Name: Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 3 s
Description: Öğrenin, geniş alan optik mikroskopi kullanarak tek molekül düzeyinde DNA replikasyonunu gerçek zamanlı gözlemleme yöntemini. Lambda DNA ve boncuk etiketleme ile replikasyon dinamiklerini doğrudan izleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Paul Blainey, Jong-Bong Lee ve Samir Hamdan uzanan DNA testinin geliştirilmesi yardımıyla oldu. Bu çalışma, Charles Richardson (GM54397) ve Antoine van Oijen (GM077248) Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.

1. DNA replikasyonu Şablonu Reaksiyon için DNA replikasyon çatal oluşturmak için oligonükleotidler tavlama tarafından değiştirilmiş Lineerleştirilmiş λ DNA. Ayrıca, biotin λ DNA iplikçik sonuna kadar bağlı olduğu ve bir digoxigenin benzer parçaları aynı iplikçik 1 diğer ucuna takılı. Malzemeler: bakteriyofaj λ DNA Oligonükleotidler: biotinlenmiş çatal kol (A: 5'-biotin-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3 '), λ-tamamlayıcı çatal kol (B: 5'-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA-3'), çatal astar (C: 5 ' -TGCCATATCTGAAATCCTCCCTGC-3 '), λ-tamamlayıcı digoxigenin sonunda (D: 5'-AGGTCG CCGCCCAAAAAAAAAAAA digoxigenin-3'), T4 DNA ligaz, T4 polinükleotid kinaz, Isı bloğu. <ol><li> T4 Polinükleotid Kinaz kullanarak, B ve D oligonükleotidler 5 'uçları Phosphorylate. </li><li> A ve B oligonükleotidler 10 kat daha fazla ve T4 DNA ligaz tamponu oligonükleotid C 100 kat daha fazla ekleyerek bir adım λ DNA oligonükleotidler A, B, ve C Tavlama. </li><li> 65 ° C ısı bloğu karışımı ısıtın. Isıtmalı, ısı bloğu kapatın ve düzgün oligonükleotidler tavlama yavaş soğutma izin. </li><li> T4 DNA ligaz karışıma ekleyin ve 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. T4 DNA ligaz oligonükleotidler A ve B, ve λ DNA doğru birleştirilmesi katalize. </li><li> Son olarak, T4 DNA ligaz tamponu l DNA saygı oligonükleotid D 100 kat daha fazla ekleyerek DNA replikasyonu şablonu oligonükleotid D tavlama. </li><li> 45 ° C 30 dakika, ısıtma bloğu ve oda sıcaklığına kadar soğumasını yavaş ısıtma bloğu kapatarak karışımı inkübe edin. </li><li> Son DNA replikasyonu şablonu artık kullanıma hazır. Biz 4 1.4 nM konsantrasyonda şablonu depolamak ° C'de birkaç hafta boyunca. </li></ol> 2. Boncuk Boncuk digoxigenin özgüllüğü ile Fab parçası Fonksiyonlu. Daha sonra DNA replikasyonu şablon 2 eklenebilir. Malzemeler: Tosyl aktif boncuk, α-digoxigenin Fab parçası, A Buffer: 0,1 M H3BO3 pH 9.5, Tampon B: 0,1 M PBS pH 7.4,% 0.1 w / v BSA, Tampon C: 0.2 M Tris-HCl, pH 8.5 (25 ° C),% 0.1 w / v BSA, Manyetik Ayırıcı, Rotator. <ol><li> Boncuk stok solüsyonu süspanse edin ve Eppendorf tüp içine küçük bir kısım aktarmak. Tüp çözüm temizler kadar manyetik ayırıcı ve inkübe bir yuvaya yerleştirin, sonra pipetleme tarafından süpernatant kaldırmak. </li><li> Tosyl antikor kaplin grupları etkinleştirmek hangi bir tampon ekleyin. Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın ve manyetik ayırıcı ile tampon kaldırmak. </li><li> Tampon A, tekrar Fab parçası ve tekrar süspansiyon boncuk ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C kullanarak rotator 16-24 saat inkübe edin. Inkübasyondan sonra, ayrı boncuk manyetik ayırıcı ve tampon kaldırmak. </li><li> 5 dakika boyunca tampon B ve 4 ° C'de inkübe ekleyerek boncuk yıkayın. Manyetik ayırıcı kullanarak tampon çıkarın. Yıkama iki kez tekrarlayın. </li><li> Ücretsiz tosyl grupları engellemek için 4 saat süreyle inkübe ° C 37 ° tampon C ve ekleyin. Ayrı boncuk manyetik ayırıcı ve tampon çıkarın. </li><li> Tampon