Gerilim duyarlı Boyalar kullanarak Gine domuzu Enterik Ağları Elektrik Faaliyet Optik Kayıt

Bu video, natal styre perineum voltaj duyarlı boyası D four A-N-E-P-P-D-H-Q kullanılarak, elektriksel olarak stimüle edilmiş enterik sinir sistemi preparatlarının diseksiyonunu ve ardından görüntülenmesini göstermektedir. Ötenazi uygulanmış bir Gine domuzundan ince bir bağırsak segmenti alınır ve optik kayıtlar için önce submukozayı ve nihayetinde miyenterik pleksusu açığa çıkarmak üzere diseke edilir. İlk yüksek çözünürlüklü görüntü yakalandıktan sonra, D for A-N-E-P-P-D-H-Q ile boyanmış, monte edilmiş doku üzerine elektrotlar yerleştirilir.

Elektriksel aktiviteyi belirten optik değişimler yüksek hızlı kamera ile kaydedilir. Yüksek hızlı çekim sırasında elektriksel stimülasyon uygulanır. Ardından, analiz için yüksek çözünürlüklü görüntü, neuro plex kullanılarak yüksek hızlı kameranın piksel haritası üzerine bindirilir.

Merhaba, ben Brian Salzberg; Pennsylvania Üniversitesi Nörobilim Bölümü'nde bulunan Hücresel Optik Laboratuvarı'nın veya bizim deyimimizle loco'nun direktörüyüm. Benim adım Analia Obide. Ben de Hücresel Optik Laboratuvarı'nın bir üyesiyim.

Bugün size, voltaj duyarlı boyalar kullanarak sağlam memeli nöronal ağlardan elektriksel aktivite kaydetme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, "ikinci beyin" veya "bağırsak beyni" olarak da adlandırılan enterik sinir sistemini oluşturan iki ağ içindeki ve arasındaki nöronal bağlantısallığı incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

İzofloran inhalasyonu ile anestezi uygulanan ve ardından kafası kesilen 150 ila 200 gram ağırlığında veya iki ila üç haftalık Hartley Gine domuzunun ince bağırsağını çıkararak submukozal ve enterik pleksus preparatlarını hazırlamaya başlayın. Ardından, lümeni sıcak, oksijenle zenginleştirilmiş M1 99 DM çözeltisi ile yıkayarak bağırsağın içeriğini temizleyin. Polariteyi korumaya dikkat ederek sekiz ila 10 santimetre uzunluğunda bir bağırsak segmenti kesin.

Numuneyi, oda sıcaklığında M1 99 DM içeren, sard kaplı 10 santimetrelik bir cam kaba aktarın. Kabı, karanlık alan aydınlatmalı bir diseksiyon mikroskobuna yerleştirin. Ardından, makas kullanarak mezenterik sınırı açın ve bağırsak segmentini mukoza tarafı yukarı gelecek şekilde sabitlemek için entomolojik iğneler kullanın.

Sabitleme işleminden sonra dokunun dikdörtgen bir şekil alması ve mukozal vii sıralarının düzenli olarak hizalanması için gerginliğin eşit tutulması son derece önemlidir; bunu sağlamak için düz uçlu ince dumont pensini neredeyse yatay bir pozisyonda tutun. Bağırsak segmentinin bir ucundaki VII'yi yakalayarak dokunun boylamsal ekseni boyunca çekerek mukozayı soyun. Submukoza ganglionlarını ve submukozal vaskülatürü içeren submukozayı açığa çıkarmak için mukoza şeritlerini ayırmaya devam edin.

Ardından, çok ince makaslar kullanarak, sirküler kas liflerinin yönünü takip edecek şekilde submukozal tabakada bir kesi yapın. Daha sonra, sirküler kas tabakasını makasla aşağı doğru iterken, submukozayı ince pensetle çok nazikçe kaldırın ve boylamsal kenarlar boyunca kesin.

Ayırma işlemi ilerledikçe submukozayı preparatın geri kalanından serbest hale getirin. Şimdi, submukozal preparatın nihai boyutunu belirlemek için ilk kesikten 1,5 ila 3 santimetre uzaklıkta, sirküler kas liflerinin yönünü takip ederek ikinci bir kesi yapın; elde edilen submukozal segment 30 ila 50 µm kalınlığında olup örümcek ağı benzeri bir görünüm sergiler. Bunu taze M1 99 DM içeren başka bir syl guard kaba aktarın ve nazikçe, gerginlik oluşturmadan iğneleyin.

Ardından, kabı daha sonra kullanmak üzere oda sıcaklığındaki oksijenli bir hazneye yerleştirin. Orijinal bağırsak segmenti şu anda mukoza ve submukozadan arındırılmış olmalı ve sirküler kas açığa çıkmış olmalıdır. Bu segment, miyenterik pleksusu açığa çıkarmak için bir miyenterik pleksus preparatı elde etmek amacıyla kullanılır.

