Name: İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-02T15:46:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Keşfedin, ribonükleoproteinlerin insan pre-mRNA üzerindeki bağlanma bölgelerini hızlı ve yüksek çözünürlüklü haritalamak için özel dizayn edilmiş örtüşen oligonükleotit havuzları kullanarak bu hesaplamalı yöntemi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Havuz tasarımı ve oligo kurtarma <ol><li> Incelenmesi gereken ilk adım, pre-mRNA havuzu tasarımı. Bu UCSC Genom Tarayıcı kullanarak ve belirli genler, ek kavşaklar, ya da diğer ilgi alanları indirme yapılabilir. </li><li> Ilgi pencereler seçildikten sonra, onlar karşısında kiremit hesaplama aşağıdaki koşullar kullanılarak okuma süresini, bu nedenle her oligo önceki 20 nükleotidler kaydırılır bir 10 nükleotid örtüşme, 30 nükleotid olmalıdır. * Oligo örtüşme yeterli kapsama sağlamak için ek sitelerine yakınlığı artan olmalıdır; 10 20 nükleotidler örtüşme artırarak bunu başarabilirsiniz. </li><li> Havuz downstream yükseltmek için kullanılan olacak evrensel astar dizileri, her biri 30 nükleotid oligo Kanat. Agilent, dizileri, özel bir oligonükleotid mikroarray basılacaktır Çinili oligo siparişleri teslim edilmelidir. </li><li> Mikroarray yüzeyinden DNA oligos kurtarmak için bir dizi hibridizasyon odasında dizi kapak slayt slayt üzerine yerleştirerek ve hafifçe 500 mcL dH 2 O pipetleme başlamak </li><li> Sandwich kapağını kaydırarak üstüne dizi, süreci bozabilir hava kabarcıklarını önlemek için özen. Oligos ile yan su yüzeyine dokunarak böylece dizi yüz aşağı yere emin olun. Başparmak bir kural dizisi üzerinde Agilent etiket kapak slayt Agilent etiketi karşı karşıya olduğu "Agilent dokunur Agilent" anlamına </li><li> Hibridizasyon odasına kapatın ve bir melezleşme fırında 99 ° C'de gece boyunca döndürmek. </li><li> Ertesi gün, dikkatle odasından dizi kaldırmak ve oligos dizi yüzey kurtuldu içeren su, çekmek. Bu oligo havuzu </li><li> Havuz için 1.5 ml Eppendorf tüp 3-5 ikinci bakliyat yerleştirin ve% 50 genlik havuzu sonikasyon </li><li> Sonra, sonuna T7 etiketiyle evrensel primerler kullanılarak, düşük devir PCR ile havuz yükseltmek. Için ilk turda 94, doğasını ° C 1 dakika 20 saniye boyunca 55 ° C'de tavlama ve 72 az 1 dakika için uzatıyoruz ° C. Bir sonraki tur için, 10 saniye, 20 saniye ve 10 saniye 72 az 5 dakika nihai bir uzama adım ° C ile ilgili her sıcaklıkta Havuz yükseltmek için gerekli döngülerinin sayısını oligo kurtarma etkinliğini bağlı olduğundan, birden fazla döngüsü numaraları denemek için gerekli olabilir. Bulaşmış bir akrilamid jel üzerinde bir grup tarafından anlamına havuzu, aşırı yükseltmek için dikkatli olun. PCR amplifiye örnekleri gerekli ° C ye kadar 4 saklanabilir. </li><li> Oligo hazırlanmasında son adım Ambion MEGAshortscript ™ kiti kullanılarak RNA yazıya. * Aşağıdaki protokol Ambion adapte edilmiştir <ol class="lalpha"><li> Oda sıcaklığında T7 10x Reaksiyon Tamponu, dört ribonukleotid çözümler su ve buz üzerinde T7 Enzim Mix tutarken çözülme </li><li> Reaksiyon karışımı oda sıcaklığında bir RNaz ücretsiz mikrosantrifüj tüp birleştirin. Reaksiyon tamponu Bileşenleri tepki buz üzerinde işlendiği takdirde DNA çökelmesine neden olabilir. </li><li> Aşağıdaki sırayla, pipet 3 mcL nükleaz içermeyen su, 10x reaksiyon tamponu 2 mcL, her 75 mM NTP çözüm 2 mcL, 5 mcL (PCR amplifiye oligo havuzu) DNA ve 2 T7 enzim mcL 20 mcL son hacim </li><li> Tüp, ardından kısa bir süre tüpün alt karışımı toplamak için mikrofuge'de reaksiyon karışımı hafifçe vurun. </li><li> Bir PCR reaksiyonu 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin. İnkübasyon süresi şablon bağımlı olacaktır, bu nedenle, maksimum verim için en uygun inkübasyon süresi belirlemek için bir süre ders deney kullanmak için gerekli olabilir </li><li> 2 saat sonra, ek bir 15 dakika için 37 reaksiyon ve inkübe Turbo DNaz 1 mcL ekleyerek ° C DNA kaldırmak </li><li> Reaksiyon feshedebilir ve RNA, fenol / kloroform ekstraksiyon ve etanol yağış kurtarmak. <ol class="lalpha"><li> 20 mcL reaksiyon hacmi için 115 dH 2 O mcL ve reaksiyon 3 M sodyum asetat 15 mcL ekleyin. </li><li> Asidik fenol ve kloroform 75 mcL 75 mcL ekleyin sonra iyice karıştırın. 