B ve kullanmak için kısım iki kez yıkayın. Boncuk 4 saklanabilir ° C için önemli kalite kaybı (bizim stok solüsyonu içeren 1 - 2x10 9 boncuk / ml) olmadan en az 1 yıl veya daha uzun. </li></ol> 3. Fonksiyonlu lameller DNA cam lamel ek izin vermek için, cam, daha sonra biotinlenmiş PEG moleküllere birleştiğinde bir aminosilane, ilk işlevselleştirildiyse. Bu kaplama yüzeyi 3,4 ile non-spesifik etkileşimler, DNA ve çoğaltma proteinler azaltmaya yardımcı olur . Malzemeler: Cam lamelleri, Boyama kavanoz, 3-aminopropyltriethoxysilane, metoksi-PEG5k-NHS ester, Biotin-PEG5k-NHSester, Aseton, 1M KOH, Etanol, Fırın, Banyo sonikatör <ol><li> Cam kavanoz boyama ve etanol ile kavanoz dolum onları yerleştirerek lamelleri iyice temizleyin. Kavanoz yıkayın ve 1 M KOH ile doldurun, 30 dakika boyunca sonikasyon. Hem yıkar tekrarlayın. </li><li> Ilk işlevsellik tepki için, tüm su izlerini kaldırılması gerekir. 10 dakika aseton ve sonikasyon kavanozları doldurun. Aseton ile boşaltın ve yeniden doldurun. </li><li> 2% v / v aseton silan reaktif bir çözüm hazırlayın. Boyama kavanoz ekleyin ve 2 dakika boyunca ajitasyon. Bu reaksiyon çiftler cam aminosilane alkoksi grup, bir sonraki kaplin adım için bir reaktif amin bırakarak. Büyük bir su fazlalığı ile reaksiyon Quench. </li><li> 110 pişirme lamelleri Kuru °; C fırında 30 dakika. </li><li> 100 mM NaHCO 3 pH 8.2 50:1 metoksi: biotin PEG karışımı hazırlayın. Amaç yaklaşık% 0.2 w / v biotinlenmiş PEG. </li><li> Pipet 100 mcL kuru Silanlanmış lamel ve yer üstünde başka bir lamel üzerine PEG karışımı. Bir cam lamel spacer dahil lamelleri ayrılması sağlayacaktır. </li><li> 3 saat PEG çözüm lamelleri inkübe edin, sonra her çift lamelleri ayrı ve suyla iyice yıkayın. Sadece bir kez yan PEG ile kaplı olacak gibi lamelleri yan Fonksiyonlu tutmak için dikkatli olun. </li><li> Lamelleri desikatöre vakum altında ve hava deposu ile kurulayın. Yüzeyler en az ayda bir sabit kalır, bu yüzden onlarca lamelleri bir toplu yapılan ve gerektiği gibi kullanılabilir. </li></ol> 4. Akış Odası Hazırlık Deney Fonksiyonlu lamel, çift taraflı bant, kuvars slayt ve boru ile yapılan basit bir akış odası kullanılarak yapılır. Bir akış odasının her biri tek-molekül deney 2,4 için hazırlanmıştır . Malzemeler: Çift taraflı bant, jilet, boru, çabuk kuruyan, epoksi delikli kuvars slayt, işlevselleştirildiyse lamel, streptavidin çözümü (1 mg / mL PBS içinde 25 mcL), boru, engelleme tampon (5X: 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.2 mg / ml BSA,% 0.005 Tween-20), çalışma tampon (1X: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl). <ol><li> Karıştırma ve engelleme tampon ve sonraki adımlar için herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için bir desikatöre tampon çalışma 20 ml 5 ml koyarak başlayın. </li><li> PEG-Fonksiyonlu lamel alın ve PBS-seyreltilmiş streptavidin çözüm yüzey üzerinde 125 yayıldı. Streptavidin yüzey biotins bağlamak için izin vererek, odanın diğer bölümlerine hazırlarken oda sıcaklığında 20 dakika inkübe bırakın. </li><li> Kuvars slayt boyutuna uyacak şekilde çift taraflı bant bir parça kesin. Akış odasının bir taslak bant çizilebilir, böylece bant boru delik konumunu işaretleyin. </li><li> 3 mm çapında bir merkez kanal ve iki delik içeren dikdörtgenler olun. Biz iki giriş ve iki çıkış Y-şekilli kanal akışı odaları kullanın. </li><li> Kanal içine herhangi bir yapışkan çıkıntı emin olmak için düz ve temiz kesim, çizilen taslak boyunca kesin. </li><li> Kuvars iyice kullanarak aseton veya etanol önceki akış hücresi inşaat yapıştırıcı çıkarmak için