Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Bu protokol, indirgenebilir membran geçirgenleştirme reaktifleri kullanarak çoğu plazma membranı proteininin endositik hızını ölçmek için genel bir yöntem sunmaktadır; bu prosedürde, hücre yüzeyindeki hücre dışı lizinler içeren veya kovalent olarak etiketlenmiş proteinler, burada yeşil renkte gösterilen sulfo-NHS-SS-biotin ile 4 °C'de işaretlenir. Ardından, yüzey proteinlerinin endositozuna izin vermek için hücreler 37 °C'ye ısıtılır. Daha sonra membran trafiğini durdurmak için hücreler tekrar 4 °C'ye döndürülür ve yüzeyde kalan biotinler, disülfür bağını koparan bir indirgeyici ajan kullanılarak uzaklaştırılır.

Böylece geriye kalan tek biotinillenmiş proteinler, hücre yüzeyinde başlayan, içselleştirilen ve stripping prosedüründen korunan proteinlerdir. Son olarak, hücreler solubilize edilir ve biotinillenmiş proteinler strep avid ve afinite kromatografisi ile izole edilir. Merhaba, ben Massachusetts Tıp Okulu Psikiyatri Bölümü'ndeki Heli Milk Ian laboratuvarından Luke Gabriel.

Bugün sizlere, geri döndürülebilir biyotin elüsyon tekniği kullanarak endositik veya internalizasyon hızlarının nasıl ölçüleceğine dair bir prosedürü göstereceğiz. Bu prosedürü, dopamin taşıyıcısının internalizasyon hızını ölçmek için kullanıyoruz. Hadi başlayalım.

Deneyden bir gün önce, ertesi gün kullanılacak hücreleri ve substratları hazırlayın. Hücre tipleri ve besiyerleri farklılık gösterecektir; ancak deney hücreleri güçlü bir şekilde yapışmıyorsa, her altı kuyucuklu plaka üzerinde polilizin kaplı doku kültürü plakaları gibi uygun bir hücre yapışma substratı kullanın. İki ayrı plaka kullanarak toplamda dört kuyucuğu etiketleyin.

Test edilen her protein için, kontrol plakasındaki iki kuyucuk toplam yüzey proteini ve stripping kontrolleri için kullanılacaktır. Test edilen her internalizasyon koşulu için deneysel plakada bir kuyucuk hazırlayın. Hücrelerin ertesi güne kadar yaklaşık %80 konfluens düzeyine ulaşması için, 2 mL hücre kültürü içinde 1x10⁶ hücre ekleyin.

Hücreleri kültürledikten sonra, aşağıdaki çözeltileri hazırlayın ve ikinci günde kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın. PBS 2+, pH 7.4 olan fosfat tamponlu salin ile hazırlanır ve 1.5 millimolar magnezyum klorür ile 0.2 millimolar kalsiyum klorür ile desteklenir. Notasyon sönümleme çözeltisi, 100 millimolar glisin ile desteklenmiş PBS 2+ kullanılarak hazırlanır. NT tamponu, 150 millimolar sodyum klorür, 1 millimolar EDTA, %0.2 BSA ve pH 8.6'da 20 millimolar tris ile hazırlanır. RIPA tamponu; pH 7.4'te 10 millimolar tris, 150 millimolar sodyum klorür, 1 millimolar EDTA, %0.1 SDS, %1 triton X-100 ve %0.1 sodyum deoksikolat kullanılarak hazırlanır.

Ardından, SULF N-H-S-S-S biotin stok çözeltisini SULFOXIDE veya DMSO içinde 200 mg/mL konsantrasyona ulaşacak şekilde çözerek hazırlayın. 500 µL'lik alikotlar hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. Alikotlar, bu işlemden sonra birkaç kez dondurma-çözme döngüsüne girebilir.

İki karboksi etil fosfin hidroklorür veya TCEP stok çözeltisi, 50 milimolar tris içinde çözünmüş 500 milimolar konsantrasyonda hazırlanır ve pH 7,4'e ayarlanır. TCEP oldukça asidik olduğundan, çözeltinin pH değerinin 7,4'e ayarlanması gerekecektir; TCEP'i folyo ile kapatıp -20 °C'de saklayın. İkinci günde, %0,18 glukoz ve %0,2 IgG proteazsız sığır serum albumin takviyeli PBS 2+ veya PBS 2+ GBSA hazırlayıp bir su banyosunda 37 °C'ye ön ısıtma yapın.

SFO N-H-S-S-S biyotin stok çözeltisini oda sıcaklığında çözdürün. Taze kükürt N-H-S-S-S biyotin çözeltisini kullanımdan hemen önce hazırlayın. DMSO'yu çözmek için çözeltiyi vorteksle kuvvetlice karıştırın.