13.000 rpm hızında oda sıcaklığında bir dakika sonra mikrofuge'de, vorteks çözüm karıştırın. Yeni bir tüp sulu tabaka transferi ve çıkarma tekrarlayın </li><li> Yeni bir tüp sulu tabaka transferi ve kloroform 150 mcL ekleyin. Vorteks, daha önce olduğu gibi karışım ve santrifüj. Yeni bir tüp sulu aktarın. </li></ol></li><li> % 100 soğuk etanol iki cilt sulu katman ekleme ve iyi karıştırma RNA kurtarın. -20, 15 dakika en az karışımı soğutun ° C daha sonra 4 santrifüj ° C maksimum hızda 15 dakika boyunca pelet RNA. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 0.1x Tris-EDTA (TE) Tampon 105 mcL pelet tekrar süspansiyon haline getirin .. </li></ol></li><li> Bu, tüm serbest nükleotidler T7 Kit tepki kaldırmak için en doğru sonuçları, RiboGreen kullanarak RNA miktarını zordur. <ol class="lalpha"><li> Kantitatif başlamak için, ilk 2.300 mcL + 50μL/sample yeterli 1x TE sulandırmak. </li><li> Sonra, RiboGreen olun. 1000 gerekecektir mcL + 50 mcL / örnek. Yüksek oranda örnekleri (1 mcg / ml ile 20 ng / ml), 1x TE RiboGreen 1:200 karışımı, düşük aralık örnekleri için (50 ng / ml 'ye 1 ng / ml), 1x TE RiboGreen 1:2000 karışımı ; Pipet opak bir plaka her kuyuya RiboGreen çözüm 50 mcL, A1 ile başlayan ve aşağı hareket değil, karşısında </li><li> 2 yüksek oranda numune veya 100 ng / mcL düşük aralık örnekleri için mikrogram / ml RNA stok çözeltinin </li><li> Orijinal 2 mcg / ml veya 100 ng / ml stok altı sonraki 01:02 dilüsyonları stok çözümlerini kullanarak, standart bir eğri oluşturmak; PCR şerit tüpe stokunun Pipet 240 mcL. Kalan 7 tüpleri, pipet 1x TE 120 mcL. RNA stok 120 mcL alın ve tüp 2 ile karıştırın. Tüp 2 120 mcL alın ve tüp 3 ile karıştırın. Tüp 7 kadar tekrarlayın. Tube 8 sadece TE olacak ve boş olacaktır. Opak levha, A1, standart eğri çözümler Pipet 50 mcL: H2 (eğri iki kez çalıştırmak) </li><li> Yeni bir tüp, oligo havuzu 5 mcL TE 45 mcL karıştırın ve 50 mcL RiboGreen, içerir iyi 50 mcL ekleyin. </li><li> Bir plaka okuyucu kullanarak bir dalgaboyu 485 nm ve 530 nm emisyon dalga boyu ile bir dakika karıştırın, sonra üst floresan okumak ve plaka okuma için makineyi </li><li> -20 ° C'de muhafaza edilmelidir kurtarılan RNA ölçmek için oluşturulan standart eğrisi, kullanın </li></ol></li></ol> Bir ilgi RNP oligo havuzu Co-immunoprecipitation <ol><li> Co-immunoprecipitation başlamadan önce protein, A ve G Dynabeads Invitrogen gelen protein reaksiyon başına 50 mcL son hacmi 1:1 oranında karıştırılarak hazırlar. Örneğin, iki reaksiyon için 50 mcL her boncuk her eklersiniz. </li><li> Süpernatantı eşit hacimli soğuk 1x PBS ile iki kez kaldırmak ve boncuklar yıkayın boncuk yerde tutmak için Novagen bu gibi bir Manyetik Ayırma Stand kullanın </li><li> İkinci yıkamadan sonra, soğuk 1x PBS eşit hacimde boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin ve 2 ng başına antikor reaksiyonu ekleyin. Bu miktar antikor bağlı olarak değişebilir, deneme optimal koşullarda bulmak için gerekli. </li><li> 4 antikor / boncuk karışımı bir gecede inkübe dönen bir platform üzerinde ° C </li><li> Sabah, non-spesifik bağlama engellemek için sonicated maya toplam RNA reaksiyon başına 2 mg ve 4 ek bir 30 dakika çevirin ° C </li><li> Boncuk tutmak için manyetik raf kullanarak, tüp içinde ikinci yıkama PBS bırakarak, soğuk 1x PBS ile iki kez süpernatant kaldırmak ve boncuk yıkayın. </li><li> Yeni tüpler, her bir tüpe her reaksiyon ve boncuk karışımı kısım 50 mcL çıkartın. Bir ana karışımı hazırlarken boncuk oturup </li><li> Her reaksiyon hacmi 120 getirmek için 200 ng oligo havuzu, koruma primerlerin ekimolar oranı, 2 mg sonicated maya toplam RNA, 20 mcL HeLa nükleer ekstresi (bu RNP kaynak) ve tampon E eklemek mcL. Koruma astarlar evrensel primerler RNA sürümleri. Sipariş transkripsiyon sonuna T7 etiketiyle evrensel primerler şablonları, daha sonra MEGAshortscript ™ Kit kullanarak şablonlar RNA yazıya. </li><li> Ana karışımı 120 mcL ve tekrar süspansiyon boncuk boncuk alikotları süpernatantı. 