temizleyin. </li><li> Kanal anahat iyi hizalama, bir tarafı yapışkanlı arka kaldırmak ve kuvars slayt üzerine bandı dikkatlice yerleştirin. Giriş ve çıkış delikleri unblocked kalmaya ihtiyacı gibi, bant düzgün hizalamak için dikkatli olun. </li><li> Akış hücresi giriş ve çıkış boru uzunlukları kesin. Bu tüp odası dibine düz basın böylece ilgili bir 30 ° açı tüp sonuna kesmek için yardımcı olur. Sonraki adımlar akış hücresi kolay eki için askıya destek (örneğin tüp rafları) bir çeşit tüpler yerleştirin. </li><li> Streptavidin kaplı lamel su ile iyice durulayın ve basınçlı hava kullanarak kurutun. Sadece bir tarafı Fonksiyonlu olduğunu unutmayın. Teyp yedekleme diğer tarafına çıkartın ve kuvars slayt lamel üzerine yerleştirin. </li><li> Yapıştırıcı sıkışıp herhangi bir hava hafifçe dışarı itmek için lamel basın. Bu akış kanalı içine almak herhangi bir hava kabarcıkları önlemeye yardımcı olacaktır. </li><li> Epoksi ile odasının yanında Seal. Kesilmiş boru epoksi ile kuvars ve mühür deliklere yerleştirin. Bu, birkaç dakika kurumasını gerekiyor. </li><li> Kuruduktan sonra, bazı gazlar engelleme tampon tüplerinden biri aracılığıyla çekerek yüzey engelleme başlar. 21-gauge iğne, 0,76 mm boru içinde mükemmel uyum sağlar. Hava kabarcıklarını çıkarmak için birkaç kez yıkayın ve odasının en az yarım saat süreyle inkübe izin. </li></ol> 5. Tek molekül Çoğaltma Deney DNA şablonu ve Fonksiyonlu boncuk hazırlanan ve akış odasının hazır var, tek bir molekülün deney yapılabilir. Malzemeler: Hazır akış odası, Engelleme tamponu (5X: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1 mg / ml BSA,% 0.025 'Tween-20), Çalışma tamponu (1X: 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl), T7 çoğaltma tamponlar veya 10mM MgCl 2 olmadan (1X: 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM K-glutamat, 2 mM EDTA, 100 mg / ml BSA, 10 mM DTT, 600 mcM dNTP), çoğaltma proteinleri, 10X amacı, CCD kamera, kalıcı nadir toprak mıknatısı, şırınga pompası, airspring, fiber aydınlatma, bilgisayar görüntü elde etme yazılımı ile ters optik mikroskop. <ol><li> Akış hücresi bloke edildikten sonra, denemeyi başlatmak için hazır. </li><li> Akış hücresi ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin. Sahne klipler ile oda tutunve akış kanal CCD kamera ile uyum içinde yerleştirilmiş olduğundan emin olun. </li><li> Akış hücresi çıkış tüpleri, daha büyük çaplı bir konnektör boru veya bir iğne kullanarak airspring bağlayın. Airspring herhangi bir akım düzensizliklerini stabilize etmek için kullanılır. 50 ml plastik tüp 45ml su ile dolu. Epoksi ile tüp kapağı kapatılır. Üç delikler kapak delinmiş ve üç adet tüp tüp içine yerleştirilir. Epoksi kullanarak, tüpleri sonra girerek veya kaçan herhangi bir hava önlenmesi, kapağı mühürlenir. Airspring şırınga pompa ve akış hücresi çıkışına tüpler bağlıdır. </li><li> Yerleştirin ve tampon engelleme akışını hücrenin giriş tüpleri, tüp içindeki herhangi bir havayı çıkarmak için şırınga geri çekin. Çıkış borusunun nazik bir fiske akış hücresi sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcığı temizlenmesine yardımcı olacaktır. </li><li> Tüm hava kabarcıkları kaldırıldı, bir iğne ile giriş tüpleri biri olan ve 1800 ile bükme ve tüp yapışkan bant ile güvence çıkış tüpleri bir blok. </li><li> 10:00 gazlar engelleme tampon 1 ml stok DNA şablonu sulandırınız. DNA (20 dakika ,01-0,05 ml / dak iyi çalışır) iyi yüzey kapsama sağlamak için orta akış hızında odasına Akış. Bu lamelleri her parti için yüzeyde ya da deney için kaç istenilen kaç DNA molekülleri dayalı çeşitli olabilir. </li><li> 2-4x10 6 boncuk / ml 1 ml gazlar engelleme tampon stok boncuk çözüm sulandırınız. 