Her iki plakayı da soğuk odadaki bir buz banyosuna yerleştirin ve plakaları, tamponun tamamen süzülmesini sağlamak için hafif bir açıyla tutarak her kuyucuğu iki mililitre buz gibi soğuk PBS iki ile üç kez durulayın. Son yıkamayı takiben, her kuyucuğa 0,75 mililitre taze sulfa N-H-S-S-S biotin çözeltisi ekleyin. Kuyucukları, inkübasyonun hemen öncesinde bir platform çalkalayıcı üzerinde güçlü bir şekilde çalkalayarak, buz banyosunda dört derece Celsius'ta 15 dakika boyunca inkübe edin.

Başka bir taze SUHO N-H-S-S-S biotin çözeltisi hazırlayın ve 15. dakikada eski çözeltiyi taze çözeltiyle değiştirin. İkinci inkübasyondan sonra, platform çalkalayıcıda güçlü çalkalama ile dört derece Celsius'ta 15 dakika daha inkübe edin, ardından reaksiyona girmeyen tüm NHS biotin moleküllerini söndürmek için hücreleri iki mililitre söndürme çözeltisi ile hızlıca üç kez yıkayın. Son olarak, iki mililitre söndürme çözeltisi içinde 15 dakika inkübe edin.

15. dakikada taze saptırma çözeltisi ile değiştirin ve 15 dakika daha inkübe edin. Her inkübasyon sırasında plakaları bir platform sarsıcısında hafifçe sallayarak dört santigrat derece Celsius'ta tutun; kontrol plakası ise soğuk odadaki tezgah üzerinde saptırma çözeltisinde kalmalıdır. Bu noktada deney plağını soğuk odadan buz banyosuna çıkarın.

İlaç tedavileri test ediliyorsa, önceden ısıtılmış PBS 2 artı GBSA'ya uygun ilaç konsantrasyonlarını ekleyin. Burada, PKC yolunu aktive etmek için ya bir etanol taşıyıcı ya da 1 µM PMA kullanıyoruz. Deney plakasının her kuyusunu, önceden ısıtılmış PBS 2 artı GBSA ile üç kez yıkayın ve son yıkamanın ardından uygun ilaç tedavilerini ekleyin.

Plaka genelinde sıcaklığın eşit olmasını sağlamak için ilgili PBS 2 + GBSA çözeltilerinden iki mililitre ekleyin ve boş kalan kuyucukları önceden ısıtılmış besiyeri ile doldurun. İnkübasyonun bitiminden hemen önce hücreleri 10 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın. NT tamponu içindeki 50 mM TCEP çözeltisini kullanarak taze stripping çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.

Kuyu başına bir mililitre olacak şekilde yeterli miktarda hazırlayın. 10 dakikalık inkübasyonun ardından, deney plakasını hızla buz banyosuna aktarın ve soğuk odaya geri götürün. Endositozu durdurmak için deney kuyularını, kuyu başına iki mililitre buz soğukluğundaki NT tamponu ile üç kez hızla yıkayın.

Ardından, stripping kontrol kuyucuğunu iki mililitre buz gibi soğuk NT tamponu ile üç kez yıkayın. Toplam kontrol kuyucuklarını söndürme çözeltisi içerisinde bırakın. Her bir deney ve strip kontrol kuyucuğuna bir mililitre stripping çözeltisi ekleyin ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyon sona ermeden önce, hafifçe çalkalayarak 4 °C'de bekletin. Tekrar, daha önce olduğu gibi aynı hacimde taze stripping çözeltisi hazırlayın. 15 dakika sonra, eski strip çözeltisini taze çözeltiyle değiştirin ve hücreleri öncelikle liz etmek için hafifçe çalkalayarak 4 °C'de 15 dakika daha inkübe edin.

Sıyırma solüsyonuna maruz kalan tüm kuyucukları iki mililitre NT tamponu ile üç kez yıkayın. Ardından, toplam kontroller dahil tüm kuyucukları iki mililitre soğuk pbs ile üç kez yıkayın. Son yıkamanın ardından, her kuyucuğa taze proteaz inhibitörleri içeren 300 mikrolitre RIPPA tamponu ekleyip hücreleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca çalkalayarak lyze edin.

Lizatı 1,5 mililitrelik mikro tüplere aktarın ve hücre kalıntılarını 4 °C'de 18,000 GS'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek temizleyin. Lizat protein konsantrasyonunu standart bir sığır serum albümin eğrisi ile karşılaştırarak belirlemek için liz koşullarınızla uyumlu bir protein analizi kullanın; örneğin Pierce'tan BCA protein analizi. Bunun ardından, lizatları strep ve afinite kromatografisi için hazırlayın.