4 ° C'de 1-2 saat süreyle Rock reaksiyonlar. </li><li> Inkübasyondan sonra, her bir reaksiyon için, bir "toplam" RNA örnek için küçük bir kısım (boncuklar dahil) kaldırmak </li><li> Manyetik ayırma stand reaksiyonlar kalan koyun ve süpernatantı kaldırmak. Örnek downstream üzerinden akış, bu analiz için gerekli olmamasına rağmen, bunu kaydetmek için yararlı olabilir. </li><li> Soğuk 1x PBS 50 mcL boncuklar 1-2 kez yıkayın. Boncuk üzerinde antikor bağlı RNA "IP" örnek. </li><li> 0.1x TE tampon% 1 SDS 50 mcL "toplam" ve "IP" boncuk süspanse edin ve 65 ° C'de 15 dakika süreyle RNA Zehir örnekleri ısı. </li><li> Şimdi daha önce boncuk bağlı ve fenol / kloroform ekstraksiyon etanol yağış takip, temiz RNA içerir süpernatantı çıkarın. Kuru pelet ve 50 mcL 0.1x TE tampon tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> Ters transkripsiyon ve co-IP örnekleri amplifikasyon aminoallyl etiketleme için hazırlık <ol><li> Sonra, RNA örnekleri ters transkripsiyonu ve PCR amplifiye olmalıdır. Ters transkripsiyon reaksiyonu için, ters evrensel primerler kullanın. </li><li> Her örnek için, 1 mcL karıştırma başlar1 mcL şablonu RNA ters evrensel astar (immunoprecipitation tepki) ve dH 2 O 10 mcL Reaksiyonlar 70 ° C 5 dakika buz üzerinde soğutun ya da 4 tutmak ° C'ye ısıtın. </li><li> Örnekleri serin olsa da, şu ana karışımı olun. Her reaksiyon için 10 mM dNTP 4 mcL, 2 mcL 10x Arrayscript tampon, 1 mcL RNaz inhibitörü, 1 mcL ters transkripsiyon enzim birleştirir. İyice karıştırın ve her ters transkripsiyon reaksiyonu ana karışımı 8 mcL ekleyin. </li><li> 95 numuneler 42 ° C'de 2 saat süreyle inkübe ° C, daha sonra 5 dakika boyunca 4 ° C örnekleri amplifikasyon için gerekli olan kadar. PCR makinesi kullanın. </li><li> RNA örnekleri ters transkripsiyon sonra, PCR, bir T7 etiketi içeren primerler biri ile evrensel primerler kullanarak onları yükseltmek. Birden fazla döngüleri denemek için gerekli olabilir, böylece havuz yükseltmek için gerekli sayısı döngüleri ortak IP verimliliğine bağlı olacaktır. Her reaksiyon 10x Taq reaksiyon tamponu, her astar (100 mM), cDNA şablon 1 mcL (ters transkripsiyon reaksiyonu), 10 mM dNTP 1 mcL dH 2 O 42.2 mcL 0.2 mcL 5 mcL gerektirir ve Taq enziminin 0.4 mcL. PCR örnekleri, 3 dakika boyunca 94 ° C'de inkübe başlayın. Sonra, her döngüsü, 94 doğasını ° C 45 saniye, 30 saniye boyunca ° C 55 tavlama ve 72 ° C'de 10 dakika için son bir uzama, bir dakika için 72 ° C'de uzatıyoruz. </li><li> Sonra, MEGAshortscript ™ Kit kullanarak tekrar örnekleri yazıya, ancak, bu kez 2 aminoallyl UTP mcL eklemek yerine, T7 UTP. Aminoallyl UTP Cy boyalar ile RNA etiketlemek için kullanılır. </li><li> Fenol / kloroform ve etanol örnekleri hızlandırabilir. Glycoblue veya amonyum asetat kullanmayın, her ikisi de dizi örnekleri melezleşmesi engel olabilir. 4.5, 0.1 M sodyum karbonat mcL pelet ve tekrar süspansiyon kurulayın. </li></ol> Amino-Cy Boyalar RNA alil etiketleme <ol><li> Etiketleme protokol DMSO 45 mcL, floresan boya, cy3 ve Cy5 her çözülür başlamak için. Işık önlemek için, karanlıkta, alüminyum folyo ve -20 ° C'de deposunda tüpler sarın </li><li> Örnekleri RNA 2.5 nükleaz içermeyen su mcL ekleyin ve iyice karıştırın </li><li> Sonra, "IP" örnek "toplam" örnek Cy3 3 mcL ve Cy5 3 mcL ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 1 saat süreyle karanlıkta inkübe, Cy-5 maviye dönecek iken Cy-3 örnek, kırmızı ya da pembe dönecek. </li><li> Reaksiyonu sonlandırmak için, her numune 6 uL 4 M hidroksilamin-HCl ekleyin, iyice karıştırın ve kısaca döndürün. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. </li><li> 0.1x TE 50 mcL etanol yağış ve tekrar süspansiyon pelet takip fenol / kloroform ekstraksiyon etiketli örnekleri arındırın </li></ol> Agilent Dizi Hibridizasyon Kiti kullanarak mikroarray örnekleri melezleşme <ol><li> 10x engelleme tampon, 140 mcL mcL nükleaz içermeyen H2 O Cy3 etiketli "toplam" havuz, Cy5 etiketli "IP" havuz 25 mcL 25 mcL, 10, 50 mcL yavaşça karıştırarak hibridizasyon başlayın 25x parçalanma tampon ve 2x hibridizasyon tamponu 250 mcL, kabarcıklar tanıtan önlemek için özen gösterin. Kısaca, tüp altında çözüm toplamak ve kabarcıkları azaltmak için de