Name: Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-07T18:43:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Öğrenin yetişkin zebra balığında retro-orbital enjeksiyon tekniğini; bu yöntem hematopoietik kök hücre nakli çalışmalarında kan hücreleri enjekte etmek için kullanılır ve floresan mikroskopi ile görüntülenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve embriyonik hematopoez çalışmaları için bir hibe NIH tarafından desteklenmektedir.

Bölüm 1. Enjeksiyon malzemesinin hazırlanması <ol><li> Tg (globin: GFP) hücreleri: </li><li> Heparin (1unit/ul) ponksiyon balıkların solungaç arkasında kaplı 10ul pipet kullanarak yetişkin donör balık yerleştirir. </li><li> , Kırmızı kan hücreleri aspire ve hücre tampon dağıtmak (0.9X PBS +% 5 FBS +% 1 Kalem / Strep). </li><li> Filtre hücresi 40uM örgü üzerinde süspansiyon ve hemasitometre kullanarak, daha önce LeBlanc ve ark açıklandığı gibi hücre konsantrasyonunu belirlemek. </li><li> Spin ve nihai enjeksiyon hacmi 5ul daha fazla olduğu gibi istenilen konsantrasyonda hücre tamponda tekrar süspansiyon. Burada 1.5-2 milyon hücre / alıcı enjekte edilir. </li><li> Dekstran, Teksas Red ® için, 10-12 mg / ml son bir enjeksiyon konsantrasyon için DPBS boya çözülür. Başına 4 balık uL enjekte planlayın. </li></ol> Bölüm 2. Enjeksiyon <ol><li> (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml balık su) tricaine balık anestezisi. </li><li> Yıkama Hamilton şırınga% 70 etanol kullanılarak enjeksiyon öncesinde 3-4 kez. 0.9X DPBS 3-4 kez durulayın. </li><li> Place balık dorsal tarafına ve nemli bir sünger üzerinde sağ karşı karşıya. </li><li> Sağ eli ile ve Hamilton şırınga pistonu parmağı ile tutun. Sol elinizle hafifçe ile balığın vücudu stabilize. </li><li> Balık gözü bir saat olsaydı, iğne 7:00 pozisyonunda ve balık (Şekil 1) 45 derecelik bir açıyla işaret olurdu böyle yukarı bakacak şekilde konik iğne yerleştirin. </li><li> 07:00 pozisyonda yavaşça içine iğne 1-2 mm takın ve pistonu yavaşça bastırın. </li><li> Balık, taze E3 su kurtarmak için izin verin. </li><li> Enjeksiyonlar arasındaki farklı reaktifler, yukarıda açıklandığı gibi, iğne yıkayın. </li><li> Flick hücre hücre topaklanma önlemek için hücrelerin her birkaç dakikada bir tekrar süspansiyon çözüm. </li><li> Bulaşmasını önlemek için günlük su değişimleri, 1 hafta boyunca akış kapalı balık tutun. Biz bu dönem için (10 ml Stres kat + 5ml pemafix + 38 litre başına E3 su 5ml melafix) YBÜ suda balık tutmak. </li></ol> Bölüm 3. Temsilcisi Sonuçlar Doğru yapıldığında, bu