Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

Bitki materyali belirli hücre türlerini izole etmek için kullanılan bir yöntem olduğunu göstermiştir. Bu teknik, özellikle hücre tipleri, hücresel bölünmeler ve Floresans Aktif Hücre Sıralama floresan proteinleri ifade transgenik işaretleyici hatları kullanmaktadır. Ayrıca, büyüme kurulumu kolaylaştıran tedavisi burada kuruldu

Bu prosedür, bitkilerin belirli hücre tiplerinde GFP eksprese etmesine dayanır ve bu daha sonra floresanla aktive edilmiş hücre sıralaması veya gerçekler kullanılarak bitki hücrelerinin geri kalanından izole edilebilir. Bu örnek, Arabidopsis'in belirli hücre tiplerini ifade eden iki işaret çizgisi kullanır. Aliana kök fidanları fito tepsilerde veya agar plakalarında yetiştirilir.

Kökleri toplanır ve hücre duvarı sindirme enzimleri ile muamele edilir. Bir saat sonra, büyük kalıntıları gidermek için çözelti süzülür. Çözelti daha sonra santrifüjlenir ve süpernatan çıkarılır.

GFP pozitif protoplastlar daha sonra faks ile ayrılır. Sıralanan materyal, genom çapında transkripsiyonel profiller gibi hücre tipine özgü analizler için kullanılabilir. Merhaba, ben New York Üniversitesi Biyoloji Bölümü'nde Ken Birnbaum'un laboratuvarından Basian Barman.

Bugün size bitki protoplastlarının floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması için bir prosedür göstereceğiz. Bu örnekte, Arabidopsis rotasında iki belirli hücre türünü sıralayacağız. Bu prosedürü laboratuvarımızda hücre tipine özgü transkripsiyonel profilleri incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, yabani tip fidelerin yanı sıra hücre tipine özgü GFP ekspresyonuna sahip fideler yetiştirin. GFP'yi çalıştıran korkuluk promotörü, bir grup fidede kök endodermisini ve hareketsiz merkezi işaretler.

Ve başka bir grupta, kök hareketsiz merkez, GFP'yi süren beş promotör yürüyüşü ile işaretlenir. Fideler hidroponik olarak yetiştirilir ve FIA tepsileri, köklerin büyüme ortamına doğru büyümesine izin veren bir naylon filtrenin üzerinde yetiştirilir. Alternatif olarak, bitkiler bir naylon ağın üzerinde ve dikey olarak konumlandırılmış %1 agar plakaları üzerinde yetiştirilebilir.

Filtreler, köklerin hasadına yardımcı olmanın yanı sıra, fidelerin kütle üzerinde yeni fito tepsilerine veya agar plakalarına aktarılmasına izin verir ve burada bir ilgi katalizörü ile desteklenebilirler. Bu, besinlere, hormonlara veya stres tedavilerine hücre tipine özgü transkripsiyonel yanıtları incelemek için yapılabilir. Floresan işaretleyicinin beklendiği gibi ifade edildiğini doğrulamak için floresan mikroskobu altında kontrol edin.

Tedavi sonucunda değişebileceğinden, işaretleyicinin ifade paterninin uygulanan tedavi koşulları altında tutarlı olduğundan emin olun. Protoplastları hasat etmeye ve hazırlamaya devam edin. Protoplast çözeltisini hazırlayarak başlayın.

Hacim başına %1.25 ağırlık, selülaz hacim başına %0.3 ağırlık, maser zyme 0.4 molar D mannitol 20 milimolar, MES ve 20 milimolar KCL'yi demineralize suda birleştirin ve pH 7.5'te bir molar tris HCL ile pH'ı 5.7'ye ayarlayın. Bu çözelti biraz bulanık olacaktır. Daha sonra çözeltiyi 10 dakika boyunca 55 santigrat dereceye ısıtın.

Çözelti berraklaşacak, oda sıcaklığına soğumaya bırakacak ve daha sonra hacim başına% 0.1 ağırlık BSA 10 milimolar kalsiyum klorür ve bir fito tepsisinden bir haftalık fideleri beş milimolar beta me capto etanol hasat edecektir. Korkuluk söz konusu olduğunda, GFP hattı veya dört günlük sekiz tabak 5G FP fidelerini yürür. Naylon ağdan kökleri bir neşterle kazıyın, ardından protoplast solüsyonu içeren bir kaba koyun.

