Denatüre Gradient Jel Elektroforezi (DGGE)

Merhaba. Benim adım Celeste Peterson; Harvard Üniversitesi'nde mikrobiyal biyofilm toplulukları üzerine çalışan bir araştırmacıyım. Bakteriyel toplulukların 16S rRNA dizilerini ve bu dizilerin zamanla ve mekanda nasıl değiştiğini inceleyerek profilini çıkarıyorum. Bunu gerçekleştirmek için de DGGE yöntemini kullanıyorum.

Bu, kuyumun normal bir akrili değildir; çalıştırılırken 60 derecede tutulması ve tamponun sürekli pompalanması gerekir. Bu nedenle, tamponu 60 dereceye ulaşana kadar yaklaşık bir saat boyunca ısıtacağız ve ardından deneyi başlatabiliriz. Şimdi, bu plakayı safsızlıkları gidermek için seyreltilmiş uc çözeltisiyle yıkayacağım ve ardından ışıklandıracağım.

Buna benzer herhangi bir durum düzensizliklere yol açabilir. Tüm suyun silinmesi önemlidir. Bu nedenle jeli hazırlarken, çipi jelin dış kısmına yerleştireceğim.

Böylece jel bu iki cam parçasının arasında kalacak ve çip dış kısımda yer alarak aradaki jeli etkilemeyecektir. Şimdi jeli bu kıskaçlar içine yerleştireceğim, ardından onları birbirine bastırıp sağa doğru çevirerek sıkıştıracağım. Her jelde olduğu gibi, alt kısmın düz olduğundan emin olmak önemlidir.

Sızıntıyı önlemek için şimdi jeli ters çeviriyoruz ve contayla mühürlenmesi için buraya yerleştiriyoruz. Bunu yaparken, plakaların buradaki contayla tam olarak hizalanmış olması önemlidir. Ardından yanlardaki bu düğmeler yerleştirilir ve sızdırmazlığı sağlamak için aşağıya doğru bastırılır.

Bu, 30 ml'lik bir şırıngadır. Bu parça ve şu parça Bio-Rad kitiyle birlikte gelir ve bu şekilde takılır. Bu işlem sadece tüplerdeki fazla suyu uzaklaştırmak içindir.

Jeli yüklemek için boruyu jel üzerine yerleştirin. İlk olarak boruya bir adaptör, ardından bu küçük adaptörle birlikte bir iğne yerleştirin ve alt camın hemen altına gelecek şekilde jelin tam merkezine konumlandırın. Daha sonra bu tel adaptör uzun boruya takılır ve yüksek ve düşük yoğunluklu çözeltileri içeren iki şırıngaya bağlanır.

Bunlar önceden hazırlanmış çözeltilerdir. Mavi olanın içine, bunun en yüksek denatüre edici çözelti olduğunu belirten bir boya ekledim; diğeri ise en düşük yoğunluklu olan ve en az denatüre edici çözeltidir. Hepsinin içeriği tamamdır.

Şimdi hazırlayacağım, aslında haftada iki kez yapacağım. Sıcaklığı ayarladığınızda, kolon yükselmeden önce jeli doldurmak için yaklaşık beş ila yedi dakikanız olur. Ve şimdi şırıngayı çözelti ile dolduruyoruz.

Böylece yaklaşık 15 µL çözelti ile dolduracağım. Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için, üstteki hava kabarcığı kaybolana kadar nazikçe sıkarak ters çevireceğim. Şimdi, buradaki küçük vida şu oluğun içine girecek.

Bu adaptör buradaki kelepçe ile hizalanacak ve C-kelepçe ile çok sıkı bir şekilde sabitlenecektir. Ardından bu tüp, şırıngaya bağlanacaktır. Aynı işlem, teslimat zamanı geldiğinde yüksek yoğunluklu matrisin bulunduğu diğer tarafta da gerçekleştirilir.

Bu çarkı sabit bir saat yönünde hareketle döndüreceğim. İlk olarak, doğası gereği en yoğun olan mavi çözelti dışarı çıkacak ve jelin alt kısmını oluşturacak. Biraz sonra ise şeffaf çözelti jeli doldurmaya başlayacak ve gradyan oluşacak.

Bir an için hafif bir açıyla tutun ve jeli dökme işlemini bitirir bitirmez tüplerinizi hemen yıkayın çünkü polimerize olacaklar. Grup orada. Ve ardından aşağı bastırın. Bu küçük olanı, ve diğer tarafta da aynı işlemi yapacağım. Tamam.

Merhaba, ben Celeste Peterson. Harvard Üniversitesi'nde mikrobiyal biyolojik topluluklar üzerine çalışan bir araştırmacıyım. Bakteriyel toplulukların 16S rRNA dizilerini ve bu dizilerin zamanla ve mekandaki değişimlerini inceleyerek profilleme yapıyorum. Bunu gerçekleştirmek için DGGE yöntemini kullanıyorum.

DGE, denatüre eden jel elektroforezidir. Temel fikir, bir gradyanın olması ve DNA'nın gradyan boyunca ilerlerken denatüre olmasıdır. Böylece farklı türler, gradyan boyunca farklı noktalarda duracaktır.

Böylece, topluluktaki farklı seksiness türlerinin bir parmak izi haline gelir. Bu nedenle deneyimin amacım, toplulukta kimlerin olduğunu ve bunun zamanla ve mekanda nasıl değiştiğini görmektir. Seksiness DDD jelini çalıştırabilir ve ardından bantları keserek her toplulukta temsil edilen türleri tanımlayabilirim.

Bir DDG jeli hazırlanırken karşılaşılan en büyük sorunlardan biri, en uygun gradyanı belirlemektir. Bu nedenle, belirli bir topluluk için hangi gradyan türünün uygun olduğunu bulmak için denemeler yapılması gerekir. Bugün kullandığım gradyan %35 ile %55 urea arasındadır.

Bu teknikte karşılaşılabilecek büyük sorunlardan biri, şeritlerde yayılmaların (smear) meydana gelmesidir. Bunun için, sebebi ne olursa olsun, yapılabilecek en iyi şeylerden birinin jelleri gerçekten uzun süre çalıştırmak olduğunu ve böylece yayılmaların kaybolduğunu gördüm. Bugün bunu genel bakteriyel topluluklar için kullanıyorum ancak bu yöntem, belirli bir bakteri ailesinin zaman içinde nasıl değiştiğini görmek için de kullanılabilir ve bunlar genellikle oldukça temiz jeller üretir.

DDGE ile tekil genlerdeki mutasyonları da inceleyebilirsiniz.