bir şekilde etiketlenmiş olması durumunda enjekte malzeme görselleştirmek mümkündür. Örneğin, Tg (globin: GFP), kırmızı kan hücreleri, Şekil 2'de görüldüğü gibi, kısa bir süre enjeksiyon sonra alıcı casper balık damar içinde dolaşan bir floresan diseksiyon mikroskop altında görülmelidir. Aynı şekilde, bir 70kDa dekstran, Texas Red ® konjuge enjeksiyon retro-orbital enjeksiyonu takiben hemen şeffaf balık (Şekil 3), damarsal görüntülendi olabilir . Tg (β-aktin: GFP) Floresan böbrek hücreleri donör balık da retro-orbitally ışınlanmış casper alıcı balık içine enjekte edilir. Bu hücreler, sonunda, birkaç hafta sonra (Şekil 4b) böbrek yeniden doldurmanız sonra alıcı iliği (Şekil 4a) ev ve devam edecektir. Enjeksiyon, çok sığ veya iğnenin açısını retro-orbital venöz sinüs boşluğuna atlar, enjekte edilen malzeme, göz çevresinde havuzu ya da dışarı akan görüntülenmiştir olabilir. Enjeksiyon çok derin ise Alternatif hala kurtarmak olsa, balık, doku hasarı veya aşırı kanama karşılaşabilirsiniz. Doğru yapıldığında, retroorbital enjeksiyondan sonra ölüm, toplam enjekte balık ve kan dolaşımına teslim başarı% 5'ten az toplam enjekte edilen balığın% 90 daha fazla olmalı. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: retroorbital enjeksiyon tekniği İllüstrasyon. Balığın sağ gözünün 07:00 konumunu doğru enjeksiyon noktaya tekabül eden bir analog saat olarak temsil edilmektedir. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: Tg (globin: GFP), retroorbital enjeksiyon üç gün sonra bir yetişkin casper balık kuyruk damar içinde dolaşan kırmızı kan hücreleri . <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: Başarılı enjeksiyon Texas Red konjuge 70kDa dekstran ® olarak kullanılan boya şeffaf yetişkin balık, casper floresan damarsal üretir ve kolayca standart tüm hayvan floresan mikroskopi kullanılarak izlenebilir. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="Şekil 4A" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4a"> Şekil 4a: Üç gün donör balık Tg (β-aktin: GFP) tüm böbrek iliği hücrelerinin retroorbital enjeksiyonu takiben, hücreler ışınlanmış yetişkin casper alıcı balık böbrek iliği homing görüntülenebilmekte. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="Şekil 4B" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4b"> Rakam4b: Tg (β-aktin: GFP) tüm böbrek iliği hücrelerinin retroorbital enjeksiyonu takiben dört hafta donör balık, yeşil donör tüm böbrek iliği hücreleri ile alıcı böbrek repopulation ışınlanmış yetişkin casper alıcı balık görüntülenebilir.