1500 fide başına yaklaşık 10 mililitre protoplast çözeltisi kullanın. Şişeleri oda sıcaklığında 75 RPM'de bir saat boyunca hafifçe çalkalayın. Daha uzun bir inkübasyon süresi protoplast verimini artırabilir, ancak aynı zamanda protoplastların kendisinin gen ekspresyonu üzerindeki etkisine de katkıda bulunacaktır.

Artık protoplastlar serbest bırakıldığına göre, çözeltiyi filtrelemek ve protoplast süspansiyonunu konik 15 mil tüpler arasında bölmek için 40 mikrometrelik bir hücre süzgeci kullanın. Gerçeklerin tıkanmasını önlemek ve hücreleri sıralamak için gereken süreyi en aza indirmek için çok fazla kalıntı olmadan temiz protoplast süspansiyonu oluşturmak önemlidir. Tüpleri bir döner kova santrifüjünde 500 G'de oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin.

Santrifüjleme hızının, protoplastları veren bitki bölümünün yapısına ve enzimatik işlem sırasında üretilen hücre kalıntısı miktarına bağlı olduğunu unutmayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantın çoğunu çıkarın ve protoplastları içeren peleti küçük hacimli kalan protoplast çözeltisinde nazikçe yeniden süspanse edin. Son olarak, bir hemo sitometre kullanarak protoplastları sayın ve verimi hesaplamak için yoğunluklarını belirleyin ve gerçeklere karar verin çalışma parametreleri.

Saydıktan sonra protoplastları inceleyin. Bütünlüklerini, GFP ekspresyon seviyesini ve kontamine hücre kalıntılarının içeriğini kontrol edin. Ardından, faksa devam edin.

Değilse, doğrudan faksa geçin. Protoplastlar yıkanabilir, yeniden süspanse edilebilir ve eklenen enzimler veya W beş çözeltisi olmadan proto kaplama çözeltisi gibi bir inkübasyon çözeltisinde saklanabilir. Hücre sıralayıcısını ve iş istasyonu bilgisayarını açın.

Burada Becton Dixon and Company tarafından üretilen bir fria kullanıyoruz. Kılıf sıvısı olarak bir XPBS kullanın ve sıvı başlatma prosedürünü çalıştırın. 100 mikrometrelik bir nozul takın ve 20 PSI kılıf basıncı ayarlayın.

İstikrarlı bir akış akışı ayarlayın ve düşme gecikmesini kalibre edin. Kalibrasyonun bu prosedürde gösterilmediğini unutmayın. Mil başına 10 milyon hücre kadar yüksek bir yoğunluğa sahip protoplast süspansiyonları başarılı bir şekilde sıralanabilir.

Protoplastların çökelmesini önlemek için, gerçekler üzerinde numune çalkalama seçeneğini kullanın. Gerçeklerin tıkanması bir sorunsa, üç olası çekim adımı vardır. İlk olarak, bir numune hattı geri yıkaması gerçekleştirin.

İkinci olarak, yoğunluğu azaltmak için protoplast süspansiyonunuzu seyreltin. Üçüncüsü, santrifüjleme ve resus süspansiyonundan sonra filtrasyon adımını tekrarlayarak protoplast çözeltisini temizleyin. GFP pozitif protoplastları GFP negatif protolastlardan ayırt etmek için sadece dört parametre kullanılır ve 488 nanometrelik bir lazerle uyarıldıktan sonra hücre kalıntıları ileri saçılma partikül boyutunun bir göstergesidir, yan saçılma partikül tanecikliğinin bir göstergesi olarak kullanılır.

Yeşil floresan ölçüsü olarak 530 nanometrede emisyon ve kırmızı spektrum otofloresan ölçüsü olarak 610 nanometrede emisyon. İleri dağılım ve yan dağılım için bir nokta grafiği ayarlayarak başlayın. Voltaj ayarını, ölçülen olaylar grafikte ortalanacak şekilde uygulayın.

GFP pozitif PROTOPLASTLAR, otofloresan olaylarına kıyasla artan yeşil ve kırmızı emisyon oranları ile ayırt edilebilir. Yalnızca kırmızı spektrum otofloresansına karşı yeşil floresan ile bir nokta grafiği ayarlayın. Voltaj ayarlarını, ölçülen olaylar grafikte tek bir diyagonal popülasyona yol açacak şekilde uygulayın.