Preparasyonun her iki yanından fiber demetlerini çekmek için düz uçlu ince pensler kullanarak dairesel kas tabakasını mümkün olduğunca temizleyin. Açığa çıkan miyenterik pleksus, uzunlamasına kas tabakasından ve altındaki CI'dan ayrılamaz. Miyenterik pleksus preparasyonunu, oksijenlendirilmiş M1 99 M içeren yeni bir sard kaplı kaba aktarın. Ardından, canlı kas içeren örneği gevşekçe iğneleyin. Optik deneyden birkaç dakika önce, preparasyonu kas kasılmasını önlemek için iki mikromolar nefe içeren M1 99 DM ile doldurulmuş yeni, daha küçük bir syl guard kaplı kaba aktarın ve çevresine birden fazla çok ince iğneyi dikkatlice yerleştirerek güvenli bir şekilde sabitleyin.

Gerilimin eşit şekilde dağıldığından ve dokunun sil koruma tabanına tamamen düz bir şekilde yerleştiğinden emin olun. Doku hazırlığı artık fizyolojik deneyler için hazırdır. Cam bir flakon içerisinde, M1 99 M içinde iki micromolar nifedipine ile birlikte, mililitre başına beş ila 50 microgram DAI four A-N-E-P-P-D HQ stok çözeltisi hazırlayın ve flakonu alüminyum folyo ile kaplayın.

Stok çözeltiden gelen etanol, hazırlığı kaplayan Nifedipinli M1 99 DM çözeltisinin %0.5'inden azını oluşturmalı ve bu çözelti hazırlanan boya çözeltisi ile değiştirilmelidir. Dokuyu tamamen kaplayacak kadar yeterli miktarda marker kullanılarak, inkübasyonu takiben oda sıcaklığında 10 ila 30 dakika inkübe edin. Hazırlığı, haznenin tüm içeriğini değiştirerek oksijenlendirilmiş M1 99 M artı NEFE ile yıkayın.

Elektrikle stimüle edilmiş preparasyonlarda nöronal aktivitenin optik kaydı; bir görüntü ayırıcı ile donatılmış dik epi-floresan mikroskop, düşük çözünürlüklü hassas yüksek hızlı bir kamera, yüksek çözünürlüklü siyah beyaz bir kamera, bilgisayar kontrollü bir stimülasyon jeneratörü ve bir mikromanipülatörden oluşan bir sistem kullanılarak gerçekleştirilir. Tüm düzenek, hava yoluyla gelen titreşimleri en aza indirmek için aktif bir titreşim izolasyon masası üzerine monte edilmiş ve ağır akustik perdeler ile bir Mylar tavanla çevrelenmiştir. Her iki kameradan görüntüleme, hem neuro plex hem de Global Lab image two veya herhangi bir başka görüntüleme yazılımını çalıştıran tek bir bilgisayar kullanılarak gerçekleştirilebilse de, burada gösterilen kurulum, optik deneylere başlamak için her biri ayrı bir kamerayı kontrol eden iki bilgisayar kullanmaktadır.

Boyanmış panlanmış örneği içeren hazneyi mikroskop tablasına yerleştirin. D four A ve EPPD HQ, yalnızca lipid ortamındayken floresan veren membran geçirgen olmayan bir boya olduğundan, boyanmış enterik bir preparattaki sağlıklı nöronlar, 20 x üzerindeki herhangi bir büyütmede incelendiğinde boş balonlar görünümünde olmalıdır. Eksitasyon için HQ 5 35 50, emisyon için HQ 5 72 LP four ve 5 65 nanometre dikroik ayna filtrelerini kullanın.

Ardından, mikro manipülatör kontrolleri kullanılarak, elektrodun mikroskop objektifine çarpmadığından emin olunarak, dokunun oral ucuna çok kanallı doğrusal matris dizin elektrodu yerleştirilir. Bir santimetrelik mesafeye yayılmış 10 tungsten elektrot içeren doğrusal matris dizini, birkaç bağımsız nöronal yolu uyarabilme kapasitesine sahiptir ve birbirine bağlı ganglionik devrelerin incelenmesi için oldukça uygundur. Ancak, temsili veriler için ev yapımı iki uçlu bir stimülasyon elektrodu kullandık.

Fonksiyonel kayıt yapmadan önce, yapışkan balmumu kullanarak şamberin karşı ucuna bir toprak elektrodu yerleştirin; görselleştirmeye yardımcı olması için elektriksel aktivitenin kaydedileceği bölgenin yüksek çözünürlüklü siyah beyaz bir görüntüsünü edinin. Floresansın koyu görünmesi için gri tonlamalar tersine çevrilebilir. Bilgisayar kontrollü stimülasyon jeneratörünü kullanarak akım stimülasyonu uygulamak için, öncelikle uygun yoğunluk, süre, frekans ve stimülasyon sayısının yanı sıra optik veri toplama başlangıcına göre gecikme süresini seçerek cihazı programlayın.

