İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Ribo nükleer proteinlerin pre mRNA'lar üzerindeki bağlanma bölgelerini haritalamak için, ilgilenilen prem NNA'nın belirlenen bölgesini 30 nükleotid penceresinde döşemekle başlayın ve döşenmiş oligoları bir dizi üzerine sentezleyin. Oligolar diziden kaynatılır ve ilgilenilen bir RNP ile çökeltilir. Toplam başlangıç havuzu SCI üç ile etiketlenir ve bağlı havuz SCI beş ile etiketlenir ve her ikisi de algılama dizisine uygulanır.

Dizi daha sonra taranır ve sonuçları yorumlamak için özellik çıkarma yazılımı kullanılır. Tuzlar. Merhaba, ben Brown Üniversitesi MCB Bölümü'ndeki Will Fair kardeşin laboratuvarından Kate Watkins. Bugün size laboratuvarda prem RA üzerindeki bir RNA protein kompleksinin kesin konumunu belirlemek için hızlı ve ucuz bir prosedür göstereceğim, yeniden prem A'yı örtüşen oligonükleotidlerden oluşan bir havuz olarak sentezleyeceğim.

Bu havuz daha sonra eş immünopresipitasyon ile bağlı ve bağlanmamış bir fraksiyona ayrılabilir ve daha sonra bir mikrodizi ile analiz edilebilir. Bu prosedürün birçok uygulaması olsa da, onu çoklu ekleme faktörlerini ve bunların rolünü ve alternatif birleştirmeyi incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedüre başlamak için, prem A havuzunu tasarlamak için belirli genleri, ek yerlerini veya diğer ilgi alanlarını indirmek için uc SC genom tarayıcısını kullanın. İlgilenilen pencereleri seçin, ardından 30 nükleotid okuma uzunluğu ve 20 nükleotid örtüşmesi ile hesaplamalı olarak döşeyin, böylece her oligo bir öncekinden 10 nükleotid kaydırılır. Artık 30 nükleotid uzunluğundaki oligolar, her biri evrensel primer dizilerine sahip yan tarafta tanımlanmıştır.

Oligoları, özel bir oligonükleotid mikrodizisine yazdırmak için Agilent'e gönderin. Mikrodizi geldiğinde, dizi kapak sürgüsünü bir dizi hibridizasyon odasına yerleştirerek ve slayta 500 mikrolitre deiyonize suyu nazikçe pipetleyerek DNA oligolarını yüzeyinden geri kazanmaya başlayın. Mikrodizi sürgüsünü, her bir sürgüdeki etiketler birbirine bakacak şekilde kapak sürgüsünün üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve oligo geri kazanım sürecini bozabilecek hava kabarcıklarından kaçınmaya dikkat edin.

Hibridizasyon odasını kapatın ve bir hibridizasyon fırınında gece boyunca 99 santigrat derecede döndürün Ertesi gün, diziyi hazneden dikkatlice çıkarın ve şimdi dizi yüzeyinden serbest bırakılan oligoları içeren suyu çekin. Serbest bırakılan oligo havuzunu 1.5 mililitrelik bir einor tüpüne yerleştirin ve her seferinde üç ila beş saniyelik darbeler için üç kez% 50 genlikte potansiyel kümeleri parçalamak için sonikat yapın. Daha sonra, uçlarına bir T promotörü eklenmiş evrensel primerler kullanarak havuzu düşük döngülü PCR ile yükseltin.

Gerekli döngü sayısı, oligo geri kazanımının verimliliğine bağlı olarak değişebilir. Akrilamid jel üzerinde bulaşmış bir bant olarak görünen aşırı yükseltmeden kaçının. Son olarak, RNA'yı yazıya dökmek için Amon'un mega kısa komut dosyası kitini kullanın.

Transkripsiyon reaksiyonunu, RNA'nın fenil kloroform ekstraksiyonu ile sonlandırın, ardından sodyum asetat ve ayrıca taşıyıcı olarak gliko mavisi kullanılarak etanol çökeltme ile sonlandırın. Resus, RNA peletini 105 mikrolitre TE tamponunda süspanse eder. RNA'nın konsantrasyonunu doğru bir şekilde belirlemek için.

Standart bir eğri oluşturmak için ribo yeşili kullanın. Ardından bir floresan plaka okuyucu kullanarak ölçün. RNA havuzu artık aşağı çekmeye başlamak için birlikte immünopresipitasyon için hazırdır.