0,01-0,05 ml / dk 15 dakika odasına Akış. </li><li> Boncuk eklendi akışı kapatın ve odasına dengeye ulaşması için izin. Sonra her iki çıkış tüpleri kapatın. Kabinsiz tüpler herhangi bir değişiklik, boncuk ve kesme gergin DNA molekülleri üzerinde güçlü bir kuvvet uygularlar basınç dalgalanmalara neden kapattı. </li><li> Bir iğne ile boncuk yüklemek için kullanılan giriş tüp blok ve akış hücresi, çalışma tampon engelleme tampon gazlar 1X çözümü ile ikinci giriş kullanarak yıkama başlamak. 0,01-0,05 ml / dak hızında iyice yıkayın. Nonspecifically yüzey (yapışmış herhangi bir boncuk kaldırmak için dokunarak sahne elle <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/Tapping.avi">dokunulduğunda</a> çalkalayın ). </li><li> Ücretsiz boncuk yeterince kaldırıldıktan sonra, akış kapatın ve odasına dengeye ulaşması için izin. Kapatın ve açık çıkış borusunun giriş haznesi protein solüsyonu geçiş, yavaş yavaş, hızlı basınç değişiklikleri önlemek için çıkış açılış </li><li> Boncuklar, akış yönünü (değiştirerek DNA gergin olup olmadığını kontrol <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/DNA.avi">edebilirsiniz DNA</a> ) . </li><li> Şimdi, enzimatik reaksiyon yapılabilir. Önde gelen iplikçik sentez deneyleri GP4 helikaz ve MgCl 2 içermez gazlar T7 çoğaltma tampon GP5 polimeraz (processivity faktör tiyoredoksin ile bir kompleks olarak arıtılmış) 20nm çözüm, 20nm çözüm olun . </li><li> DNA verimli bağlama izin orta akış hızında odasına protein çözüm Akış. 0.037 ml / dk 8 dakika sonra 0.012 ml / dk 7 dakika. </li><li> MgCl 2 olmadan gazlar T7 çoğaltma tamponu ile serbest proteinler kaldırmak için odasına yıkayın. 0.037 ml / dk 3-10 dakika oranı gayet iyi çalışıyor. </li><li> Yıkadıktan sonra, akış T7 çoğaltma MgCl 2 ile tampon ve veri toplama başlar. 0.012 ml / dak bu protokolde belirtilen koşullar altında DNA hayvan iplerini 3 pN sürtünme kuvveti uygun bir akış hızını kullanın. </li><li> Görüntüleme nonspesifik boncuk ve yüzey arasındaki etkileşimleri önlemek için önce bir akış hücresi üzerinde nadir toprak kalıcı mıknatıs yerleştirin. </li><li> 10X objektif ve CCD kamera ile saha. Gergin bir boncuk kullanarak odaklanın. </li><li> Bir fiber ışığı 10 derece ve mikroskop yakın mikroskop aşamasına paralel arasındaki insidansı açıyla yerleştirin. Karanlık alan aydınlatma boncuk görüntülemede kontrast arttırmak için kullanılır. </li><li> 20 30 dakika süreyle yavaş bir kare hızı (genellikle 2-4 Hz) veri almak. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Başarılı bir deneyde (aynı anda 100'den fazla boncuklar gözlemlemek <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1689/Leading_strand_synthesis.avi">gerekir Lider iplikçik</a> sentez) . Deney önde gelen iplikli DNA sentezini gösteren sayısız izlerini boyun eğmek zorundadır. Veri Analizi: DNA ve polimerizasyon gevşemek oranları ve processivities ölçmek için, boncuk kesin pozisyonları tespit edilmelidir. 2-boyutlu Gauss fonksiyonları ile bu pozisyonları takarak elde edebilirsiniz. Yörüngeler sonra izleme yazılımı (örneğin DiaTrack) kullanarak her bir karenin izleme boncuk pozisyonu ile elde edilebilir. Şimdi, böylece herhangi bir grafik kullanarak zamanın bir fonksiyonu olarak boncuk pozisyonu komplo ile yörüngeleri görselleştirmek için hazırızFtware (örneğin Kökeni). Oran veri elde etmek için, lineer regresyon ile araziler uyum ve eğimi hesaplamak. Processivity için, başından sonuna kadar bir kısalma olay (Şekil 3) DNA toplam uzunluğu belirler. Her