Işık Mikroskop ile İncelenen Presynaptically Sessiz Sinapslar
January 4th, 2010
Glutamaterjik sinaps sessiz mod aktif bir moda geçiş yapabilirsiniz. Biz kemirgen nöronların ayrışmış kültür bu presinaptik aktivite durumu gösteren aktif sinaps görselleştirmek için FM1-43 boya tamir edilebilir formu kullanarak ve tüm glutamat sinaps görselleştirmek için vGluT-1 antikoru ile immün görüntülenmiştir.
Merkezi sinir sistemindeki bazı presinaptik terminaller işlevsiz veya sessiz görünür. Burada sessiz presinaptik terminalleri tanımlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, terminalleri susturduğundan veya uyandırdığından şüphelenilen tedavileri ve manipülasyonları tanımlamak için uygulanabilir.
Protokol, nöronal depolarizasyon sırasında sinaptik veziküllerin hayati boya etiketlemesini, hem sessiz hem de aktif tüm presinaptik terminalleri etiketleyen bir antikorla sabit hücrelerin müteakip etiketlenmesi ile birleştirir. Sinapsis. Boya ile işaretlenmiş ve antikor aktiftir. Sadece antikor tarafından işaretlenen sinapsis sessizdir.
Merhaba, ben Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Psikiyatri Bölümü'nde Dr.Steve Minick laboratuvarından Amanda Taylor. Ben de Manic Lab'den Shahin'im. Bugün, kültürlenmiş hipokampal nöronları kullanarak sessiz presinaptik terminalleri görselleştirme prosedürünüzü göstermek istiyoruz.
Bu prosedürü laboratuvarımızda, elektriksel aktivitenin ve diğer tek noling yollarının nörotransmitter salınımını nasıl modüle ettiğini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Steril bir laminer akış başlığında, ayrışmış hücre kültürleri hazırlamak için doğum sonrası sıfır gününden üç sıçan veya fareye kadar HIPA'nın satın alamayacağı bir şey kullanın.
Yayınlanmış protokolümüze göre kültürlerimiz karışık glial Aynı diseksiyon hücrelerinden türetilen kültürler steril 35 milimetrelik tabaklara kaplanmalıdır. Her biri, mililitre kollajen plakası başına beş miligram ile kaplanmış sıfır numaralı bir kapak astarı içerir. Santimetre kare başına yaklaşık 500 hücre yoğunluğundaki nöronlar.
12 sıçan yavrusu tipik olarak 30 35 milimetrelik tabak verecektir. Kültürlerin 10 ila 14 gün boyunca bir kültür inkübatöründe büyümesine izin verin. Sinaptik gelişim ve olgunlaşma için, in vitro dördüncü günde glial büyümeyi durdurmak için anti-mitotik a C ekleyin.
Ayrıca in vitro beşinci günde, bu olgunlaşma döneminde nöronal sağkalımı artırmak için nöro bazal ortam artı B 27 takviyesi ile yarım orta değişim gerçekleştirin. Presinaptik olarak sessiz sinapsların sayısını değiştiren tedavileri tanıtın. Glutamat sinapslarının büyük bir yüzdesini susturmanın uygun bir yolunun, 30 milimolar potasyum ile dört saatlik bir tedavi olduğunu bulduk.
Kültürler olgunlaştığında, nöronlar iyi ayrılmış ve kapsamlı nevrotik süreçlerle nispeten düşük bir yoğunluğa sahip olmalıdır. Kültürleri inkübatörden çıkarın ve tezgahın üzerine getirin. Kültür ortamını 45 milimolar potasyum klorür ve 10 mikromolar FM 1 43 FX kalıbı içeren tamponlu bir tuzlu su çözeltisi ile değiştirin.
Bu çözüm, tekrarlayan sinyalleşmeyi önlemek için NBQX ve A PV de içermelidir. Foto ağartmayı önlemek için FM 1 43 FX stok solüsyonunun ve deneylerinin karanlıkta tutulması önemlidir. Bu nedenle, sonraki tüm inkübasyon adımları için kültür kaplarını folyo ile örtün.
Oda sıcaklığında tam olarak iki dakika inkübe edin. Boya çözeltisini çıkarın ve 500 mikromolar bozucu ile tamponlu tuzlu su içinde sadece üç ila beş saniye yıkayın. Yedi. Spesifik olmayan boyayı çıkarmak için bu adımda zamanlama çok önemlidir.
