Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

Bu prosedür, belirli hücre tiplerinde GFP eksprese eden bitkilere dayanmaktadır; bu hücreler daha sonra floresan aktive hücre ayıklama veya FACS kullanılarak bitkinin diğer hücrelerinden izole edilebilir. Bu örnekte, Arabidopsis'in belirli hücre tiplerinde eksprese olan iki marker hattı kullanılmaktadır. Aliana kök fideleri fito tepsilerinde veya agar plaklarında yetiştirilir.

Kökleri hasat edilir ve hücre duvarı sindiren enzimlerle işlem görür. Bir saat sonra, büyük kalıntıları uzaklaştırmak için çözelti filtrelenir. Ardından çözelti santrifüjlenir ve süpernatan uzaklaştırılır.

GFP pozitif protoplastlar daha sonra FACS ile ayrıştırılır. Sıralanan materyal, genom çapında transkripsiyonel profiller gibi hücre tipine özgü analizler için kullanılabilir. Merhaba, ben New York Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ndeki Ken Birnbaum laboratuvarından Basian Barman.

Bugün sizlere bitki protoplastlarının floresan aktive hücre ayıklama prosedürünü göstereceğiz. Bu örnekte, Arabidopsis kökünde iki spesifik hücre tipini ayıklayacağız. Laboratuvarımızda hücre tipine özgü transkripsiyonel profilleri incelemek için bu prosedürü kullanmaktayız.

Hadi başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, yaban tipi fidelerin yanı sıra GFP'nin hücre tipine özgü ekspresyonuna sahip fideleri yetiştirin. Bir grup fidede GFP'yi yönlendiren scarecrow promotörü, kök endodermisini ve durgun merkezi işaretler.

Diğer bir grupta, kök durgun merkezi, GFP ekspresini sağlayan walks five promotörü ile işaretlenmiştir. Fideler, köklerin büyüme ortamına geçmesine izin veren bir naylon filtrenin üzerinde, FIA tepsolarında hidroponik olarak yetiştirilir. Alternatif olarak, bitkiler bir naylon ağ üzerinde ve dikey konumlandırılmış %1 agar plaklarında yetiştirilebilir.

Filtreler, köklerin hasat edilmesine yardımcı olmanın yanı sıra, fidelerin toplu halde yeni fitotepsilere veya ilgilenilen bir katalizörle desteklenebilecekleri agar plakalarına aktarılmasına olanak tanır. Bu işlem; hücre tipine özgü besin maddelerine, hormonlara veya stres uygulamalarına verilen transkripsiyonel yanıtları incelemek için yapılabilir. Floresan markörün beklendiği gibi eksprese edildiğini doğrulamak için floresan mikroskobu altında kontrol edin.

Markerın ekspresyon paterninin uygulanan işlem koşulları altında tutarlı olduğundan emin olun, çünkü işlem sonucunda bu patern değişebilir. Protoplastların hasadı ve hazırlanması aşamasına geçin. Protoplast çözeltisini hazırlayarak başlayın.

Demineralize su içerisinde %1,25 ağırlık/hacim selülaz, %0,3 ağırlık/hacim maser zyme, 0,4 molar D mannitol, 20 millimolar MES ve 20 millimolar KCL'yi birleştirin ve pH değerini pH 7,5'te bir molar tris HCL ile 5,7'ye ayarlayın. Bu çözelti hafif bulanık olacaktır. Ardından çözeltiyi 10 dakika boyunca 55 degrees Celsius'ye ısıtın.

Çözelti berraklaşacaktır, oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın ve ardından %0,1 ağırlık/hacim BSA, 10 millimolar kalsiyum klorür ve beş millimolar beta me kapto etanol ekleyin; bir phyto tepsisinden bir haftalık fideleri hasat edin. Scarecrow GFP hattı söz konusu olduğunda veya dört günlük walks 5G FP fidelerinden sekiz plaka kullanın. Kökleri bir bisturi ile naylon ağdan sıyırın, ardından bunları protoplast çözeltisi içeren bir kaba yerleştirin.

1500 fide için yaklaşık 10 mililitre protoplast çözeltisi kullanın. Erlenmayerleri oda sıcaklığında, 75 RPM hızda bir saat boyunca nazikçe çalkalayın. İnkübasyon süresinin uzatılması protoplast verimini artırabilir, ancak aynı zamanda protoplastların kendi gen ekspresyonu üzerindeki etkisini de artıracaktır.