örnek mikrofuge'de. </li><li> Hibridizasyon odasında o-ring kapağını kaydırarak yerleştirin ve dikkatli bir slayt üzerine çözüm pipetle. </li><li> Algılama dizisi "sandviç" çözüm kapağını kaydırarak üstüne yerleştirin. Dizi Agilent etiket kapak slayt Agilent etiketi bakacak şekilde yönlendirmek dizi slayt unutmayın. </li><li> Kelepçe hibridizasyon odasında slayt / dizi sandviç ve 50 ° C'de 3 saat boyunca döndürün. </li><li> Dizi dönen iken, 50-ml konik tüpler aşağıdaki 50 ml çözüm: Bir konik dH 2 O, ayrı bir tüp içinde iki 1x SCC tampon çözeltiler, her, bir 2x SCC tampon 50 ml ile dolu. </li><li> Üç saatlik inkübasyondan sonra, dikkatli bir dizi / slayt sandviç çözülme ve 2x SCC tampon içeren 50 ml konik yerleştirin. Bir cımbız kullanarak, yavaşça kapağını kaydırarak dizinin ayrı ve kapağını kaydırarak dışarı doğru çekin. Slayt çekilir gibi dizi temas için dikkatli olun. Konik kapatın ve 60 saniye boyunca yavaşça ters çevirin. </li><li> Cımbız kullanarak, 1x SCC çözümü için dizi transferi, tüp kap ve hafifçe dizinin ikinci 1x SCC çözüm transferi ve 1 dakika sonra tekrar yavaşça bir dakika için ters ters. </li><li> Son olarak, dH 2 O tüp dizi transferi ve 30 saniye boyunca yavaşça ters çevirin. </li><li> Dizideki bir Kimwipe slayt kenarları koyarak kurulayın. Devam dizi döndürmek için oligos içeren yan bozmayacak emin olun silin. </li><li> Kuru dizi yerleştirin.Mikroarray tarayıcı ile boş bir 50 mL konik tüpü ve tarama </li></ol> Mikroarray yorumlama <ol><li> Mikroarray tarayıcı dizi TIF görüntü yaratacaktır. Agilent Feature Extraction yazılımı aracılığıyla bu görüntüyü kullanarak, özel havuzu benzersiz ızgara dosya (Agilent tarafından sağlanan) çalıştırın. </li><li> Agilent yazılımı bir Perl betiği ile ayrıştırılır bir dosya oluşturmak için her özellik sinyal yorumlayabilir. Her özellik sinyali o kanalda toplam yoğunluğu normale. Yeşil kanal belirli bir özelliği Örneğin, bireysel özellik için yeşil kanal yoğunluğu tüm özellikleri üzerinde yeşil kanal toplam yoğunluğu ile ayrılır. Nihai çıkış dizinin her özelliği yeşil kanal üzerinden kırmızı kanalın günlük oranıdır. </li><li> Mikroarray oligo havuzu veri bir resim elde etmek için genomuna yeniden eşlenir ve ne kadar güçlü, ilgi RNP bağlı olabilir. </li></ol> Şekil 1. Deneysel şematik <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1a.jpg" alt="Şekil 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1a"> A. şeması Fayansları. Seçme ve pre-mRNA dizileri faiz indirirken sonra, seçerek alan 10 nükleotid artışlarla vardiya 30 nükleotid pencereler ile döşenir. Evrensel astar bağlayıcı siteleri kanadını pencerenin her iki tarafında. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1b.jpg" alt="Şekil 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1b"> B. Sentez dizi. Agilent, dizileri, özel bir oligonükleotid mikroarray basılacaktır Çinili oligo siparişleri teslim edilmelidir. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1c.jpg" alt="Şekil 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1c"> C. Co immunoprecipitation. Dizi kapalı oligos kaynatıldıktan sonra, HeLa nükleer özü de inkübe, daha sonra ilgi RNP karşı bir antikor ile hazırlanmış manyetik boncuk özü ekleyin. Cy3 ile başlayan oligo havuzu ve Cy5 bağlı IP havuzu Etiket ve algılama dizi ve tarama için geçerlidir. Şekil 2. Annotating genomu ve zenginleştirme veri analizi. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> A. Convert ortalama dizi veri tabanı on günlüğüne skoru her genomik koordinat ve harita verilen koordinatları puan. Bu ortalama adım 3 ile ortalama zenginleştirme skoru 10-nt her pencere için yukarıdaki grafikler halinde puanları 2, 4 ve 0.5, 30-nt oligos örtüşen bir örnek verilir. Seçilen genomik bölgelerde Deneylerde Genom Tarayıcı Özel bir Track kullanılarak görüntülendi. Verilen örnekte bir tarayıcı penceresi clta gen, gen özellikleri (ekzon / intron / alternatif ekleme vb), koyu kırmızı dikey çubuklar tarafından temsil PTB bağlı oligos alt ve günlük ortalama zenginleştirme puanları boyunca verilmiştir. PTB güçlü polypyrimidine yolu sadece upstream ekzon 2 bağlar.

