Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Bu video, geniş alan optik mikroskobu, doğrusallaştırılmış ve kimyasal olarak modifiye edilmiş lambda ile DNA replikasyonunu görselleştirmek için bir protokolü göstermektedir. DNA, işlevselleştirilmiş bir cam kapak kızağına bağlanır. DNA'nın serbest ucu boncuk olarak etiketlenir ve DNA laminer akışla gerilir.

Replikasyon başlatıldığında, önde gelen iplik uzamaya başlar ve gecikmeli iplik kıvrılma nedeniyle kısalır. Düşük kuvvetlerde çift sarmallı ve tek sarmallı DNA arasındaki büyük uzunluk farkı, replikasyon sırasında DNA dönüşümlerinin doğrudan gözlemlenmesine izin verir. DNA yapısının uzunluğu, boncuğun konumu izlenerek izlenir, bu da DNA replikasyon hızının ve sürecinin kesin olarak belirlenmesini sağlar.

Merhaba, ben Harvard Tıp Fakültesi Biyolojik Kimya ve Moleküler Farmakoloji Bölümü'nden Anto one Vanian ve Charles Richardson Laboratuvarları'ndan Ari Ulrich. Bugün size DNA replikasyonunu tek moleküler düzeyde görüntülemek için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarlarımızda DNA sentezi sırasında meydana gelen enzimatik aktiviteleri incelemek için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım Bu prosedürün başında. Doğrusallaştırılmış bakteri fajı Lambda DNA'sı, bir replikasyon çatalı, bir lambda tamamlayıcı çatal kolu, biyotinile çatal kolu ve bir çatal astarı oluşturmak için diz çökmüş bir oligonükleotid tarafından modifiye edilir. Biyotinile çatal önkolu, DNA şablonunun akış hücresinin yüzeyine bağlanmasına izin veren beş ana ucuna bağlı bir biyotin t içerir.

Lambda DNA'sı, bir boncuğun tutturulması için yüksek afiniteli bir immün etiket görevi gören bir diggen ve parça içeren başka bir oligonükleotid olan tavlama ile daha da modifiye edilir. Replikasyon çatalını oluşturmak için, dizileri bu videoya eşlik eden yazılı protokolde bulunabilen birkaç oligonükleotidin yanı sıra lambda DNA'sı elde edin. Bu oligonükleotidler, bir biyotinile çatal kolu, bir lambda tamamlayıcı çatal kolu, bir çatal astarı ve bir lambda tamamlayıcı diggen içerir ve uç, lambda tamamlayıcı çatal kolunun beş ana ucunu ve T dört polinükleotid kinaz kullanılarak lambda tamamlayıcı digo genin ucunu fosforile eder.

Daha sonra fosforile lambda tamamlayıcı çatal kolunu, biyotinile çatal kolunu, çatal astarını ve lambda DNA'sını 10 ila 10 ila 100 ila bir molar oranında karıştırın. T dört DNA Ligaz tamponunda, karışımı beş dakika boyunca 65 santigrat derecede ısıtın ve oligonükleotidlerin ve T dört DNA ligazının karışıma uygun şekilde tavlanmasını sağlamak için ısı bloğunu kapatarak yavaşça oda sıcaklığına soğutun ve iki saat inkübe edin. Oda sıcaklığında, T dört DNA Ligas, oligonükleotidler ve lambda arasındaki çentiklerin sızdırmazlığını katalize edecektir.

DNA son olarak lambda tamamlayıcı diggenini anil eder ve fosforile lambda tamamlayıcı diggen ekleyerek DNA replikasyon şablonuna son verir ve T four Ligaz tamponu ile sonlandırın, karışımı 45 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin ve tekrar, ısı bloğunu kapatarak oda sıcaklığına yavaşça soğutun, fosforile Lambda tamamlayıcı kazma oksijenini bağlayın ve karışıma T dört DNA ligaz ekleyerek DNA replikasyon şablonuna son verin ve Oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Son DNA replikasyon şablonu artık kullanıma hazırdır. Püskülle aktive edilmiş manyetik boncukları DNA replikasyon şablonuna takmak için, digo genine özgü bir FAB fragmanı ile işlevselleştirilmeleri gerekir.

Bu işleme başlamak için, boncukların stok çözeltisini yeniden askıya alın ve 400 mikrolitreyi bir einor tüpüne aktarın. Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve çözelti temizlenene kadar inkübe edin. Ardından pipetleme ile süpernatanı çıkarın Antikor eşleşmesi için toal gruplarını aktive etmek için bir mililitre boid tampon ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın.