<ol><li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
</ol>

Yetişkin zebrafish retroorbital enjeksiyon, kan dolaşımına enjekte edilen malzeme teslimi en yüksek verimi en düşük ölüm insidansı verir. Çünkü enjeksiyon yerinde doğa, delinme, enfeksiyon ve kan kaybı miktarı oluşumunu azaltarak, çabuk iyileşmek için görünür. Bu site bile defalarca, örneğin, günlük ilaç enjeksiyonları için kısa bir süre içinde enjekte edilebilir. Büyük miktarda uyuşturucu sadece dalmış ve ilgi ilaç içeren suya batırılmış balık yetişkin balıklar geleneksel tedavi yöntemleri ...

<table><tbody><tr><td>Domuz intestinal mukozasından elde edilen sodyum heparin tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>300 USP ünite içeren, önceden tartılmış flakon</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical</td><td></td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, Texas Red&amp;#174;</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>5mM NaCl&lt;br/&gt;0,17 mM KCl&lt;br/&gt;0,33 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0,33 mM MgSO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Mikrolitre Şırınga</td><td>Hamilton Co</td><td>80300</td><td>701N 10uL SYR (26s/2&amp;#8221;/2)</td></tr></tbody></table>

yetişkin zebra balığı retro-orbital enjeksiyon

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Bütün hayvanlar İlaç tedavisi, kimyasal, farmakolojik ve genetik çalışmalar için herhangi bir model sistem önemli bir araçtır. İntravenöz (IV) enjeksiyonu genellikle en etkili ve non-invaziv bir ilgi ajan teslim şeklidir. Zebra balığı (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), IV ilaç enjeksiyonu küçük damar çapı nedeniyle uzun bir meydan okuma olmuştur. Bu aynı zamanda hematopoeitic kök hücre nakli sırasında hücrelerin enjeksiyon için önemli bir engel olduğu kanıtlanmıştır. Tarihsel olarak, kalp yoluyla doğrudan kana enjeksiyon yapıldı. Ancak kalp, enfeksiyon, büyük bir kan kaybı veya ölümcül organ hasarı eğilimli balık bırakarak enjeksiyon sırasında sık sık delinirse, bu intra-kardiyak prosedür çok yüksek bir ölüm oranına sahiptir. Fare ile deneyim Çizim, gözün arkasında ve retro-orbital venöz sinüs içine enjeksiyon yerinde olduğu zebrafish yeni bir enjeksiyon prosedürü geliştirdik. Bu retro-orbital (RO) enjeksiyon tekniği yetişkin balık ilaç enjeksiyonu yanı sıra, tüm böbrek iliği hücreleri nakli başarıyla çalışan olmuştur. RO enjeksiyon geleneksel kalp içi enjeksiyon çok daha düşük bir ölüm oranı vardır. Retro-orbitally enjekte Balık az aşağıdaki enjeksiyon kanamaya eğilimi ve kalp gibi önemli bir organ yaralanma riski çok daha düşük. Ayrıca, düzgün bir şekilde yapıldığında, enjekte edilen hücreler ve / veya ilaçlar, kan dolaşımına izin veren bileşikler kendi niş ev kolayca bütün balık ve böbrek hücreleri üzerindeki etkisi hızla girin. Böylece, yetişkin balık kana malzemenin verimli teslim izin verirken, bu yeni enjeksiyon tekniği mortalite en aza indirir. Burada Tg retroorbital enjeksiyonu ile bu tekniği örnek (<em&gt; Globin</em&gt;: Yetişkin içine GFP) hücreleri<em&gt; Casper</em&gt; Balık yanı sıra kırmızı floresan boya enjeksiyon (dekstran, Texas Red<em&gt;</em&gt;) Yetişkin<em&gt; Casper</em&gt; Balık. Daha sonra tüm hayvan floresan mikroskopi başarılı enjeksiyonları görselleştirmek.

Burada yetişkin zebrafish retroorbital enjeksiyon nasıl yapılacağını göstermektedir.

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

Tüm hayvanların ilaçla tedavisi, farmakolojik ve kimyasal genetik çalışmalar için her model sistemde temel bir araçtır. İntravenöz (IV) enjeksiyon...