RNA veya protein düzeyi ya havuz bu yaratılış hatırlamak için bu yordamı bu çok önemli yaparken esnek ve modifikasyon açık. RNA düzeyinde orthologous bölgelerde, hastalık mutasyonlar, polimorfizmleri, ya da rastgele mutasyonların oligonükleotid dizisi içine sokulabilir. RNA bağlayıcı faktör protein düzeyinde fosforilasyon veya diğer post translasyonel modifikasyonlar tarafından değiştirilebilir. Ayrıca, bağlayıcı bir ortamda ya ek faktörlerin etkileşim veya ilgi RNA bağlayıcı protein ile rekabet düzeylerini artırmak vey...

İnsan pre-mrna üzerinde haritalama ribonucleoproteins hızlı yüksek verim için yöntemi (rnps)

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

RNA&#39;lar Sıralama RNA bağlayıcı proteinler ile birlikte immunoprecipitate (co-IP), bu bağlayıcı konuma göstererek ekleme anlayışımız artan sıklıkla bir ekleme faktörü fonksiyonu etkiler. Ancak, herhangi bir örnekleme stratejisi ile bir ekleme faktörüne bağlı bir RNA belirleme şansı hücresel bolluk orantılıdır. Biz aksi takdirde geçici pre-mRNA bağlayıcı özgüllüğü araştırmak için bir roman in vitro yaklaşım geliştirdik. Bu yaklaşım, özel olarak tasarlanmış bir oligonükleotid havuzu kullanan intronlar, ekzon, ek kavşaklar, veya diğer pre-mRNA boyunca fayans. Havuz, bir tür moleküler seçim tabi tutulur. Burada, ilişkili ve ilişkisiz bir bölümünü içine oligonükleotid ayırarak yöntem göstermek ve bağlı fraksiyon her oligonükleotid zenginleştirme kaydetmek için bir iki renk dizisi stratejisi kullanacaklardır. Dizi veri dizisi özel ve yapısal pre-mRNA bağlayıcı ribonükleoprotein (RNP) determinates tanımlamak için yeteneği ile yüksek çözünürlüklü haritalar üretir. Bu yöntem için eşsiz bir avantajı havuz özellikle pre-mRNA dizisi tasarlanmış ve sentezlenmiş olarak, mevcut IP ve SELEX teknikleri ile ilgili mRNA doğru örnekleme yanlılığı önlemek için yeteneğidir. Deneyci, havuzu kendi ihtiyaçlarına uyarlayarak çapında çalışma ve kiremit hangi bölgeleri seçer oligonükleotid havuzu esneklik başka bir avantajdır. Bu tekniği kullanarak, bir tahlil büyük bir ölçekte bağlayıcı veya fonksiyonel bir ekleme muhabiri kütüphane klon ve fraksiyonunda zenginleştirilmiş olduğunu oligonükleotidler tespit polimorfizmleri veya mutasyonların etkileri. In vitro yüksek çözünürlüklü eşleştirme düzenini Bu roman düşük bolluk in vivo teknikler mevcut çalışma zorlaştırır geçici pre-mRNA türleri, RNP etkileşimleri çalışmak için benzersiz bir şekilde sağlar.

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor olabilir<em&gt; In vivo</em&gt;. Burada, bir roman mevcut<em&gt; In vitro</em&gt; Yaklaşım, sentetik bir oligo havuzu kullanarak RNA-protein etkileşimleri araştırmak için pre-mRNA seçilen bölgelerde fayans.

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

RNA bağlayıcı proteinlerle birlikte ko-immünopresipite olan (co-IP) RNA'ların dizilenmesi, bağlanmanın ... olduğunu göstererek ekleme (splicing) hakkındaki anlayışımızı artırmıştır.