Adv advers F yedi'ye uzun süre maruz kalmak, tüm FM 43 FX etiketini kaldıracaktır. Daha sonra hücreleri yıkayın ve tamponlu tuzlu su yığınlarını adv olumsuz olmadan yıkayın. Kimyasal davlumbazda iki dakikalık aralıklarla beşe yedi.
Kültürleri PBS'de% 4 ve% 0.2 glutaraldehit içinde 10 dakika boyunca sabitleyin. Hücreleri PBS ile kısa bir süre yıkayın. Hücreler artık çeker ocaktan dışarı çıkarılabilir.
Arka planı azaltmak ve immüno-boyama için hücrelere nüfuz etmek için% 4 normal keçi serumuve% 0.04 tritton X içeren bloke edici çözelti ekleyin. 15 dakika inkübe edin. Hücreleri, bloke edici çözeltide bir ila 2000'e seyreltilmiş vlu T bir antikor ile boyayın.
Kültürleri antikorda üç saat boyunca hafifçe sallanarak inkübe edin. Hücreleri PBS ile dört kez yıkayın. Hücreleri Alexa ile kuluçkaya yatırın.
6 47 konjuge anti Gine domuzu antikoru, bloke edici çözelti içinde bir ila 500'e seyreltilmiştir. İkincil antikordaki kültürleri 30 dakika boyunca hafifçe sallayarak koruyun. Hücreleri PBS ile dört kez daha yıkayın.
Forseps kullanarak temiz bir cam slayt üzerine küçük bir damla zemin miktarı yerleştirin. Bir kapak fişi alın ve slayta bakan zemin miktarı hücrelerinin üzerine yavaşça indirin. Slaytın gece boyunca kurumasını bekleyin.
Konfokal lazer tarama mikroskobunda 60 x yağ objektifi hazırlayın. Kapak fişi hedefe bakacak şekilde sahneye bir slayt yerleştirin. Aşırı yoğun olmayan ve somadan uzakta, artık boyayı tutabilen bir nörit alanı bulun.
51 x 51 mikron alan boyutuna yakınlaştırın. Görüntü elde etme yazılımını kullanma. Her adım için 0,3 mikronluk 27 adımda 7,8 mikron derinliği kapsayan bir ZS yığını edinin.
Alandaki tüm glutamaterjik sinapsları tanımlamak için önce VLU T bir antikoru tarayın. Ardından, çekimden sonra görüntüleri analiz etmek için FM 1 43 FX floresansını yeniden tarayın. Z raptiyesini, her piksel seti eşiğinde herhangi bir düzlemden maksimum yoğunluk okumasına dayalı olarak bileşik tek düzlemli bir görüntüye dönüştürmek için analiz yazılımı kullanın.
Arka planı azaltmak için, FM 1 43 efekt lekesine atıfta bulunmadan VG glu T one terminallerini tanımlayın. Ve bu noktaları ilgi alanları olarak işaretleyin. Genellikle alan başına 10 PUNTA seçeriz.
FM 1 43 efekt görüntüsünde eşikleme ve puncta seçimini tekrarlayın ve sessiz sinapsları tanımlamak için görüntüleri üst üste bindirin. Aktif FM 1 43 pozitifini aktif olmayan FM 1 43 negatif sinapslardan ayırt etmek için bir mutlak piksel kriteri veya bir yüzde piksel kriteri kullanılabilir. Kültürlerimizde, V glut one boyama ile tanımlanan glutamat sinapslarının %70 ila 80'inin, yeşil FM 1 43 floresan ve kırmızı V glut one boyamanın üst üste bindirilmiş görüntülerinde saptanabilir FM 1 43 boyaması sergilediğini bulduk.
Bu, birlikte lokalize belirteçlere sahip sarı punkta sinapslarının bolluğu olarak belirgindir. Bunlar oklarla gösterilir. Kırmızı V glut bir pozitif punktanın yaklaşık% 20 ila 30'u, taban çizgisinin üzerinde yeşil FM 1 43 floresansına sahip olmayacaktır.
Bunlar aktif olmayan presinaptik terminallerdir ve bir örnek ok ucu ile gösterilir. Üçüncü bir sinaps popülasyonu da gözlemlenecektir. Bunlar yeşil FM 1 43 floresan için pozitiftir, ancak kırmızı B glut bir lekelenmeden yoksundur.