Yine, süpernatanı manyetik bir ayırıcı yardımıyla çıkarın. Daha sonra, 240 mikrolitre FAB parçası ekleyin ve boncukları 400 mikrolitre borat tamponunda yeniden süspanse edin. İyice karıştırın ve 37 santigrat derecede 16 ila 24 saat boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edilmesine izin verin.

İnkübasyondan sonra, manyetik ayırıcıyı kullanarak boncukları ayırın ve süpernatanı çıkarın. Boncukları bir mililitre yıkama tamponu ile yıkayın ve dört santigrat derecede beş dakika inkübe edin, manyetik ayırıcıyı kullanarak tamponu çıkarın. Bu yıkama iki kez tekrarlanır.

Serbest tosil gruplarını bloke etmek için, bir mililitre BSA içeren tris tamponu ekleyin ve 37 santigrat derecede dört saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, manyetik bir ayırıcı kullanarak tamponu boncuklardan çıkarın, tampon ve alikot ile iki kez yıkayın. Kullanım için, kopyalanacak DNA, Amil lane ile işlevselleştirilmiş cam kapak fişlerine tutturulur.

Amil şeridinin oksi grubu cama bağlanır ve biyotinile edilmiş peg moleküllerine bağlanmak için bir amin bırakır. Bu kaplama, yüzeye spesifik olmayan bağlanmayı azaltmaya yardımcı olur. Cam kapak fişlerini iyice temizlemek için, bunları boyama kavanozlarına koyun ve kavanozları etanol sonikat ile doldurun.

30 dakika boyunca kavanozları durulayın ve 30 dakika boyunca bir molar potasyum hidroksit sonikat ile doldurun ve her iki yıkamayı da tekrarlayın. İlk işlevselleştirme reaksiyonu için, tüm su izlerinin giderilmesi gerekir. Boyama kavanozlarını asetonla doldurun ve 10 dakika boyunca sonikat yapın.

Kavanozları boşaltın ve tekrar asetonla doldurun. Sinüs reaktifini kavanozlara eklemeye devam edin ve iki dakika çalkalayın. Sonra çok fazla su ile söndürün.

Daha sonra kapak fişlerini 110 derecelik fırında 30 dakika fırınlayarak kurutun. Ardından, peg karışımını hacim başına yaklaşık %0.2 ağırlıkta hazırlayın. Bir cam kapak kayma ara parçası da dahil olmak üzere biyotinillenmiş mandal, kapak kızaklarının ayrılmasına izin verecek, 100 mikrolitreyi kuru silolanmış bir kapak kızağı üzerine pipetleyecektir.

Üstüne ikinci bir kapak fişi yerleştirin. Kapak fişlerini PEG çözeltisinde üç saat inkübe edin. Daha sonra her bir kapak fişi çiftini ayırın ve suyla iyice yıkayın.

Sadece bir tarafı dübel ile kaplanacağından, kapak fişlerini çalışır durumda tutmaya dikkat edin. Son olarak, kapak fişlerini basınçlı hava ile kurutun ve vakum altında saklayın Kuruduğunda, yüzeyler en az bir ay boyunca sabit kalır. Böylece bir partide düzinelerce kapak fişi yapılabilir ve gerektiği gibi kullanılabilir.

Artık kapak fişleri hazır olduğuna göre, tek molekül deneyi için akış odası monte edilebilir. Tek molekül deneyi, işlevselleştirilmiş bir kapak kayması, çift taraflı bant, bir litre slayt ve boru ile yapılmış basit bir akış odası kullanılarak gerçekleştirilir. Her bir molekül deneyi için bir akış odası hazırlanır.

Beş mililitre bloke edici tamponu ve 20 mililitre çalışma tamponunu karıştırarak ve daha sonraki adımlar için hava kabarcıklarını gidermek için karışımı bir kurutucuya yerleştirerek başlayın. Daha sonra, 100 mikrolitre PBS'de çalışan bir strp din çözeltisini, strp din'in yüzey biyotinini bağlamasına izin vermek için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca peg işlevselleştirilmiş Kapak kaymasının yüzeyine yayın. Bu arada, kuvars slaytın boyutuna uyacak şekilde bir parça çift taraflı bant kesin, bant üzerindeki boru deliklerinin konumunu işaretleyin.