Yabani tip bir protoplast süspansiyonuna bakıldığında, GFP pozitif PROTOPLASTLAR, yabani tip numunelerde hiç görülmeyen berrak bir yeşil floresan olay popülasyonu üretmelidir. Yeşil floresan ve kırmızı spektrum otofloresan arasındaki spektral örtüşmeyi ayarlamak için telafi kısıtlamalarını ayarlayın. Bir GFP pozitif PROTOPLAST süspansiyonu kullanarak, uygun kompanzasyon kısıtlamaları ayarları, GFP pozitif protoplastların GFP olmayan protoplastlardan daha iyi ayrılmasına izin verecek ve döküntü, GFP pozitif olayları tanımlamak için bir kapı oluşturacaktır.

Kapı sınırlarını tanımlamaya yardımcı olmak için her sıralama deneyi hazırladığınızda GFP olmayan PROTOPLASTLARI yanınıza almanız önerilir. Son olarak, küçük kalıntıları analizin dışında bırakmak için bir ileri saçılma eşiği sınırı ayarlayın. İleri saçılma ve yan saçılma grafiğinde GFP pozitif olaylarının görselleştirilmesi, eşiğin nerede ayarlanması gerektiğinin belirlenmesine yardımcı olacaktır.

Bu ilk olgular çalıştırmasında ayarlanan parametreler gelecekteki sıralamalar için yeniden kullanılabilir. Gerçeklerin günlük kullanımı için küçük ayarlamalar gerekecektir. RNA ekstraksiyonu için, RNA ekstraksiyon tamponu içeren toplama tüplerini hazırlayın, kılavuz olarak en fazla 100 mikrolitre sıralama hacmini 350 mikrolitre ekstraksiyon tamponuna kullanın.

20.000 sıralama olayı, yaklaşık 100 mikrolitrelik bir toplam sıralama hacmi verir. Artık faks parametreleri ve çalışma modları ayarlandığına ve toplama tüpleri hazır olduğuna göre, sıralama tamamlandığında protoplastları sıralamaya başlayın. RNA ekstraksiyonu ve CD NA amplifikasyonunu takiben mikrodizi analizi için 500 kadar az sıralanmış olay kullanılabildiğinden, hücre süspansiyonu üstte toplanabileceğinden, numune toplama tüplerini karıştırın.

Burada RNEZ mikro ekstraksiyon kitini, WT ovation PICO RNA amplifikasyon sistemini ve fl ovation CD NA biotin modülü V two'yu kullanıyoruz. İşte GFP olmayan Korkuluk, GFP ve W 5G FP fidelerinden türetilen protoplastlar için tipik faks sonuçları 100.000 olay, kırmızı floresansa karşı x ekseninde yeşil floresan her nokta grafiğinde sunulur. Y ekseninde, GFP sıralama kapısına giren olaylar yeşil renkle vurgulanır.

Bu, kök endodermisi ve hareketsiz merkezi işaretleyen korkuluk GFP'yi veya kök hareketsiz merkezini işaretleyen 5G FP'yi ifade eden fidelerden elde edilen tipik protoplast veriminin bir özetidir. Kök hareketsiz merkezinde, kök endodermisine kıyasla daha az hücre vardır. Bu nedenle, daha fazla protoplast ile başlamasına rağmen, GFP eksprese eden hücrelerin verimi, burada gösterilen korkuluk GFP sıralamasına kıyasla 5G FP sıralamasında daha küçüktür, üçlü numunelerin tipik RNA ekstraksiyon sonuçlarıdır.

Her örnek, 10.000 olaydan elde edilen RNA'ya karşılık gelir. Ekstrakte edilen RNA, üstte korkuluk GFP numuneleri için ribozomal zirveleri gösteren bir biyoanalizörde analiz edilir ve ekstrakte edilen RNA'nın altındaki 5G FP numuneleri, mikrodizi analizi için daha fazla kullanılabilir. Günlük iki ifade düzeyinin bu dağılım grafiği, iki çoğaltma arasındaki benzerliği gösterir.

Hücre tipine özgü analiz için bitki protoplastlarının floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamasının nasıl gerçekleştirileceğini az önce gösterdik. Bu teknik birçok farklı bitki dokusuna ve türüne uygulanabilir. Düşük döküntü içeriği ve sağlıklı protoplastlar ile iyi verimler, transkripsiyonel ve diğer analizlerde daha iyi aşağı akış sonuçları verecektir.

Ayrıca, sıralanan numuneler arasında karşılaştırma yapmak için bitki materyalinin büyüme koşullarının aynı tutulmasının önemli olduğunu unutmayın. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.