Ribo nükleer proteinlerin pre-mRNA'lar üzerindeki bağlanma bölgelerini haritalamak için, ilgili pre-mRNA'nın belirlenmiş bölgesini 30 nükleotitlik pencereler halinde döşeyerek başlayın ve döşenen oligoları bir dizi üzerine sentezleyin. Oligolar diziden kaynatılarak ayrılır ve ilgilenilen bir RNP ile birlikte çöktürülür. Toplam başlangıç havuzu SCI 3 ile, bağlanan havuz ise SCI 5 ile işaretlenir ve her ikisi de tespit dizisine uygulanır.Ardından dizi taranır ve sonuçları yorumlamak için özellik çıkarma yazılımı kullanılır. Tuzlar. Merhaba, ben Brown Üniversitesi MCB Bölümü'ndeki Will Fair brother laboratuvarından Kate Watkins. Bugün size, laboratuvarda prem RA üzerindeki bir RNA protein kompleksinin kesin konumunu belirlemek için hızlı ve düşük maliyetli bir prosedür göstereceğim, prem A'yı örtüşen oligonükleotid havuzu olarak yeniden sentezleyin.Bu havuz daha sonra ko-immünopresipitasyon ile bağlanmış ve bağlanmamış fraksiyonlara ayrılabilir ve ardından bir mikroarray ile analiz edilebilir. Bu prosedürün birçok uygulaması olsa da, biz bunu birden fazla ekleme faktörünü ve bunların alternatif eklemedeki rolünü incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse hadi başlayalım.Bu prosedüre başlamak için, prem A havuzunu tasarlamak amacıyla belirli genleri, ekleme bağlantılarını (splice junctions) veya ilgilenilen diğer bölgeleri indirmek için uc SC genom tarayıcısını kullanın. İlgilenilen pencereleri seçin, ardından her bir oligonun bir öncekinden 10 nükleotid kaydırılacağı şekilde, 30 nükleotid okuma uzunluğu ve 20 nükleotid örtüşme ile bu bölgeler üzerinde hesaplamalı olarak döşeme yapın. 30 nükleotid uzunluğundaki oligolar tanımlandıktan sonra, her birinin yanlarına evrensel primer dizileri ekleyin.Özel bir oligonükleotid mikroarray üzerinde basılmak üzere oligoları Agilent'e gönderin. Mikroarray ulaştığında, array örtü lamını bir array hibridizasyon odasına yerleştirip lam üzerine nazikçe 500 µL deiyonize su pipetleyerek DNA oligolarını yüzeyden geri kazanma işlemine başlayın. Her bir lam üzerindeki etiketlerin birbirine bakmasını sağlayacak şekilde mikroarray lamını örtü lamının üzerine yüzüstü yerleştirin ve oligo geri kazanım sürecini bozabilecek hava kabarcıklarını önlemeye dikkat edin.Hibridizasyon haznesini kapatın ve bir hibridizasyon fırınında 99 °C'de gece boyunca döndürün. Ertesi gün, diziyi hazneden dikkatlice çıkarın ve artık dizi yüzeyinden serbest kalmış oligoları içeren suyu çekin. Serbest kalan oligo havuzunu 1,5 mL'lik bir eppendorf tüpüne yerleştirin ve potansiyel topaklanmaları parçalamak için %50 genlikte, her biri üç ila beş saniyelik üç kez sonikasyon uygulayın. Ardından, uçlarına T promotörü eklenmiş evrensel primerler kullanarak düşük döngülü PCR ile havuzu amplifiye edin.Gerekli döngü sayısı, oligo geri kazanım verimliliğine bağlı olarak değişebilir. Akrilamid jelde yayılmış bir bant şeklinde görülen aşırı amplifikasyondan kaçının. Son olarak, RNA transkripsiyonu için Amon'un mega short script kitini kullanın.RNA'nın fenil kloroform ekstraksiyonu ile transkripsiyon reaksiyonunu sonlandırın, ardından sodyum asetat ve taşıyıcı olarak glyco blue kullanarak etanol çöktürmesi yapın. RNA peletini 105 µL TE tamponunda yeniden süspande edin. RNA konsantrasyonunu doğru bir şekilde belirlemek için.Bir standart eğrisi oluşturmak için ribo green kullanın. Ardından floresan plaka okuyucu ile ölçüm yapın. RNA havuzu, çöktürme işlemini başlatmak için ko-immünopresipitasyona hazırdır.İlk olarak, reaksiyon başına 50 µL nihai hacme ulaşacak şekilde protein A ve protein G dyna bead'lerini bir bir oranında birleştirerek manyetik boncukları hazırlayın. Süpernatantı uzaklaştırmak için manyetik ayırma standı kullanarak boncukları tek bir noktada toplayın. Ardından, soğuk 1X PBS ile eşit hacimde iki kez yıkayın.Boncukları eşit hacimde soğuk 1X PBS içerisinde süspande edin ve her porsiyon başına iki nanogram antikor ekleyin. Bu miktar antikora bağlı olarak değişebilir, bu nedenle antikoru boncuklara bağlamak için optimal koşulları bulmak amacıyla deneyler yapılması gerekebilir. Karışımı, döner bir platform üzerinde dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.Sabah saatlerinde, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için reaksiyon başına iki mikrogram sonikasyon uygulanmış maya toplam RNA'sı ekleyin ve dört derece Celsius'ta 30 dakika daha döndürün. Bloklama adımı tamamlandığında, süpernatanı uzaklaştırmak için tekrar manyetik rafı kullanın. Ardından boncukları soğuk 1X PBS ile iki kez yıkayın; ikinci yıkamadan kalan PBS tüpte kalacak şekilde boncuk karışımından 50 mikrolitre yeni tüplere ayırın.Her bir co IP reaksiyonu için bir tüp. Boncuklar artık co ip için hazırdır. Ardından, RNA oligo havuzunu nükleer hücre özütü ile birleştirerek master mix'i hazırlayın.RNP kaynağı olarak, toplam örnek koruma Primerleri için master mix'ten 50 µL'lik bir alikot alın; evrensel primerlerin RNA versiyonları olan bu primerler, proteinin primer dizisine bağlanmasını önlemek veya RNA'ya ikincil yapı kazandırılmasını engellemek için eklenebilir. Ko-immünopresipitasyona başlamak için, boncuk alikotlarındaki süpernatanı uzaklaştırın ve boncukları kalan master mix'in 120 µL'si içinde yeniden süspanse edin. Reaksiyonları 4 °C'de bir ila iki saat boyunca sallayın.