Üç milimetre genişliğinde bir merkez kanal ve her iki deliği içeren dikdörtgenler çizerek akış odasının ana hatlarını çizin. Akış odaları, iki giriş ve iki çıkış y şeklinde kanal ile tasarlanabilir. Şimdi işaretli bandı çizilen anahat boyunca kesin ve kanala hiçbir yapıştırıcı girmediğinden emin olmak için düz temiz kesimler yapın.

Önceki deneylerde kullanılan akış hücresi yapısından yapıştırıcıyı çıkarmak için kuvars slaytı aseton kullanarak iyice temizleyin. Kanal anahattının en iyi hizalamasını bulun. Yapışkan desteğin bir tarafını çıkarın ve bandı dikkatlice saha sürgüsüne yerleştirin.

Giriş ve çıkış deliklerinin engellenmemiş kalması gerektiğinden bandı düzgün bir şekilde hizalamaya dikkat edin. Ardından, akış hücresinin girişi ve çıkışı için 0,76 milimetre iç çaplı boru kesme uzunluklarını hazırlayın. Tüpün ucunu yaklaşık 30 derecelik bir açıyla kesin, böylece tüp hazne tabanına düz bir şekilde bastırmaz.

Sonraki adımlarda akış hücresine kolay bağlantı için hortumu test tüpü raflarına asın. Şimdiye kadar, kapak kayma inkübasyonu bitmiş olmalıdır. Kapağı durulayın, suyla iyice kaydırın ve basınçlı hava kullanarak kurulayın.

Mandal ile yalnızca bir tarafı işlevsel hale getirildiği için kapak kızağını ters çevirmemeye dikkat edin. Bant desteğinin diğer tarafını çıkararak ve kuvars sürgüyü kapak kızağına yerleştirerek akış odasının montajını tamamlayın Yapıştırıcıda sıkışan havayı dışarı itmek için kapak kızağına hafifçe bastırın. Bu, herhangi bir hava kabarcığının akış kanalına girmesini önlemeye yardımcı olacaktır.

Haznenin kenarlarını epoksi ile kapatın. Kesilen boruyu kuvarsın deliklerine yerleştirin ve epoksi ile yerine kapatın. Birkaç dakika kurumaya bırakın.

Kuruduktan sonra, hazne yüzeyini tıkamak için DGA'ların bloke edici tamponunun bir kısmını tüplerden birinden çekmek için 21 gauge bir iğne kullanın. Hava kabarcıklarını gidermek için birkaç kez yıkayın ve tek molekül replikasyon deneyine geçmeden önce haznenin en az 30 dakika inkübe etmesine izin verin. DNA şablonu işlevselleştirilmiş boncuklar ve akış odası hazırlandıktan sonra, tek bir molekül deneyi gerçekleştirilebilir.

Başlamak için, akış hücresini mikroskop aşamasına yerleştirin. Hazneyi sahne klipsleri ile yerinde tutun ve akış kanalının CCD kamera ile aynı hizada konumlandırıldığından emin olun. Şırınga pompasına ve akış hücresinin çıkış borularına önceden yapılmış hava yayına bağlayın.

Daha büyük çaplı bağlantı boruları kullanarak, akış hücresinin giriş tüplerini bloke edici tampona yerleştirin ve tüplerdeki hava kabarcıklarını gidermek için şırıngayı geri çekin, akış hücresinde sıkışan hava kabarcıklarını temizlemek için çıkış tüplerini hafifçe vurun. Tüm hava kabarcıkları çıkarıldıktan sonra, giriş tüplerinden birini bir iğne ile tıkayın ve çıkış tüplerinden birini 180 derece bükerek ve yapışkan bantla sabitleyerek kapatın Hücreye DNA eklemeden önce, stok DNA şablonunu bir mililitre DGA'da 10 pikomolar olacak şekilde seyreltin bir x bloke edici tampon. DNA'nın iyi bir yüzey kaplamasına izin vermek için şablonu orta düzeyde bir akış hızında odaya akıtan.

Stok boncuk çözeltisini mililitre başına altıncı boncukların iki ila dört katı 10 arasında seyreltin. Bir mililitre DGA'da bir x engelleme tamponu. Sonra karışımı girdap haline getirin ve 20 saniye boyunca sonikat yapın.

Seyreltilmiş boncuk çözeltisini hazneye akıtın. Boncuklar eklendikten sonra akışı kapatın ve haznenin dengeye ulaşmasına izin verin. Ardından her iki çıkış borusunu da kapatın.