ikisi de bu sayıların basepairs dönüştürülebilir gerekecektir. Basepairs için boncuk hareket dönüştürmek için, ilk reaksiyon debisi uzatılmış λ DNA molekülünün uzunluğunu ölçmek gerekir. Λ DNA uzunluğu (48.502 bp) bilindiğinden deneysel gücü az sayıda baz çifti / piksel kalibre edebilir. Artan doğruluğu için bir temel eser ilgi enzimatik değişmez bir boncuk sabrının izlerini çıkarmak. Tüm tek ölçüm ve çizim hızı ve processivity dağıtımları birleştirin. Gauss ve tek üstel fonksiyonlar, sırasıyla (Şekil 3) kullanarak veri sığdır. <img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Tek molekül deney düzeneği. (A) Dubleks λ DNA (48.5 kb) 5 üzerinden akışını hücrenin yüzeyine bağlı 'biotin streptavidin etkileşimi kullanarak bir iplikçik sonu ve 3' aynı iplikçik sonu kullanarak bir boncuk eklenir digoxigenin anti-digoxigenin etkileşim. Astarlanmalıdır çoğaltma çatal polimeraz yükleme izin boncuk karşısında sonunda oluşur. (B) Boncuk-DNA meclisleri laminer akış tampon kullanarak gergin ve geniş alan optik mikroskop kullanarak görüntülü. Sürekli bir germe kuvveti korurken, zamanla boncuk pozisyonları takip ederek, DNA yapıları uzunlukları izlenebilir. (C) düşük kuvvetler altında Uzantısı ssDNA profili (dolu daire) ve dsDNA (açık daire). Kesikli çizgi kristalografik tam ds-λ DNA uzunluğu, 16.3 mm gösterir. SsDNA ve dsDNA arasındaki uzunluğu 3 pN etrafında güçlerine büyük bir fark DNA uzunluğu izleme değişiklikleri ss ve dsDNA arasındaki dönüşümlerin doğrudan gözlem sağlar. DNA birleştiğinde boncuklar çok sayıda eş zamanlı görselleştirme, bir deney birçok bireysel replisomes çalışması için olanak sağlar. <img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 bakteriyofaj T7 çoğaltma proteinler: DNA polimeraz (GP5 ve tiyoredoksin kompleks) ve DNA helikaz (GP4) deoxyribonucleotides ve magnezyum varlığında DNA lideri iplikçik sentez. Bu süreç, kıvrılma için DNA gecikmeli iplikçik kısaltılması ile eşlik ediyor. DsDNA boncuk ssDNA pozisyon değiştirir haline dönüştürülmesi. Boncuk pozisyon ölçme DNA replikasyon hızı ve processivity hassas tayini sağlar. <img src="/files/ftp_upload/1689/1689fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 tipik bir veri tek bir molekül önde gelen iplikçik sentez deney örneği. DNA replikasyonu Processivity bir kısalma olayı başından sonuna kadar DNA toplam uzunluğu eşittir. DNA replikasyon oranı lineer regresyon arsa montaj ve eğimin hesaplanması ile elde edilir. Ölçümlerin bir dizi veri birleştirerek elde edildi içerlek gösterir oranı ve processivity dağılımları. Veriler sırasıyla, Gauss ve tek üstel fonksiyonlar kullanarak monte edildi.

<ol><li>Lee, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primase+acts+as+a+molecular+brake+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication.</a> Nature. 439, 621-624 (2006).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+Grafted+to+Silicon+Surfaces%3A+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+of+lambda+exonuclease+reveal+base+dependence+and+dynamic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
</ol>

Laminer akış boncuklar üzerinde uyguladığı sürtünme kuvveti çoğaltma proteinler enzimatik faaliyetlerin etkisi olmadığından emin olmak için çok önemlidir. Örneğin, 0.012 ml / dk akış oranına karşılık gelen 3 pN gücü önde gelen iplikçik DNA replikasyon etkilemez. Ancak enzimatik faaliyetleri koordine DNA sentezi sırasında yer alan etkilemez ve bu nedenle 1.5 pN azaltılmalıdır. Sürtünme kuvveti kolayca akış hızını veya akış kanalı 5 genişliği değiştirerek kontrol edilebilir. DNA tes...