Donör kırmızı kan hücreleri, ilk olarak transgenik globin GFP balıklarının kalbi delinecek ve kırmızı kan hücreleri aspire edilerek toplanacaktır. Hücreler enjeksiyona hazır hale getirildikten sonra, alıcı balıklara retroorbital yolla enjeksiyon yapılır ve ardından floresan işaretli hücrelerin başarılı bir şekilde enjekte edildiğini doğrulamak için standart bütün hayvan floresan mikroskopisi ile görüntüleme yapılır. Benzer şekilde, Texas red ile konjuge edilmiş renkli bir boya dekstrini hazırlanıp retroorbital yolla enjekte edilir ve enjekte edilen hayvanın başarılı enjeksiyonu görüntülenir.Merhaba, ben Boston Çocuk Hastanesi Hematoloji ve Onkoloji Bölümü'ndeki Leonard Zan Laboratuvarı'ndan Emily Atch. Bugün size yetişkin zebra balıklarında retroorbital enjeksiyon prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü hematopoetik kök hücre transplantasyonunu incelemek için kullanıyoruz.Haydi başlayalım. Yetişkin Casper balıklarında (zebra balığının şeffaf bir türü), transgenik globin GFP hücrelerinin ve Texas red ile konjuge edilmiş kırmızı floresan boya dekstrinin retroorbital enjeksiyonlarını göstereceğiz. Transgenik globin GFP hücrelerini hazırlamak için, solungaçların arkasından balığı delmek amacıyla heparinle kaplanmış 10 µL'lik bir pipet ucu kullanarak yetişkin donör balıktan kan alın, eritrositleri aspire edin ve bunları bir hücre tamponuna aktarın.Ardından, hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik mesh üzerinden süzün. LeBlanc ve arkadaşları tarafından daha önce tanımlandığı gibi hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirledikten sonra, hücreleri 1500 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücreleri, nihai enjeksiyon hacmi beş mikrolitreden fazla olmayacak şekilde, istenen konsantrasyonda hücre tamponunda yeniden süspande edin.Bu gösterimde, alıcı başına 1,5 ila 2 milyon hücre enjekte edeceğiz; kırmızı floresan boyayı hazırlamak için, nihai enjeksiyon konsantrasyonu mililitre başına 10 ila 12 miligram olacak şekilde DPBS içinde çözeceğiz. Enjeksiyon prosedürü aynı olduğundan, balık başına dört mikrolitre enjekte edeceğiz. Enjekte edilen materyal ne olursa olsun, yalnızca kırmızı floresan boyanın enjeksiyonunu göstereceğiz.Balığa enjeksiyon yapmadan önce, Hamilton şırıngasını %70 ethanol kullanarak üç ila dört kez yıkayın. 0.9 XDPS ile üç ila dört kez durulayın. Balığı Trica ile anestezi ettikten sonra, balığı sırtı yukarı bakacak ve yüzü sağa dönük olacak şekilde nemli bir süngerin üzerine yerleştirin.Doldurulmuş Hamilton şırıngasını sağ elinizle tutun ve sol elinizin işaret parmağını pistonun üzerinde tutarak balığın gövdesini nazikçe sabitleyin. İğneyi, bevel kısmı yukarı bakacak şekilde ve balığın gözü bir saat olsaydı, iğne saat yedi yönünü gösterecek şekilde konumlandırın. Balığa 45 derecelik bir açıyla, iğneyi saat yedi yönündeki bölgeye bir ila iki milimetre boyunca nazikçe yerleştirin ve pistonu yavaşça aşağı itin.Balıkların taze E3 suyunda dinlenmesini sağlayın. Enfeksiyonu önlemek için günlük su değişimleri yaparak balıkları bir hafta boyunca akıntıdan uzak tutun; bu süre zarfında balıkları ICU suyunda tutuyoruz. Retroorbital enjeksiyonlar doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, işaretlenmiş olan enjekte edilen materyali görselleştirmek mümkündür.Örneğin, transgenik globin GFP kırmızı kan hücreleri, enjeksiyondan üç gün sonra yetişkin bir Casper alıcı balığın kuyruk damarlarında dolaşırken floresan diseksiyon mikroskobu altında görülebilir; benzer şekilde, Texas red ile konjuge edilmiş 70 kilodaltonluk bir dekstrinin başarılı enjeksiyonu anında floresan damar yapısını ortaya çıkarır. Standart tüm hayvan floresans mikroskobu ile kolayca görselleştirilebilen şeffaf yetişkin Casper balığında, transgenik beta aktin GFP donör balıklardan alınan floresan tüm böbrek iliği hücreleri, radyasyon uygulanmış bir Casper alıcı balığa retro-oral olarak da enjekte edilebilir. Bu hücreler, burada gösterildiği gibi enjeksiyondan üç gün sonra alıcının iliğine yerleşecek ve dört hafta sonra bu yeşil donör hücreler alıcının böbreğini yeniden populate edebilecektir.Yetişkin zebra balıklarında retroorbital enjeksiyonların nasıl yapılacağını göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken, iğneyi balığın düzlemine 45 derecelik bir açıyla yerleştirerek enjeksiyon yapmayı unutmamak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz yetişkin zebrafish intraperitoneal göstermektedir. Biz bir Micro4 denetleyicisi ve UltraMicroPump III tarafından kontrol edilen bir 10 ul NanoFil mikroenjektör kullanın. Bu gösteri, bir anestezik olarak soğuk su kullanımını içerir.