Hazne kapatılmadan tüplerde yapılacak herhangi bir değişiklik, boncuklar üzerinde güçlü bir kuvvet uygulayacak ve bağlı DNA moleküllerini kesecek basınç dalgalanmalarına neden olacaktır. İkinci giriş borusunu kullanarak boncukları yüklemek için kullanılan giriş borusunu bir iğne ile tıkayın. Akış hücresini DGA'nın bir x bloke edici tampon yıkama solüsyonu ile yıkamaya başlayın.

Kontrol etmek için yüzeye özel olarak yapışmamış boncukları çıkarmak için dokunarak sahneyi çalkalayın. Boncuklar DNA'ya bağlıdır. Akışın yönünü değiştirmeyi deneyin.

Serbest boncuklar yeterince çıkarıldıktan sonra, akışı kapatın ve haznenin dengeye ulaşmasına izin verin. Metin protokolünde belirtildiği gibi replikasyon proteinleri içeren taze reaksiyon karışımı hazırlayın. Açık çıkış borusunu kapatın ve giriş haznesini yeni hazırlanmış reaksiyon karışımına geçirin.

Enzimatik reaksiyona devam etmek için hızlı basınç değişikliklerinden kaçınmak için çıkışı yavaşça açın. İlk olarak, DNA'ya verimli bir şekilde bağlanmayı sağlamak için protein çözeltisini ılımlı bir akış hızında odaya akıtan. Akışı kapatın ve odanın dengeye ulaşmasına izin verin.

Çıkış tüplerini kapatın ve reaksiyon karışımını içeren tüpü değiştirin. DGA'nın yıkama tamponundan oluşan tüp ile, yıkamadan sonra serbest proteinleri çıkarmak için hazneyi yıkayın. Yine, akışı kapatın ve odanın dengeye ulaşmasına izin verin.

Çıkış borularını kapatın ve yıkama tamponu içeren boruyu değiştirin. T yedi replikasyon tamponunu içeren tüp ile T yedi replikasyon tamponu, replikasyon reaksiyonunun başlamasını tetikleyen magnezyum klorür içerir. Bu protokolde açıklanan koşulları kullanarak DNA bağları üzerindeki üç pico Newin sürükleme kuvvetine karşılık gelen dakikada 0.012 mililitrelik bir akış hızı kullanın.

Boncuklar ve yüzey arasındaki spesifik olmayan etkileşimleri önlemek için görüntülemeden önce akış hücresinin üzerine nadir bir toprak kalıcı mıknatısı yerleştirin. 10 x objektif ve CCD kamera ile mikroskop görüş alanının yakınına 10 derece arasında ve mikroskop aşamasına paralel bir geliş açısında bir fiber aydınlatıcı yerleştirin. Karanlık alan aydınlatması, bağlı bir boncuk kullanarak boncuk görüntüleme odağındaki kontrastı artırmak için kullanılır.

Yavaş bir kare hızında 20 ila 30 dakika boyunca veri toplamaya başlayın. Başarılı bir deneyde, aynı anda 100 boncuk gözlemlenebilir. Deney, önde gelen iplikçik DNA sentezini gösteren çok sayıda iz vermelidir.

DNA çözülme ve polimerizasyonunun hızlarını ve işlenmesini ölçmek için, bunu başarmak için boncukların kesin konumları belirlenmelidir. Bu konumları iki boyutlu Gauss fonksiyonlarıyla eşleştirin. İzleme yazılımı kullanarak her karedeki boncuk konumunu izleyerek yörüngeyi görselleştirin.

Ardından, oran verilerini elde etmek için herhangi bir grafik yazılımı kullanarak boncuk konumunu zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. Grafikleri doğrusal bir regresyon ile sığdırın ve işlemsel için eğimi hesaplayın. Bir kısalma olayının başından sonuna kadar DNA'nın toplam uzunluğunu belirleyin.

Tüm tekli ölçümleri birleştirin ve sırasıyla Gauss ve tek üstel fonksiyonları kullanarak verileri eşleştirin, hız ve üretkenlik dağılımlarını çizin. Size az önce DNA replikasyonunun hızlarını ve sürecini tek bir molekül seviyesinde nasıl ölçeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken, lamina akışının kuvvetinin ve belirli bahislerinin, replikasyon proteinlerinin enzimatik aktivitelerini etkilemediğinden emin olmak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi eğlenceler.