İnkübasyonun sonunda, boncukları da içerecek şekilde, her bir çöktürme tüpünden küçük bir miktar Eloqua alınabilir. Bağlanma verimliliğini veya özgünlüğünü ek olarak test etmek için, reaksiyonların geri kalanını mıknatıs üzerine yerleştirin ve süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, soğuk one XPDS ile bir veya iki kez yıkama yapın.RNP aracılığıyla boncuklar üzerindeki antikora bağlı olan RNA, IP örneğidir. IP boncuklarını 0,1 XTE tamponu içindeki %1 SDS'li 50 µL çözeltide yeniden süspande edin ve örnekleri 65 °C'de 15 dakika boyunca ısıtın. RNA'yı elüe etmek için, daha önce boncuklara bağlı olan RNA'yı içeren süpernatantı uzaklaştırın; fenil kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çöktürmesi ile temizleyin, ardından peleti 0,1 XT tamponu içindeki 50 µL çözeltide yeniden süspande edin.Ardından, evrensel ters primerleri kullanarak örnekleri ters transkribe edin. Daha sonra, biri T7 promotörü içeren evrensel primerler ile örnekleri PCR ile amplifiye edin. Havuzu amplifiye etmek için gereken döngü sayısı, ko-ip verimliliğine bağlı olacaktır.Ambion'un mega shorts script kitini kullanarak örnekleri tekrar transkribe edin, ancak bu kez kit ile birlikte gelen T seven UTP yerine iki µL amino allyl UTP ekleyin. Amino allyl UTP, daha sonra RNA'yı side eyes ile etiketlemek için kullanılacaktır. Transkripsiyon tamamlandığında.Fenil kloroform özütü ve etanol örnekleri çöktürür. Örneklerin diziye hibridizasyonunu engelleyebilecek gliko mavi veya amonyum asetat kullanmayın. Peleti 4.5 µL 0.1 M sodyum karbonatta yeniden süspande edin.Numuneleri etiketlemek için öncelikle toplam numuneye 2,5 µL nükleaz içermeyen su ekleyin. Üç µL S3 ekleyin ve IP numunesine üç µL SCI five ekleyin. Karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin.Oda sıcaklığında, her örneğe altı mikrolitre dört molar hidroksilamin HCL ekleyerek reaksiyonu sonlandırın, iyice karıştırın ve santrifüjleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kısa süreli inkübasyon yapın; ardından etiketli örnekleri fenil kloroform ekstraksiyonu ve ardından etanol çöktürme ile saflaştırın. Rengin çoğu serbest nükleotidlerle birlikte organik faza geçtiği için peletler görünür şekilde renkli olmayabilir.Her bir peleti 50 µL 0.1 XTE içinde süspande edin. Mikroarray örneğini hazırlamak için Agilent array hibridizasyon kiti talimatlarını aşağıdaki istisna ile takip edin. RNA'yı fragmante etmeyin. Fragmantasyon tamponu eklendikten hemen sonra, fragmantasyonu durdurmak için hibridizasyon tamponunu ekleyin.Numuneleri diziye yerleştirin ve dizi dönerken 50 °C'de üç saat boyunca hibridizasyon yapın. 50 ml'lik konik tüplerde aşağıdaki 50 ml'lik çözeltileri hazırlayın: Bir tüp 2x SC tamponu, iki tüp 1x SC tamponu ve bir tüp deiyonize su.Üç saatlik inkübasyonun ardından, array lama sandviçini dikkatlice klemplerden ayırın ve 2X SSC tamponu içerisine yerleştirin. Bir cımbız kullanarak array'i lamelden nazikçe ayırın.Diziye dokunmamaya dikkat ederek lamelini nazikçe kaldırın. Lam dışarı çekilirken, konik tüpü kapatın ve 60 saniye boyunca nazikçe altüst edin. Cımbız kullanarak diziyi 1X SSC çözeltisine aktarın.Tüpün kapağını kapatın ve bir dakika boyunca hafifçe ters çevirerek karıştırın. Ardından diziyi ikinci XSSC çözeltisine aktarın ve tekrar bir dakika boyunca hafifçe ters çevirerek karıştırın. Son olarak, diziyi deiyonize su tüpüne aktarın ve 30 saniye boyunca hafifçe ters çevirerek karıştırın.Lamın kenarlarını bir kim wipe üzerine yerleştirerek diziyi kurutun. Oligoların bulunduğu tarafa zarar vermemeye dikkat ederek diziyi wipe üzerinde döndürmeye devam edin. Diziyi boş bir konik tüpe yerleştirin ve dizinin taranmasına geçin.Diziyi tarama işlemine geçiniz. Burada temsili bir dizi yer almaktadır. Her bir özellik veya oligo, toplam zenginleştirilmemiş havuz için yeşil veya IP ile zenginleştirilmiş havuz için kırmızı ile renklendirilmiştir.Her bir özellikteki sinyal, o kanalın toplam yoğunluğuna normalize edilir. Nihai çıktı, kırmızı kanalın yeşil kanala oranının logaritmasıdır. Dizideki her bir özellik için, her bir genomik koordinattaki ortalama skor belirtilen konuma eşlenir.Sırasıyla iki, dört ve 0.5 skoruna sahip, birbiriyle örtüşen 30 nükleotitlik üç oligo için bu ortalama alma adımının bir örneği verilmiş olup, her 10 nükleotitlik pencere için ortalama zenginleştirme skoru gösterilmiştir. Burada, CLTA geni üzerindeki poli pirimidin bağlayıcı protein PTB için bir bağlanma şemasının örneği sunulmuştur; gen özellikleri alt kısımda verilmiş ve PTB ile bağlanan bölgelerin log ortalama zenginleştirme skorları koyu kırmızı dikey çubuklarla temsil edilmiştir. Açık kırmızı çubuklar, PTB bağlanması açısından zenginleştirilmemiş alanları göstermektedir.Alternatif olarak eklenen eksonlar gibi ilgi bölgelerini kapsayan bir oligonükleotid havuzunun hızlı ve verimli bir şekilde nasıl oluşturulacağını size göstermiş oldum. Havuzlarımızı mikroarray ile analiz ediyoruz, ancak bunları Illumina, Lexi dizileme veya daha geleneksel olan Sanger dizileme yöntemiyle dizilemek de mümkündür. Bu prosedürü uygularken, havuzun oluşturulmasının hem RNA hem de protein düzeyinde modifikasyona açık olduğunu hatırlamak önemlidir.RNA düzeyinde, oligonükleotid dizisine otolog bölgeler, hastalık mutasyonları, polimorfizmler veya rastgele mutasyonlar ekleyebiliriz. Protein düzeyinde, RNA bağlayıcı faktör fosforilasyon veya diğer translasyon sonrası modifikasyonlarla modifiye edilebilir. Ayrıca, ilgilenilen RNA bağlayıcı proteinle rekabete giren veya onunla etkileşime giren ek faktörlerin seviyelerini artırmak veya azaltmak için bağlanma ortamı manipüle edilebilir.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