Bunlar aktif GABAerjik sinapslardır ve bir örnek yıldız işareti ile gösterilir. Bunlar analizlerimizin çoğundan hariç tutulmuştur, ancak bir veziküler GABA taşıyıcı antikoru kullanılarak açıkça incelenebilir. VLU T bir antikorun yerine, FM 1 43 ve VLU bir immün boyama kullanarak presinaptik olarak sessiz sinapsları nasıl görselleştireceğinizi gösterdik.
Bu prosedürü gerçekleştirirken, FM 1 43 FX'in hem adver sub seven yıkamadaki süreye hem de blokaj çözeltisine dahil edilen muamele X 100'ün konsantrasyonuna duyarlı olduğunu hatırlamak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, merkezi sinir sistemindeki sessiz presinaptik terminalleri tanımlamak için bir protokol sunar. Vital boya etiketleme ile immünoboyama kombinasyonu kullanarak araştırmacılar aktif ve sessiz sinapslar arasında ayrım yapabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Sinaptik İşlev
Arka Plan
- Bazı presinaptik terminaller işlevsel değildir veya sessizdir.
- Sinaptik aktiviteyi anlamak sinirbilim araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
- Sessiz terminallerin tanımlanması çeşitli tedavilerin incelenmesine yardımcı olabilir.
- Sinaptik aktivitenin görselleştirilmesi nöronal iletişimin anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Çalışmanın Amacı
- Sessiz presinaptik terminalleri tanımlamak için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Tedavilerin sinaptik aktivite üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Nöronal ağlarda sinaptik dinamiklerin anlaşılmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Nöronal depolarizasyon sırasında sinaptik veziküllerin vital boya ile etiketlenmesi.
- Tüm presinaptik terminalleri işaretleyen bir antikor ile yapılan immünoboyama.
- Aktif ve sessiz sinapslar arasında ayrım yapmak için eş-etiketleme teknikleri.
- Aktif sinapsları görselleştirmek için FM1-43 boyasının kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Aktif sinapslar FM1-43 boyası kullanılarak görselleştirilebilir.
- İmmünoboyama, sessiz olanlar da dahil olmak üzere tüm presinaptik terminalleri ortaya çıkarır.
- Protokol, aktif ve sessiz sinapslar arasında etkili bir şekilde ayrım yapar.
- Bulgular, sinaptik plastisite ve işlevin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sonuçlar
- Geliştirilen protokol sinirbilim araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Sessiz terminallerin tanımlanması tedavi stratejilerini bilgilendirebilir.
- Bu yöntem sinaptik davranışın anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Identifying presynaptically silent synapses enables mechanistic de-risking in target validation by revealing functional heterogeneity in neuronal networks. This method supports predictive confidence in screening assays by distinguishing active from inactive glutamate release sites. It informs portfolio triage by linking synaptic plasticity mechanisms to disease-relevant systems in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying presynaptic silencing or activation states.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct visualization of vesicle release competence.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating cAMP signaling or electrical silencing with functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation using co-localization of FM1-43 FX and vGluT-1 signals.
- Quantitative Output: Enables standardized measurement of active synapse percentage via threshold-based image analysis.
- Reproducibility: Supports platform reuse through standardized fixation, staining, and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects presynaptic plasticity to hippocampal-dependent learning and memory pathways.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by monitoring synaptic adaptation to treatments.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying silent synapse populations under baseline and modulated conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a functional readout of presynaptic terminal activity prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of treatments that alter presynaptic silencing via potassium depolarization or cAMP activation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantification of glutamate release competence in dissociated hippocampal cultures.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., % FM1-43+/vGluT-1+ puncta) enabling condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling synaptic adaptation relevant to neuropsychiatric disorder mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening modulators of presynaptic function across neuronal models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct assessment of vesicle release probability.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fixed-cell imaging and co-staining protocol.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in synaptic drug effects.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on functional synaptic modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, confocal microscopy, and fluorescence image analysis.
- Needs instrumentation including laser scanning microscope with 60x oil objective and Z-stack acquisition.
- Demands cross-team standardization of staining timing, dye concentration, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for non-hippocampal neuronal systems or alternative vesicle transporters.
- Includes practical limitations such as FM1-43 FX sensitivity to ascorbic acid wash duration and blocking solution composition.