<table><tbody><tr><td>Bakteriyofaj &amp;#955; DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N3011L</td><td></td></tr><tr><td>DNA Oligonükleotidleri</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-digoksigenin Fab</td><td>Roche Grubu</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>Tosill Aktive Boncuklar</td><td>Invitrogen</td><td>142-03</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Ayırıcı</td><td>Invitrogen</td><td>Dynal MPC</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropil-trietoksisilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>Daha seyrek yüzeyler elde etmek için diğer aminosilanlar kullanılabilir veya amin reaktif olmayan silanlarla karıştırılabilir.</td></tr><tr><td>Suksinimidil propionat PEG</td><td>Nektar</td><td></td><td>Benzer PEG'ler Nanocs, CreativePEGWorks vb. şirketlerden satın alınabilir.</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-NHS</td><td>Nektar</td><td></td><td>Benzer PEG'ler Nanocs, CreativePEGWorks vb. şirketlerden satın alınabilir.</td></tr><tr><td>Çift taraflı bant</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>SA-S-1L</td><td>100 &amp;#x03BC;m kalınlığı</td></tr><tr><td>Kuvars lam</td><td>Teknik Cam</td><td>20 mm (G)x 50 mm (U)x 1 mm (Y)</td><td>Lameller üzerine sığacak boyutta kesin. Elmas uçlu matkap uçları (DiamondBurs.net) ile delikler açın.</td></tr><tr><td>Polietilen boru</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>0,76 mm iç çap, 1,22 dış çap&lt;br/&gt;Farklı boyutlarda borular da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td>1 mg/mL konsantrasyonunda çözelti hazırlayın, 25 &amp;#x03BC;PBS pH 7,3 içinde L miktarlı alikotlar</td></tr><tr><td>Deoksiribonükleotit trifosfat çözelti karışımı</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>10X Objektifli İnvert Optik Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>Olympus IX-51</td><td></td></tr><tr><td>Kalıcı nadir toprak mıknatısı</td><td>Ulusal İthalatlar</td><td>www.rare-earth-magnets.com</td><td></td></tr><tr><td>CCD Kamera</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Fast 139</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Pompası</td><td>Harvard Apparatus</td><td>11 Artı</td><td>Çözelti değişimlerini kolaylaştırmak için doldurma modunda çalıştırın</td></tr><tr><td>Fiber Aydınlatıcı</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>OSL1</td><td></td></tr></tbody></table>

enzimlerin klonlanması dna doğrudan gözlem tek bir molekülü dna testi esneme

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Lineerleştirilmiş λ DNA bir iplikçik sonunda bir biotin, ve aynı iplikli diğer ucunu bir digoxigenin benzer parçaları değiştirilir. Biotinlenmiş sonuna Fonksiyonlu cam lamel ve küçük bir boncuk digoxigeninated sonuna eklenir. Bir akış hücre yüzeyinde bu DNA boncuk hayvan iplerini montaj, laminer akış, boncuk üzerinde sürükleyin kuvvet uygularlar uygulanmasına olanak veriyor. Sonuç olarak, DNA ve paralel akış hızı (Şekil 1) tarafından belirlenen bir kuvvet lamel yüzeye yakın gerilir. DNA uzunluğu boncuk pozisyonunun izlenmesi ile ölçülür. Tek ve çift iplikli DNA arasındaki uzunluk farklılıkları çatal çoğaltma proteinlerin aktivitesini gerçek zamanlı bilgi elde etmek için kullanılmaktadır. Boncuk pozisyon ölçme gevşemek DNA ve polimerizasyon (Şekil 2) oranları ve processivities hassas belirliyor.

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Bakteriyofaj replikasyon sistemi proteinleri aracılığıyla gerçekleşen tekil DNA moleküllerinin gerçek zamanlı replikasyonunu gözlemlemek için bir yöntem tanımlıyoruz. ...

Bu video, lineerleştirilmiş ve kimyasal olarak modifiye edilmiş lambda DNA'sının geniş alanlı optik mikroskopi ile DNA replikasyonunun görselleştirilmesine yönelik bir protokolü göstermektedir. DNA, fonksiyonelleştirilmiş bir cam lam üzerine tutturulur. DNA'nın serbest ucu boncuklarla işaretlenir ve DNA, laminer akış ile gerilir.Replikasyon başladığında, öncü zincir uzamaya başlar ve gecikmeli zincir kıvrılma nedeniyle kısalır. Düşük kuvvetlerde çift zincirli ve tek zincirli DNA arasındaki uzunluk farkının belirgin olması, replikasyon sırasında DNA dönüşümlerinin doğrudan gözlemlenmesine olanak tanır. DNA konstrüktünün uzunluğu, boncuğun konumunun takip edilmesiyle izlenir ve bu sayede DNA replikasyonunun hızı ve süreci hassas bir şekilde belirlenebilir.Merhaba, ben Harvard Tıp Fakültesi Biyolojik Kimya ve Moleküler Farmakoloji