1,5 mililitre mikrofüj tüplerini, her örnekten eşit miktarda protein ile doldurun. Bu deneyde, 50 mikrogram hücre lizatlarından biyotinillenmiş proteinleri izole ediyoruz. Her bir örnek için, proteaz inhibitörleri içeren Ripa tamponu ekleyerek final hacmi 200 mikrolitreye tamamlayın.

Daha sonra, strep avid ve agro boncuklarını kullanmadan önce kuvvetlice vorteksleyin; ucu kesilmiş 200 µL'lik bir pipet kullanarak her tüpe 20 µL şeritlenmiş avid ve boncuk ekleyin. Tüpleri vorteksleyin ve bir tüp rotatöründe 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, örnekleri oda sıcaklığında 18,000 ×g'de iki dakika santrifüj ederek boncukları toplayın; aspiratörle boncuk peletine yaklaşmamaya dikkat ederek lizatı aspire edin ve 0,75 mL oda sıcaklığında ekleyin.

Her tüpe Rip tamponu ekleyin ve boncukları yıkamak için en yüksek hızda vorteksleyin. 18,000 GS'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Boncukları toplamak için oda sıcaklığında bekletin ve bu yıkama-vorteks-santrifüj döngüsünü, toplam üç yıkama olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın; son yıkamadan sonra.

Boncuk peletini yerinden oynatmadan tamponun mümkün olduğunca fazlasını aspire edin. Ardından, her tüpe 20 ila 25 µL iki katı indirgeyici Laemmli tamponu ekleyin. İndirgeyici ajan, N-H-S-S-S biyotin disülfür bağını kopararak izole edilen proteinlerin çözeltiye salınmasını sağlayacaktır.

Çoğu membran proteini kaynatılmaya dayanıklı olmadığından, redüksiyon ve denatürasyon sonrası proteinleri ayırmak için tüpleri bir rotatör üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Standart bir SDS-PAGE kullanarak proteinleri immünoblotlama için bir membrana aktarın ve uygun bir antikor ile blotlama yapın. Bu deneyde, Checon marka 360 9 numaralı sıçan anti-DAT antikorunu 1:2000 dilüsyonunda kullandık. Doymuş piksel bulunmadığından emin olarak, immunoreaktif bantları bir CCD kamera jel görüntüleme sistemi ile yakalayın. Bu deneyde, her bir bandın yoğunluğunu nicelendirmek için Quantity One yazılımına sahip bir BioRad VersaDoc görüntüleme sistemi kullandık.

Dopamin taşıyıcısı üzerindeki tersinir biyotinilasyon prosedüründen elde edilen temsili bir immünoblok burada gösterilmiştir. En güçlü sinyal, toplam şeritte veya T'de görülen, internalizasyon öncesindeki toplam yüzey protein miktarıdır. Şerit kontrolü veya S, ideal olarak boşluğa yakın olmalı ve yüksek şerit verimliliği sergilemelidir. Şerit verimliliği, aşağıdaki formüldeki bant yoğunluğu ölçümleri kullanılarak hesaplanır.

Bu deneydeki şeridin verimliliği %99,8 idi; %90 ve üzeri verimliliğe sahip şeritler optimaldir ve bu seviyenin altındaki sonuçlar atılmalıdır. Bir gözenek şeridinin bu örneği, %34'lük bir şerit verimliliğine sahip şerit kulvarında görünür bir bant göstermektedir. Burada, yoğunluğu daha düşük olan bantlar deney plakasından gelen internalizasyon kulvarlarıdır. Hücreler, 10 dakikalık bir internalizasyon süresi boyunca araç çözeltisi veya 1 µM PMA ile işlem görmüş ve dopamin taşıyıcı internalizasyon oranları ölçülmüştür.

İçselleştirme oranı, bant yoğunluğu ölçümleri kullanılarak şu şekilde hesaplanır; bu grafikte görüldüğü üzere, araç uygulanan koşullar altında 10 dakika boyunca yüzey DAT'ın %10,4'ü içselleştirilmiştir. Ancak PMA uygulaması, DAT içselleştirme oranlarını toplam yüzey DAT'ın %23,2'sine yükseltmiştir. Böylece, geri dönüşümlü biyotinilasyon tekniği kullanarak plazma membranı protein içselleştirme oranlarının nasıl ölçüleceğini görmüş oldunuz.

Biotonation reaktifi ile TCP'nin kullanımdan hemen önce taze olarak hazırlanması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Protokol sırasında çok fazla hücre kaybı yaşadığınızı fark ederseniz, plaklarınızda bir hücre yapışma substratı kullanın. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneyinizde başarılar dileriz.