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

Intravitreal antisens morpholinos enjekte ve retina içine electroporating koşullu yetişkin zebrafish retinanın bir hedef protein ifade demonte bir yöntem açıklanmıştır. Ortaya çıkan protein yenileyici veya sağlam retina proteinin rolünü test edilmesine imkan sağlayan birkaç gün, nakavt edilir.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Yetişkin zebra balıklarında retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) geriye dönük etiketlemek için etkili bir yöntem sunuyoruz.

Floresan Boyalar Yetişkin Zebra balığı Retina Ganglion Hücreleri retrograd Etiketleme

Burada, zebra balığı iskelet kası ve embriyonal rabdomiyosarkomun (ERMS) erişkin bağışıklık sistemi baskılanmış rag2E450fs homozigot mutant zebra balığına hücre nakli için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, kas hücrelerinin rejenerasyonu ve malign dönüşümünün verimli bir şekilde analiz edilmesini sağlar.

Bağışıklık Aşılmasına Yetişkin Zebra balığı içine normal ve malign Kas Hücre Nakli

Bu yöntem, Yetişkin zebrafisinin toraks içine 0.5 − 3 μL solüsyonun enjekte edilmesine dayanır. Prosedür verimli organ zarar vermeden zebra balığı kalbin yakınlığı içine protein ve kimyasal bileşikler sunar. Yaklaşım, kalp çeşitli dokularda eksojen faktörlerin etkilerini test etmek için uygundur.

Yetişkin zebrafish kalp çalışması için intratorasik enjeksiyon

Makale, retinal girdinin optik tektum büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaya yönelik ilk adım olarak canlı zebra balığı larvalarından gözlerin cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır. Ek olarak, makale larva anesteziizasyonu, fiksasyon ve beyin diseksiyonu, ardından immünohistokimya ve konfokal görüntüleme hakkında bilgi vermektedir.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Yetişkin zebra balıklarında yeni bir intraperitoneal (IP) enjeksiyon yöntemi tanımlanmıştır. Doksorubisin gibi toksik bileşiklerle çalışırken, bu prosedür daha önce bildirilen iki IP yönteminden daha etkilidir. Teknik, zebra balığı modelinde sınırlı deneyime sahip araştırmacılar tarafından kolayca benimsenecek şekilde tasarlanmıştır.

Yetişkin Zebra Balıklarında Vücut Hasarını ve İlişkili Mortaliteyi En Aza İndiren Bir İntraperitoneal Enjeksiyon Tekniği

Burada, yetişkin zebra balıklarına hücrelerin veya farmakolojik ajanların intravenöz enjeksiyonu için optimize edilmiş ve etkili bir protokol sunuyoruz, bu da hücre aşılamasının artmasına ve tedavi edilen zebra balığının hayatta kalma oranlarının artmasına neden oluyor.

Yetişkin Zebra Balıklarında Optimize Edilmiş İntravenöz Enjeksiyon

Burada, son teknoloji ürünü bir robotik enjeksiyon sistemi kullanılarak zebra balığı larvalarına otomatik tümör ksenogreft implantasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, sistemin başarılı performansını gösteren enjeksiyon videoları ve doğrulama verileri sunuyoruz.

Kanser Araştırmaları ve Tıbbı için Zebra Balığı Larvalarında Tümör İmplantasyonunun Otomatikleştirilmesi

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Öğrenin yetişkin zebra balığında retro-orbital enjeksiyon tekniğini; bu yöntem hematopoietik kök hücre nakli çalışmalarında kan hücreleri enjekte etmek için kullanılır ve floresan mikroskopi ile görüntülenir.

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

Daha fazla video keşfet