Bölümü'ndeki Anto one Vanian ve Charles Richardson laboratuvarlarından Ari Ulrich. Bugün size tek moleküler düzeyde DNA replikasyonunun görüntülenmesine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarlarımızda bu prosedürü, DNA sentezi sırasında gerçekleşen enzimatik aktiviteleri incelemek için kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Bu prosedürün başında, doğrusallaştırılmış bakteri faji Lambda DNA'sı, bir replikasyon çatalı, bir lambda tamamlayıcı çatal kolu, biyotinillenmiş bir çatal kolu ve bir çatal primeri oluşturmak için dizileyici oligonükleotidler ile modifiye edilir. Biyotinillenmiş çatal ön kolu, 5' ucuna bağlı bir biyotin içerir; bu da DNA kalıbının akış hücresi yüzeyine sabitlenmesine olanak tanır.Lambda DNA, bir boncuk bağlanması için yüksek afiniteli bir immünotag görevi gören bir diggen ve moyetisi içeren başka bir oligonükleotidin tavlanmasıyla daha da modifiye edilir. Replikasyon çatalını oluşturmak için, dizileri bu videoya eşlik eden yazılı protokolde bulunan birkaç oligonükleotidin yanı sıra lambda DNA temin edin. Bu oligonükleotidler; biyotinlenmiş bir çatal kolu, bir lambda tamamlayıcı çatal kolu, bir çatal primeri ve bir lambda tamamlayıcı diggen ve ucunu içerir; lambda tamamlayıcı çatal kolunun ve lambda tamamlayıcı digogen ucunun beş prime uçlarını T4 polinükleotid kinaz kullanarak fosforile edin.Ardından, fosforile edilmiş lambda tamamlayıcı çatal kolunu, biyotinile edilmiş çatal kolunu, çatal primerini ve lambda DNA'sını 10'a 10'a 100'e 1 molar oranında karıştırın. T4 DNA Ligaz tamponunda, oligonucleotidlerin ve T4 DNA ligazın karışıma uygun şekilde bağlanmasını sağlamak için karışımı 65 °C'de beş dakika boyunca ısıtın ve ısıtma bloğunu kapatarak oda sıcaklığına yavaşça soğutun, ardından iki saat boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında T4 DNA Ligaz, oligonucleotidler ile lambda arasındaki çentiklerin kapatılmasını katalize edecektir.Son olarak, fosforile edilmiş lambda komplemanter digogenin ucunu T4 Ligaz tamponu içerisinde DNA replikasyon kalıbına ekleyerek DNA'yı anilleyin; karışımı 45 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından ısıtıcı bloğu kapatarak oda sıcaklığına yavaşça soğutun. Karışıma T4 DNA ligaz ekleyerek fosforile edilmiş lambda komplemanter digogenin ucunu DNA replikasyon kalıbına ligeyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Nihai DNA replikasyon kalıbı artık kullanıma hazırdır. Tassell aktive edilmiş manyetik boncukların DNA replikasyon kalıbına bağlanabilmesi için, bu boncukların digogenine özgü bir FAB fragmanı ile fonksiyonelleştirilmeleri gerekir.Bu işleme başlamak için, boncukların stok çözeltisini yeniden süspande edin ve 400 microliterini bir einor tüpüne aktarın. Tüpü bir manyetik separatöre yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar inkübe edin. Ardından, süpernatantı pipetleme yoluyla uzaklaştırın. Antikor bağlama için toal gruplarını aktive etmek amacıyla bir milliliter boid tamponu ekleyin ve pipetleyerek nazikçe karıştırın.Süpernatanı tekrar manyetik ayırıcı yardımıyla uzaklaştırın. Ardından, 240 µL FAB fragmanı ekleyin ve boncukları 400 µL borat tamponu içinde yeniden süspande edin. İyice karıştırın ve bir rotatör üzerinde 37 °C'de 16 ila 24 saat boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, boncukları manyetik ayırıcı kullanarak ayırın ve süpernatantı uzaklaştırın. Boncukları bir mililitre yıkama tamponu ile yıkayın ve dört derece santigrat sıcaklıkta beş dakika inkübe edin, ardından tamponu manyetik ayırıcı kullanarak uzaklaştırın. Bu yıkama işlemi iki kez tekrarlanır.Serbest tosyl gruplarını bloke etmek için, tris tamponu içeren bir mililitre BSA ekleyin ve 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, manyetik bir ayırıcı kullanarak boncuklardan tamponu uzaklaştırın, tamponla iki kez yıkayın ve porsiyonlara ayırın. Kullanım için, replike edilecek DNA, Amil lane ile fonksiyonelleştirilmiş cam lamellerine tutturulur.Amin silanın oksiler grubu cama bağlanarak, biyotinli peg molekülleriyle bağlanma için bir amini serbest bırakır. Bu kaplama, yüzeye yönelik spesifik olmayan bağlanmanın azaltılmasına yardımcı olur. Cam lamelleri tamamen temizlemek için onları boyama kavanozlarına yerleştirin, kavanozları etanol ile doldurun ve sonikasyon uygulayın.Kavanozları 30 dakika boyunca durulayın ve 1 molar potasyum hidroksit ile doldurup 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun; her