Stimülasyonun optik veri toplama sınırları içerisinde gerçekleştiğinden emin olmak için, stimülasyon jeneratörünü neuro plex kontrollü bir cihaz olarak yapılandırın. Ardından, neuro plex içerisinde kare hızı, kare sayısı ve kamera kazancını belirterek toplama parametrelerini ayarlayın. Bir aksiyon potansiyelinin tam tanımını elde etmek için kare hızı minimum 1 kHz olarak ayarlanmalıdır.

D four A ve E-P-P-G-H-Q, depolarizasyon üzerine voltaj değişimiyle doğrusal olarak ilişkili bir floresans azalması sergilediğinden, aksiyon potansiyelleri ters görünmesin diye neuro plex içindeki optik sinyal ekranını tersine çevirin. Veri toplama işlemini başlatın. Her bir fonksiyonel kayıt işlemini gerçekleştirmeden önce, her bir görüş alanının yeni bir yüksek çözünürlüklü siyah beyaz görüntüsünü almayı unutmayın.

Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, sonuçları çevrimdışı olarak analiz etmek için neuro plex kullanın. Ekrandaki sayfa ekranı (page display) adı verilen alan, 80 by 80 yüksek hızlı kamera tarafından yakalanan preparasyonun ham görüntüsünü tek bir kare olarak gösterir. Sayfa modu mutlak kare (absolute frame) olduğunda, neuro plex görüntüleme komutları kullanılarak ikinci kamera ile elde edilen yüksek çözünürlüklü görüntü, ham görüntünün piksel haritasının üzerine bindirilir.

Bu işlem, sayfa modunun mutlak izden (absolute trace) izlere (traces) dönüştürülmesini ve görüntüleme komutu içerisinden üst üste bindirilmiş görüntünün seçilmesini gerektirir. Sayfa ekranında gösterilen görüntüden tekil pikselleri veya piksel gruplarını seçmek için fareyi kullanın. Bu ilgi bölgelerinin çıktıları, iz görüntüleme penceresinde izler şeklinde görünecek ve söz konusu pikseller tarafından kaydedilen optik değişimlerin büyüklüklerini zamanın bir fonksiyonu olarak ortaya koyacaktır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüdeki gri ölçeğin tersine çevrilmesi, izleme modu sayfa ekranındaki görselleştirmeyi iyileştirir; stimülatörden analog bir çıkış alınması şiddetle tavsiye edilir. İzleme ekranı penceresine dahil etmek için analog çıkış kanalını seçin. Bu çıkış, deney sırasında uygulanan stimülasyonların kesin zamanlamasını gösterir.

Verileri bir film olarak görüntülemek için, bir veri setindeki ardışık kareleri, floresans yoğunluğundaki maksimum ve minimum değişime göre ayarlanmış yalancı renk ölçeklerini kullanarak görüntülemek amacıyla neuro plex içindeki film komutlarını kullanın. DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q ile boyanmış bir miyenterik pleksus preparasyonundan alınan bir ganglion, yüksek çözünürlüklü kamera ve 60 x objektif ile görüntülenmiştir. Veri toplama sırasında preparasyon, 40 hertz frekansında beşli bir darbe dizisi ile stimüle edilmiştir.

Her bir pulse'ın genliği 15 milliamps ve süresi 0.5 milliseconds olacak şekilde, dört ilgi bölgesi (ROI) belirlenmiş ve seçilen bölgeler üzerinden ortalaması alınan optik verileri görüntülemek için izler oluşturulmuştur; psödorenk kare dizisinde, nöronal aktiviteyi belirten membran depolarizasyonunun ilk optik yanıt bölgeleri sarıdan kırmızıya doğru görünmektedir. Bu veriler, stimulasyonla tetiklenen aktivitenin her ganglionun ayrı bölgelerinde meydana geldiğini ve çoğunlukla geçiş aksonları tarafından taşındığını göstermektedir. ROI iki, üç ve dört, ROI bir'den farklı uzaklıklardaki münferit nöronları tanımlamaktadır.

Şekil iki, bilginin yayılım gösterebileceği anatomik yolakları 10 x büyütmede göstermektedir; oklar, belirlenen miyenterik ganglionu aktive etmek için uyarının izlediği yönü belirtir. Az önce, voltaj duyarlı boyalarla elektriksel aktiviteyi kaydetmek için kullanılan bir optik düzeneğin bileşenlerini ve bu teknoloji enterik sinir sistemine uygulandığında, mikroskop altında iki sağlam memeli ağının içindeki ve arasındaki fonksiyonel bağlantılılığın incelenme olasılığını nasıl ortaya çıkardığını gösterdik. Optik kayıt teknolojisi kullanılırken detaylara dikkat edilmesi son derece önemlidir.

Optik, mekanik ve elektriksel gürültü kaynaklarının dikkatle kontrol edilmesi ve preparatın sağlıklı durumunun titizlikle korunması gerekmektedir. Bu nedenle, optik kayıt işleminde başarıya ulaşmak için bu protokolün tüm bireysel adımlarında uzmanlaşmak esastır. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için çok teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.