Di-8-ANEPPS ile İndüklenmiş Membran Gerilim Ölçme

Bir biyolog için hücre, her biri belirli görevleri yerine getiren ve birlikte hücrenin hayati fonksiyonlarını gerçekleştirmesini sağlayan bir dizi farklı organel içeren yaşamın yapı taşıdır; ancak elektriksel bir bakış açısından hücre, yalıtkan bir membranla çevrelenmiş iletken bir sitoplazma ve bunu kuşatan iletken bir dış ortam olarak görülebilir. İyon konsantrasyonlarındaki küçük bir dengesizliğin, fazla iyonların membrana yakın bölgelerde birikmesiyle sonuçlanması, dinlenme membran voltajını oluşturur.

Bir hücrenin elektrik alanına yerleştirilmesi, membranın her iki tarafında lokal bir yük yeniden dağılımına neden olur. Bunun sonucunda, dinlenme voltajına eklenen ve alan kapatıldıktan sonra ortadan kalkan indüklenmiş membran voltajı oluşur. Basit hücre şekillerinde, indüklenmiş membran voltajı küresel bir hücre için analitik olarak hesaplanabilir.

Bu durum, voltajın alan şiddeti ve hücre boyutu ile orantılı olduğunu ve membran boyunca kosinüs fonksiyonunu takip ettiğini belirten Schwan denklemi ile verilir. Daha karmaşık hücre şekilleri için, indüklenen voltaj kosinüs fonksiyonundan önemli ölçüde sapabilir ve ya güçlü bir bilgisayar kullanılarak sayısal olarak ya da potansiyometrik bir boya kullanılarak deneysel olarak belirlenmelidir. Bu amaçla yaygın olarak kullanılan potansiyometrik boyalardan biri di-ET-ACK'tır.

Eksitasyon ve emisyon spektrumları membran voltajına bağlı olan hızlı bir boya olan AIP'ler, membrana bağlandıklarında güçlü bir floresan özellik kazanır ve floresan yoğunluğundaki değişim, membran voltajındaki değişimle orantılıdır. Bu video, D AIP'ler kullanılarak indüklenen membran voltajının ölçümü için izlenecek protokolü göstermektedir. Bu Örnekte, Çin hamster yumurtalık hücreleri kullanılmış ve hücreler her bir bölmeye 100.000 hücre düşecek şekilde yerleştirilmiştir.

HAMF 12 kültüründe, fetal calf serum, L glutamine ve antibiyotiklerle desteklenmiş besiyerinde, küresel şekilli yapışık hücreler elde etmek için hücreleri kültür besiyerinde iki ila dört saat, daha karmaşık şekilli tekil yapışık hücreler elde etmek için ise 16 ila 20 saat inkübe edin. Orijinal şişe içerisinde DMSO'da çözünmüş diet aaps'den 10 million MO stok çözeltisi hazırlayın. Bazı hücre hatları, boyanın membrana dahil olmasını kolaylaştırmak için ek onic gerektirebilir. 1 ml spinner's modification of the minimum essential medium (SMEM)'i bir EOL tüpüne aktarın; içerisine 2.5 µL %20 onic ve 3 µL 10 mM diet aaps ekleyin.

Bu işlem, yaklaşık 30 micromolar diet aaps ve 0,05% onic içeren bir yükleme çözeltisi sağlar. Odacıkta bulunan kültür ortamını yükleme çözeltisi ile değiştirin. Odacığı bu sıcaklıkta, dört derece Celsius'te 10 dakika boyunca buzdolabına aktarın.

Boyanın plazma membranı aracılığıyla içselleştirilmesi boyamadan sonra büyük ölçüde engellendiğinden, fazla boyayı saf SMEM ile dikkatlice birkaç kez yıkayın. Son olarak, hazne içerisinde 1,5 mililitre SMEM bırakın. Hücreler; yağ daldırma objektifli bir floresan mikroskobu, bir monokromatör ve bir CCD kamera kullanılarak gözlemlenir.

Kazanım yazılımında, eksitasyon dalga boyunu 419 nanometre olarak ayarlayın ve burada uygulanmamış olsa da yaklaşık 605 nanometreye ayarlanmış bir bant geçişli filtre seçin. Diet aaps aynı zamanda membran voltajının rasyometrik ölçümlerine de olanak tanır. Hücrelerin bulunduğu hazneyi mikroskop tablasına yerleştirin, elektrotları haznenin tabanına konumlandırın ve bunları darbe üretecine bağlayın.

Bu örnekte, 35 volt genliğe ve 50 milisaniye süreye sahip kare bir puls üretilmektedir. Bir DC voltaj kaynağı ve mikroişlemci kontrollü bir anahtarlayıcı kullanılarak puls, bir çift elektroda iletilmekte, böylece elektrotlar arasında bir elektrik alanı oluşturulmakta ve membran voltajı indüklenmektedir. Puls iletimi, görüntüleme ile senkronize edilmelidir.

İlgili hücreleri bulun, her bir darbe için tek bir elektrik darbesi veya bir darbe dizisi uygulayın. Boyanın düşük tepkisi nedeniyle iki floresan görüntü elde edin: darbeden hemen önceki kontrol görüntüsü ve darbe sırasında alınan darbe görüntüsü. Floresanstaki değişiklikleri ayırt etmek zordur ve ancak her bir darbe için görüntüler işlendikten sonra belirgin hale gelir.

Hem kontrol görüntüsündeki hem de puls görüntüsündeki arka planı çıkarın. Bir hücre seçin ve ilgi alanını (ROI) membrana karşılık gelecek şekilde ayarlayın. Kontrol ve puls görüntüsünde bu bölge boyunca floresan ölçümünü yapın ve her puls için değerleri bir hesap çizelgesine aktarın.

Bağıl floresans değişimlerini elde etmek için kontrol verilerini puls verilerinden çıkarın ve sonucu kontrol verilerine bölün. Eğer bir puls dizisi uygulanmışsa, her puls için belirlenen bağıl değişim değerlerinin ortalaması alınabilir. Daha güvenilir bir ölçüm elde etmek için, bağıl floresans değişimlerini indüklenmiş membran voltajına dönüştürün.

Bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak, bu eğrinin kaba bir tahmini literatürden elde edilebilir; ancak daha yüksek doğruluk için her özel düzenek için ayrı ayrı ölçülmesi gerekir. Voltajı, bağıl ark uzunluğunun bir fonksiyonu olarak grafiğe dökün. Küresel hücreler için uygun bir filtre kullanılarak eğri düzleştirilebilir.

Elde edilen grafik, Schwan denklemiyle uyumlu olarak kosinüse yakındır. Daha karmaşık hücre şekilleri için aynı prosedür, membran voltajının daha karmaşık uzaysal dağılımlarını verir.