İlk olarak, protein A ve protein G dyna boncuklarını bire bir oranda, reaksiyon başına 50 mikrolitrelik bir nihai hacme birleştirerek manyetik boncukları hazırlayın. Süpernatanı çıkarmak için manyetik bir ayırma standı kullanarak boncukları tek bir yerde konsantre edin. Ardından, ikinci yıkamadan sonra eşit hacimde soğuk bir XPBS ile iki kez yıkayın.

Resus, boncukları eşit miktarda soğuk bir XPBS'de askıya alın ve iki nanogram antikor perion ekleyin. Bu miktar antikora bağlı olarak değişebilir, bu nedenle antikoru boncuklara bağlamak için en uygun koşulları bulmak için deney gerekli olabilir. Karışımı gece boyunca dönen bir platform üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin.

Sabahları, spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek için sonikasyonlu maya toplam RNA'nın reaksiyonu başına iki mikrogram ekleyin ve dört santigrat derecede 30 dakika daha döndürün. Engelleme adımı tamamlandıktan sonra, süpernatanı çıkarmak için tekrar manyetik rafı kullanın. Daha sonra boncukları iki kez soğuk bir XPBS ile yıkayın ve PBS'yi tüpteki ikinci yıkamadan 50 mikrolitre boncuk karışımını yeni tüplere bırakın.

Her co IP reaksiyonu için bir tüp. Boncuklar artık işbirliği için hazırdır. Ardından, RNA oligo havuzunu nükleer hücre özü ile birleştirerek ana karışımı hazırlayın.

RNP kaynağı olarak, toplam numune koruması olarak ana karışımın 50 mikrolitrelik bir alikotunu alın: Evrensel primerlerin RNA versiyonları olan primerler, primer dizisine protein bağlanmasını veya RNA'ya ikincil yapının eklenmesini önlemek için eklenebilir. Ko immünopresipitasyonunu başlatmak için, süpernatanı boncuk alikotlarından çıkarın ve boncukları kalan ana karışımın 120 mikrolitresinde yeniden süspanse edin. Reaksiyonları bir ila iki saat boyunca dört santigrat derecede sallayın.

Kuluçka süresinin sonunda, boncuklar da dahil olmak üzere küçük bir Eloqua her bir ipten çıkarılabilir. Bağlanma verimliliği veya özgüllüğünün ek testi için, reaksiyonların geri kalanını mıknatısın üzerine yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Soğuk bir XPDS ile bir ila iki yıkama ile takip edin.

RNP yoluyla boncuklar üzerindeki antikora bağlanan RNA, IP örneğidir. IP boncuklarını 0,1 XTE tamponunda 50 mikrolitre %1 SDS'de yeniden askıya alın ve numuneleri 65 santigrat derecede 15 dakika ısıtın. RNA'yı elüte etmek için, daha önce boncuklara bağlanan ve fenil kloroform ekstraksiyonu ile temizlenen RNA'yı içeren süpernatanı çıkarın, ardından bir etanol çökeltmesi ile peleti 50 mikrolitre 0.1 XT tamponunda yeniden askıya alın.

Ardından, ters üniversal astarları kullanarak numuneleri ters çevirin. Daha sonra PCR, numuneleri, biri bir T yedi promotör içermesi gereken evrensel primerlerle çoğaltır. Havuzu yükseltmek için gereken döngü sayısı, ortak ipin verimliliğine bağlı olacaktır.

Ambion'un mega şort komut dosyası kitini kullanarak örnekleri tekrar yazıya dökün, ancak bu sefer kit ile birlikte gelen T yedi UTP yerine iki mikrolitre amino alel UTP ekleyin. Amino alel UTP daha sonra RNA'yı yan gözlerle etiketlemek için kullanılacaktır. Transkripsiyon tamamlandığında.

Fenil kloroform özütü ve etanol numuneleri çökeltir. Numunelerin diziye hibridizasyonunu engelleyebilecek gliko mavisi veya amonyum asetat kullanmayın. Resus, peleti 4,5 mikrolitre 0,1 molar sodyum karbonat içinde süspanse eder.

Önce numuneleri etiketlemek için toplam numuneye 2,5 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Üç mikrolitre S3 ekleyin ve üç mikrolitre SCI beşte IP örneğine ekleyin. Karanlıkta bir saat kuluçkaya yatırın.

Oda sıcaklığında, her numuneye altı mikrolitre dört molar hidroksil lamine HCL ekleyerek reaksiyonu sonlandırın, iyice karıştırın ve döndürün. Kısa bir süre 15 dakika inkübe edin Oda sıcaklığında, etiketli numuneleri fenil kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çökeltme ile saflaştırın. Rengin çoğu, serbest nükleotidlerle organik faza çekilir, bu nedenle peletler gözle görülür şekilde renklendirilmeyebilir.