a-rapid-high-throughput-method-for-mapping-ribonucleoproteins-rnps-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

RIP-Chip aracılığıyla RNA ilişkili kompleksleri izole ve tanımlamak için adım protokolü bir adım.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Bu el yazması, ökaryotik hücrelerde oluşan seçilmiş akraba RNP'leri spesifik bir oligonükleotid yönelimli zenginleştirme yoluyla izole etmek için bir yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşımın uygulanabilirliğini, DHX9/RNA helikaz A'dan oluşan retroviral 5' çevrilmemiş bölgeye bağlı bir akraba RNP'yi izole ederek gösteriyoruz.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Burada tarif biz aynı anda quantitate için müsait bir yöntem ve genomik DNA'ın enzimatik bölünme onun alkalin hidroliz ve sonraki 5´ uç ile birleştirerek tek nükleotid çözünürlükte son derece sağlam DNA genom geniş harita ribonucleotides sıralama.

Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNA'ın

Endogenously kurulan mRNA-protein kompleksleri kurtarılması için bir tandem RNA izolasyon yordam (seyahat) açıklanmıştır. Özellikle, çapraz vivo içindeRNA-protein kompleksleri vardır, poliadenile RNA'ların özleri ile oligo(dT) boncuk etkilenmezsiniz ve belirli mRNA'ların değiştirilmiş RNA antianlamlı oligonucleotides ile yakalanır. MRNA'ların için bağlı proteinler immunoblot analizi ile tespit edilir.

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

Her iki kodlama ve kodlamayan bağlayıcı proteinler tanımlamak için tıklatın Kimya destekli RNA-interactome yakalama (CARIC) strateji uygulamak için detaylı bir protokol RNA'ların sunulur.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

Burada, endojen RNA bağlayıcı siteleri veya RNA: protein (RNP) kompleksler "ayak izleri" mammalin hücrelerden zenginleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım RNP alt paketleri iki immünoprecipitations içerir ve bu nedenle tandem RNA immünopresipitasyon dubbed (ripit).

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Keşfedin, ribonükleoproteinlerin insan pre-mRNA üzerindeki bağlanma bölgelerini hızlı ve yüksek çözünürlüklü haritalamak için özel dizayn edilmiş örtüşen oligonükleotit havuzları kullanarak bu hesaplamalı yöntemi.

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Daha fazla video keşfet