Protoplastlar serbest kaldığında, çözeltiyi süzmek için 40 mikrometre hücre süzgeci kullanın ve protoplast süspansiyonunu konik 15 mil tüplere bölün. Akış hücrelerinin tıkanmasını önlemek ve hücrelerin ayıklanması için gereken süreyi minimize etmek adına, çok fazla kalıntı içermeyen temiz bir protoplast süspansiyonu oluşturmak önemlidir. Tüpleri, salınım kovalı bir santrifüjde, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin.

Santrifüj hızının, protoplastların elde edildiği bitki kesitinin yapısına ve enzimatik işlem sırasında oluşan hücre kalıntısı miktarına bağlı olduğunu unutmayın. Santrifüjden sonra süpernatantın çoğunu uzaklaştırın ve protoplastları içeren peleti, geriye kalan az miktardaki protoplast çözeltisi içinde nazikçe yeniden süspande edin. Son olarak, bir hemositometre kullanarak protoplastları sayın ve verimi hesaplamak ve FACS çalışma parametrelerine karar vermek için yoğunluklarını belirleyin.

Sayım işleminden sonra protoplastları inceleyin. Bütünlüklerini, GFP ekspresyon seviyesini ve kontamine hücre kalıntılarının içeriğini kontrol edin. Ardından, fax işlemine geçin.

Doğrudan faks işlemine geçilmeyecekse, protoplastlar yıkanabilir, yeniden süspanse edilebilir ve eklenmiş enzimler içermeyen proto plakalama çözeltisi veya W5 çözeltisi gibi bir inkübasyon çözeltisinde saklanabilir. Hücre ayırıcısını ve iş istasyonu bilgisayarını açın.

Burada Becton Dixon ve Company tarafından üretilen bir fria kullanıyoruz. Kılıf sıvısı olarak bir XPBS kullanın ve akışkan başlatma prosedürünü çalıştırın. 100 mikrometre çapında bir nozul takın ve 20 PSI kılıf basıncı ayarlayın.

Kararlı bir akış hattı kurun ve damla gecikmesini kalibre edin. Kalibrasyon işleminin bu prosedürde gösterilmediğini unutmayın. Mil başına 10 milyon hücre kadar yüksek yoğunluktaki protoplast süspansiyonları başarıyla ayrıştırılabilir.

Protoplastların çökelmesini önlemek için, cihazdaki örnek karıştırma seçeneğini kullanın. Eğer cihazda tıkanma sorunu oluşursa, uygulanabilecek üç olası çözüm adımı vardır. İlk olarak, örnek hattına geri yıkama işlemi uygulayın.

İkinci olarak, yoğunluğu azaltmak için protoplast süspansiyonunuzu seyreltin. Üçüncü olarak, santrifüjasyon ve yeniden süspansiyon işleminden sonra filtrasyon adımını tekrarlayarak protoplast çözeltisini temizleyin. 488 nanometre lazer ile uyarılmanın ardından, GFP pozitif protoplastları, GFP negatif protoplastlardan ve hücre kalıntılarından ayırt etmek için yalnızca dört parametre kullanılır; ileri saçılma (forward scatter) partikül boyutunun, yan saçılma (side scatter) ise partikül granülaritesinin bir göstergesidir.

Yeşil floresan ölçümü için 530 nanometrelemede emisyon ve kırmızı spektrum otofloresan ölçümü için 610 nanometrelemede emisyon. İleri saçılma (forward scatter) ile yan saçılma (side scatter) için bir nokta grafiği (dot plot) oluşturarak başlayın. Ölçülen olaylar grafiğin merkezinde yer alacak şekilde voltaj ayarını uygulayın.

GFP pozitif PROTOPLASTLAR, otofloresans gösteren olaylara kıyasla artmış yeşil/kırmızı emisyon oranları ile ayırt edilebilir. Sadece yeşil floresansa karşı kırmızı spektrum otofloresansını içeren bir nokta grafiği (dot plot) oluşturun. Voltaj ayarlarını, ölçülen olayların grafikte tek bir diyagonal popülasyon oluşturacağı şekilde uygulayın.

