışınlama 2.5 saat 9.25 ji bölünmüş bir doza maruz Rag-2/gc eksik alıcıları (15-22 arasında gram ağırlığında) sunuyor. dışında. Not: hayvanların kilo ışınlama sırasında 15-22 gram arasında kalan KRİTİK. 22 gramdan büyük ise, uygun ablasyon 9.25 ji sağlamak ve hücreleri öldürücü radyasyon ve / veya aşılamak hematopoetik bölmesi kurtarma aracı olmayabilir yeterli doz ışınlama olmaz. Büyük hayvanların nakli, uygun ışınlama dozu deneysel olarak tespit edilmelidir. </li><li> 2-5 x 10 6 hücre / hayvan en az bir doz öldürücü ışınlama kurtarma garanti etmek için gereklidir . Hücreleri fraksiyonasyon ise, 2-5 x 10 6 hücre eşdeğerleri (örneğin hücre fraksiyone olmayan havuz ilgi nüfusunun% 10 temsil ediyorsa, 2-5 x 10 5 hücre / hayvan enjeksiyon) enjekte edilir. Not:&gt; 2 x 10 6 hücre enjekte DAİMA yüksek sayıda hücre retro-orbitally teslim edildiğinde neden olabilir yörüngede, teratom oluşumunu önlemek için kuyruk damar yoluyla enjekte. </li><li> Koru Rag-2 - / - / gc / - otoklavlanmış kafeslerde eksik alıcıları. Hayvan tesisi &quot;temizlik&quot; bağlı olarak, transplantasyon sonrası hayvanların ölümcül radyasyon izleyen 5 hafta boyunca asitlendirilmiş su veya Trimethiprim Sulfasoxazole (Septra) verilmesi gerekebilir. </li><li> Transplantasyon sonrası 3 hafta periferik kan&gt;% 90, GFP + ES-türetilen lökosit bekliyoruz. Lenfositler retroviral HoxB4 IRES-GFP susturmak için Aşı bilinmesine rağmen, çok soyundan olmalıdır. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6 Rag-2/gamma-c eksik fareler</td><td>Hayvan</td><td>Taconic Farm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaka çalkalayıcı</td><td>Araç</td><td>VWR international</td><td>33998-360</td><td>Ikaworks Orbital Shaker</td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet</td><td>Araç</td><td>VWR international</td><td>15000-174</td><td>BioHit ePet</td></tr><tr><td>ES tripsin</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td>PBS içinde %0,25 Tripsin</td></tr><tr><td>Standart tripsin</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>%0,05 Tripsin-EDTA</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Tampon</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Enzimsiz disosiasyon tamponu</td><td>Tampon</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Disosiasyon enzim karışımı</td><td>Tampon</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>500 mg Collagenase IV</td></tr><tr><td>Hiyalüronidaz</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2126</td><td>500 &amp;mu;L'lik alikotlar halinde dondurun ve tekrarlayan dondurma-çözme işlemlerinden kaçının.</td></tr><tr><td>DNAz</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>10-017CV</td><td></td></tr><tr><td>Protamin sülfat</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3369</td><td>8 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>EB diferansiyasyon ortamı</td><td>ortam</td><td></td><td></td><td>Lütfen ekli Protocol.doc dosyasındaki tarife bakınız</td></tr><tr><td>%10 IMDM</td><td>ortam</td><td></td><td></td><td>Lütfen ekli Protocol.doc dosyasındaki tarife bakınız</td></tr><tr><td>%10 IMDM+sitokinler</td><td>ortam</td><td></td><td></td><td>Lütfen ekli Protocol.doc dosyasındaki tarife bakınız</td></tr><tr><td>%20 anti-MEM</td><td></td><td></td><td></td><td>Lütfen ekli Protocol.doc dosyasındaki tarife bakınız</td></tr></tbody></table>

murin embriyonik kök hücre hematopoetik kök hücre türetilmesi

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Bir kök hücre kapasitesine sahip bir hücre olarak tanımlanan, hem kendini yenilemek ve birden fazla farklılaşmış döl oluşturmak. Embriyonik kök hücreler (ESC), erken embriyo blastosist türetilmiştir ve pluripotent differentiative yeteneği vardır. Onların engin differentiative potansiyel klinik olarak yararlı bir hücre türleri oluşturmak için onları nasıl ikna edebilmeyi çözmekten merkezli birçok araştırmanın odak yaptı. Fare ESC hematopoietik kök hücrelerin (HSC) başarılı türetme tamamlanmıştır ve bu video protokolde görüntülendi olabilir. HSC, tartışmasız en çok klinik istismar hücre popülasyonu, hematopoetik maligniteler ve bozukluklar sayısız tedavi etmek için kullanılır. Bununla birlikte, birçok hastada HSC tedaviden yarar olabilir uygun donör erişim yoksundur. ESC, bu hastalar için HSC alternatif bir kaynak sağlayabilir. Aşağıdaki protokol ESC-HSC okudu ve insan ESC HSC izole etmek için çabalar bilgilendirmek edilebileceği bir temel kurar. Bu protokol, ESC, piyasada bulunan serum ön elemeden optimal hematopoetik farklılaşma 6 gün embriyoid organları (EBS) olarak ayırt edilirler. EBS sonra ayrışmış ve retroviral HoxB4 ile enfekte. Fare ve ortak kültür varlığı on gün sitokinler teşvik hematopoez - Enfekte EB-elde edilen hücreler, M-CSF / calvaria türetilmiş bir kemik iliği stromal hücre hattı OP9 stroma kaplanmıştır. Bu ko-kültür sırasında, enfekte olan hücreleri nesil 100&#39;ün üzerinde milyonlarca hücreden heterojen bir havuz, büyük ölçüde genişletmek. Bu hücreler daha sonra kurtarma ve sulandırmak ölümcül ışınlanmış fareler için kullanılabilir.

Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Kök hücre, hem kendini yenileme hem de birden fazla farklılaşmış yavru hücre üretme kapasitesine sahip bir hücre olarak tanımlanır. Embriyonik kök hücreler (EKH) ...

İlk olarak, konfluen bir T 25 umsl alıyoruz. Önce PBS ile yıkıyorum ve ardından birkaç damla TR ekleyip birkaç dakika bekletiyorum. Hücrelerin plakadan ayrılmaya başladığını görebiliyorum, yani işlem neredeyse tamamlandı.Tamam, şimdi tripsinizasyonla ayrıştırılmış göz hücrelerini toplayacağım; koloni kümelerini parçalamak ve onları UN plağına yerleştirmek için tripsinize maruz kalmış hücreleri kısa bir süre için pipetle hafifçe karıştırmak iyi bir fikirdir. Bunlar inkübatörde yaklaşık 30 ila 45 dakika bekletilecektir. Şimdi, hücreleri toplamak için santrifüjle çöktüreceğim ve ardından aspirasyon yapacağım.Hücreleri sayabilmek için birkaç dakika içinde resüspansiyon yapacağım. Resüspansiyonu gerçekleştirdim ve sayımı yaptım; şimdi bir alikot alıyorum ve bu alikotu 50 mL'ye tamamlayacağım. Hücrelerin sağlıklı olduğundan emin olmak için damla başına yüz hücre elde etmemi sağlayacak uygun konsantrasyonu bu şekilde ayarlayacağım. Artık bir rezervuarımız var.Bunları tekrar hafifçe çalkalayıp rezervuarımıza boşaltıyoruz. Tamam, bu zaten programlanmış. İşte oldu.Şu an oldukça düzgün görünüyor. Ters çevirip bir kenara ayırın. Her birkaç plakada bir, sıvının biraz çalkalanması için plakayı h

derivation-hematopoietic-stem-cells-from-murine-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Insan embriyonik kök hücrelerin kendi kendini yenilemek ve vücudun tüm hücre tipleri içine ayırt yeteneği ve geliştirme ve hastalık temel sorulara yanıt için bir araştırma aracı olarak hem tıbbi uygulamalar için çok ümit vericidir. Burada, embriyoların iç hücre kütlesinden immunosurgical izolasyonu ile insan embriyonik kök hücrelerin derivasyon için bir özlü, adım adım protokolü sağlar.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Embriyonik kök hücrelerin (ESC'ler) farklılaşmasında zamansal gen ekspresyonunun manipüle edilmesi, indüklenebilir gen sistemleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarının oluşturulması maliyetli ve zaman alıcıdır. Bu protokol, ES'den türetilmiş hücrelerin ayırt edilmesinde bir transgenin hızlı ekspresyonunu ve ardından aşağı akış hematopoietik farklılaşmasının analizini sağlar.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Bu protokolde, hem fare hem de insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesi gösterilecektir. Bu protokoldeki ana strateji, embriyonik kök hücre hatlarına tasarlanmış floresan raportörler kullanarak kardiyak progenitör hücreleri akış sitometrisi ile zenginleştirmektir.

Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Fare embriyonik kök hücreleri, OP9-DL1 ko-kültür sistemi kullanılarak in vitro olarak T hücrelerine farklılaştırılabilir. Bu prosedürde başarı, reaktif/hücre bakımına ve tekniğe duyarlı temel adımlara dikkat edilmesini gerektirir. Burada bu kritik parametreleri tartışıyor ve bu teknolojinin benimsenmesini teşvik etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

T hücrelerinin türetilmesi İn Vitro Fare Embriyonik Kök Hücreleri

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Bu makalede, verimli bir şekilde elde ve pluripotent kök hücre satırlarından fare embriyoların blastosist aşamasında kültür için bir protokol.

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Burada fare embriyonik gelişim sırasında hematopoetik kök hücre öncüleri klonal analizi için metodoloji mevcut. Endotel hücre ortak kültür ve fenotipik özellikleri ve tek hematopoetik öncüleri potansiyelini engraftment karakterize nakli ile embriyonik aort-erbezi-mesonephros bölgesinden tek hücre dizin sıralama birleştirin.

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

Burada hemojenik endotel hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerinden yaklaşık 1 hafta içinde yönlendirilmiş farklılaşması için basit bir protokol sunulmaktadır.

Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması

Öğrenin, fare embriyonik kök hücrelerinden nakledilebilir hematopoetik kök hücrelerin türetilmesi yöntemini. Bu protokol, ölümcül radyasyona maruz kalan farelerin hematopoietik sistemini yeniden oluşturarak kök hücre gelişimini araştırmaya yardımcı olur.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Daha fazla video keşfet