Resus, her peleti 50 mikrolitre 0.1 XTE içinde süspanse eder. Aşağıdaki istisna dışında mikrodizi örneğini hazırlamak için Agilent dizi hibridizasyon kiti talimatlarını izleyin. RNA'yı parçalamayın: Parçalanma tamponunu ekledikten sonra, parçalanmayı durdurmak için hemen hibridizasyon tamponunu ekleyin.

Numuneleri diziye yerleştirin ve dizi dönerken üç saat boyunca 50 santigrat derecede hibritleyin. Aşağıdaki 50 mililitrelik çözeltileri 50 mililitrelik konik tüplerde hazırlayın. İki fazla SC tamponundan oluşan bir tüp, bir fazla deniz tamponundan iki tüp ve bir tüp deiyonize su.

Üç saatlik inkübasyondan sonra, dizi slayt sandviçini dikkatlice açın ve iki XSSC tamponuna yerleştirin. Bir cımbız kullanarak. Diziyi kapak kızağından yavaşça ayırın.

Diziye dokunmamaya dikkat ederek kapak sürgüsünü yavaşça çıkarın. Sürgü dışarı çekilirken koniği kapatın ve 60 saniye boyunca hafifçe ters çevirin. Cımbızı kullanarak, diziyi tek bir XSSC çözümüne aktarın.

Tüpü kapatın ve bir dakika boyunca yavaşça ters çevirin. Ardından diziyi ikinci XSSC çözeltisine aktarın ve tekrar bir dakika daha yavaşça ters çevirin. Son olarak, diziyi deiyonize su tüpüne aktarın ve 30 saniye boyunca hafifçe ters çevirin.

Sürgünün kenarlarını bir silme mendilinin üzerine yerleştirerek diziyi kurulayın. Oligoları içeren tarafı bozmamaya dikkat ederek silme üzerindeki diziyi döndürmeye devam edin. Diziyi boş bir konik tüpe yerleştirin ve diziyi taramaya devam edin.

Diziyi taramaya devam edin. İşte temsili bir dizi. Her özellik veya oligo, toplam zenginleştirilmemiş havuz için yeşil veya IP ile zenginleştirilmiş havuz için kırmızı renktedir.

Her özellikteki sinyal, o kanaldaki toplam yoğunluğa normalleştirilir. Nihai çıktı, kırmızı kanalın yeşil kanal üzerindeki log oranıdır. Dizideki her özellikte, her genomik koordinattaki ortalama puan verilen konumla eşlenir.

Bu ortalama alma adımının bir örneği, her 10 nükleotid penceresi için ortalama zenginleştirme puanının gösterildiği iki, dört ve 0.5 puanlı üç örtüşen 30 nükleotid oligosu için verilmiştir. Burada, CLTA genindeki poli perin izlenen bağlayıcı protein PTB için bir bağlanma şeması örneği, gen özellikleri alt kısım boyunca verilmiştir ve PTP'ye bağlı S için log ortalama zenginleştirme skorları koyu kırmızı dikey çubuklarla temsil edilmiştir. Açık kırmızı çubuklar, PTP bağlaması için zenginleştirilmemiş alanları gösterir.

Alternatif olarak dilimlenmiş aksonlar gibi ilgi alanlarını döşeyen bir oligonükleotid havuzunun nasıl hızlı ve verimli bir şekilde oluşturulacağını gösterdim. Havuzlarımızı mikrodizi ile analiz ediyoruz, ancak bunları ışıklı, Lexi dizilimi veya daha geleneksel Sanger dizilimi ile sıralamak da mümkün. Bu prosedürü yaparken, havuzun oluşturulmasının RNA veya protein düzeyinde modifikasyona açık olduğunu hatırlamak önemlidir.

RNA düzeyinde, oligonükleotid dizisine otolog bölgeler, hastalık mutasyonları, polimorfizmler veya rastgele mutasyonlar ekleyebiliriz. Protein seviyesinde, RNA bağlanma faktörü fosforilasyon veya diğer translasyon sonrası modifikasyonlarla modifiye edilebilir. Ayrıca, bağlanma ortamı, ilgilenilen RNA bağlayıcı protein ile rekabet eden veya etkileşime giren ek faktörlerin seviyelerini artırmak veya azaltmak için manipüle edilebilir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.