Yabani tip protoplast süspansiyonuna bakıldığında, GFP pozitif PROTOPLASTS, yabani tip örneklerde görülmeyen belirgin bir yeşil floresan olaylar popülasyonu oluşturmalıdır. Yeşil floresans ile kırmızı spektrum otofloresansı arasındaki spektral örtüşmeyi düzenlemek için kompanzasyon kısıtlamalarını ayarlayın. GFP pozitif bir PROTOPLASTS süspansiyonu kullanıldığında, uygun kompanzasyon kısıtlama ayarları, GFP pozitif protoplastların GFP negatif protoplastlardan ve debrislerden daha iyi ayrılmasını sağlayacaktır; GFP pozitif olayları tanımlamak için bir gate belirleyin.

Kapı sınırlarını belirlemeye yardımcı olması için, her sıralama deneyi hazırladığınızda yanınızda GFP negatif PROTOPLASTLAR bulundurmanız önerilir. Son olarak, küçük kalıntıları analiz dışı bırakmak için bir ileri saçılım (forward scatter) eşik değeri belirleyin. İleri saçılım ile yan saçılım (side scatter) grafiğindeki GFP pozitif olayların görselleştirilmesi, eşiğin nereye ayarlanması gerektiğini belirlemeye yardımcı olacaktır.

Bu başlangıç çalıştırmasında ayarlanan parametreler, gelecekteki ayırma işlemleri için yeniden kullanılabilir. Günlük kullanımda parametrelerde küçük ayarlamalar gerekecektir. RNA ekstraksiyonu için, kılavuz olarak en fazla 100 µl ayırma hacmi için 350 µl ekstraksiyon tamponu içeren toplama tüpleri hazırlayın.

20.000 sıralama olayı, toplamda yaklaşık 100 mikrolitre sıralama hacmi sağlar. FACS parametreleri ve çalışma modları ayarlandığına ve toplama tüpleri hazır olduğuna göre, sıralama tamamlandığında protoplastların sıralanmasına başlayın. Hücre süspansiyonu üst kısımda toplanabileceği için örnek toplama tüplerini karıştırın; RNA ekstraksiyonu ve cDNA amplifikasyonunun ardından mikroarray analizi için 500 kadar sıralanmış olay kullanılabilir.

Burada RNEZ mikro ekstraksiyon kiti, WT ovation PICO RNA amplifikasyon sistemi ve fl ovation CD NA biotin modül V iki kullanılmıştır. Non-GFP Scarecrow, GFP ve W 5G FP fidillerinden türetilen protoplastler için tipik FACS sonuçları burada sunulmuştur; her bir nokta grafiğinde, x ekseninde yeşil floresan ve y ekseninde kırmızı floresana karşılık 100.000 olay gösterilmektedir. Y ekseninde, GFP ayırma kapısı (sorting gate) içine düşen olaylar yeşil ile vurgulanmıştır.

Bu, ya kök endodermisini ve durgun merkezi işaretleyen scarecrow GFP ya da kök durgun merkezini işaretleyen walks 5G FP eksprese eden fidelerden elde edilen tipik protoplast veriminin bir özetidir. Kök durgun merkezinde, kök endodermisine kıyasla daha az hücre bulunur. Bu nedenle, başlangıçta daha fazla protoplast olmasına rağmen, GFP eksprese eden hücrelerin verimi walks 5G FP ayıklamasında, scarecrow GFP ayıklamasına göre daha düşüktür; burada üç tekrarlı örneklerin tipik RNA ekstraksiyon sonuçları gösterilmektedir.

Her bir örnek, 10.000 olaydan ekstrakte edilen RNA'ya karşılık gelmektedir. Ekstrakte edilen RNA, üst kısımda scarecrow GFP örneklerine ve alt kısımda walks 5G FP örneklerine ait ribozomal pikleri gösteren bir bioanalyzer ile analiz edilir; ekstrakte edilen RNA daha sonra mikroarray analizi için kullanılabilir. Log iki ekspresyon seviyelerini gösteren bu dağılım grafiği, iki replika arasındaki benzerliği ortaya koymaktadır.

Hücre tipine özgü analizler için bitki protoplastlerinin floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama yönteminin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu teknik, birçok farklı bitki dokusu ve türü için uygulanabilir. Düşük kalıntı içeriğine sahip yüksek verim ve sağlıklı protoplastlar, transkripsiyonel analizlerin yanı sıra diğer analizlerde de daha iyi sonuçlar sağlayacaktır.

Ayrıca, ayrıştırılmış örnekler arasındaki karşılaştırma için bitki materyalinin büyüme koşullarının aynı tutulmasının önemli olduğunu unutmayın. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.