iki yıkama işlemini tekrarlayın. İlk fonksiyonelleştirme reaksiyonu için tüm su kalıntılarının giderilmesi gerekir. Boyama kavanozlarını asetonla doldurun ve 10 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.Kavanozları boşaltın ve tekrar asetonla doldurun. Kavanozlara sine reaktifini ekleyin ve iki dakika boyunca çalkalayın. Ardından, bol miktarda su ile durulayın.Ardından, lamelleri fırında 110 °C'de 30 dakika boyunca kurutun. Sonrasında, yaklaşık %0,2 ağırlık/hacim oranında peg karışımını hazırlayın. Cam lamel ara parçası içeren biyotinillenmiş peg, lamellerin ayrılmasını sağlayacaktır; kuru silanize bir lamelin üzerine 100 µL pipetleyin.Üzerine ikinci bir lamel yerleştirin. Lamelleri PEG çözeltisi içinde üç saat boyunca inkübe edin. Ardından her bir lamel çiftini birbirinden ayırın ve suyla iyice yıkayın.Sadece tek tarafı peg ile kaplanacağı için, lamine camların fonksiyonelleştirilmiş tarafının yukarıya gelecek şekilde tutulmasına dikkat edin. Son olarak, lamine camları basınçlı hava ile kurutun ve vakum altında saklayın. Bir desikatörde yüzeyler en az bir ay boyunca stabil kalır. Böylece, onlarca lamine cam tek seferde hazırlanabilir ve gerektiğinde kullanılabilir.Kapak lamlar hazırlandıktan sonra, tek molekül deneyi için akış hücresi monte edilebilir. Tek molekül deneyi; fonksiyonelleştirilmiş bir kapak lam, çift taraflı bant, kuvars lam ve tüpler kullanılarak oluşturulan basit bir akış hücresi ile gerçekleştirilir. Her tek molekül deneyi için bir akış hücresi hazırlanır.Beş mililitre bloklama tamponu ve 20 mililitre çalışma tamponunu karıştırarak başlayın ve sonraki adımlar için hava kabarcıklarını gidermek amacıyla karışımı bir desikatöre yerleştirin. Ardından, PBS içindeki strp din çalışma çözeltisinden 100 mikrolitreyi peg fonksiyonel hale getirilmiş lam yüzeyine yayın ve strp din'in yüzey biyotinine bağlanmasını sağlamak için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Bu sırada, kuvars lamın boyutuna uygun bir çift taraflı bant parçası kesin ve bant üzerindeki boru deliklerinin konumlarını işaretleyin.Üç milimetre genişliğinde bir merkez kanal ve her iki deliği de içeren dikdörtgenler çizerek akış odasını taslaklandırın. Akış odaları, iki girişli ve iki çıkışlı y şeklinde kanallarla tasarlanabilir. Şimdi, işaretli bandı çizilen taslağa göre, hiçbir yapışkanın kanala taşmadığından emin olmak için düz ve temiz kesikler yaparak kesin.Önceki deneylerde kullanılan akış hücresi yapımından kalan yapıştırıcıyı temizlemek için kuvars lamı aseton kullanarak iyice temizleyin. Kanal taslağının en uygun hizalamasını bulun. Yapışkanlı bandın bir tarafındaki koruyucuyu çıkarın ve bandı dikkatlice kuvars lam üzerine yerleştirin.Giriş ve çıkış deliklerinin tıkanmaması için bandı düzgünce hizaladığınızdan emin olun. Ardından, akış hücresinin girişi ve çıkışı için 0,76 mm iç çapındaki tüplerin uygun uzunluklarda kesimlerini hazırlayın. Tüpün ucunu yaklaşık 30 derecelik bir açıyla kesin; böylece tüp, hazne tabanına düz bir şekilde baskı yapmayacaktır.Sonraki adımlarda akış hücresine kolayca takılabilmesi için tüpleri test tüpü raflarına asın. Bu aşamada, lamel inkübasyonu tamamlanmış olmalıdır. Lameli suyla iyice durulayın ve basınçlı hava kullanarak kurutun.Lamine camlağın sadece bir yüzeyi peg ile fonksiyonelleştirildiği için, camlağı ters çevirmemeye dikkat edin. Bant desteğinin diğer tarafını çıkarıp kuvars lamı lamine camlağın üzerine yerleştirerek akış hücresinin montajını tamamlayın. Yapışkanda hapsolmuş tüm havayı dışarı itmek için lamine camlağa hafifçe bastırın. Bu işlem, akış kanalına hava kabarcığı girmesini önlemeye yardımcı olacaktır.Hazerin kenarlarını epoksi ile mühürleyin. Kesilmiş boruları kuvars üzerindeki deliklere yerleştirin ve epoksi ile sabitleyerek mühürleyin. Birkaç dakika kurumaya bırakın.Kuruduktan sonra, oda yüzeyini bloke etmek için 21 gauge bir iğne kullanarak DGAs bloklama tamponunun bir kısmını tüplerden birinin içinden geçirin. Hava kabarcıklarını gidermek için birkaç kez yıkayın ve tek molekül replikasyon deneyine geçmeden önce odanın en az 30 dakika inkübe edilmesini sağlayın. DNA kalıp fonksiyonelleştirilmiş boncuklar ve akış odası hazırlandığında, tek molekül deneyi gerçekleştirilebilir.Başlamak için, akış hücresini mikroskop tablasına yerleştirin. Hücreyi tabla klipsleriyle sabitleyin ve akış kanalının CCD kamera ile aynı hizada olduğundan emin olun. Daha önce hazırlanmış hava yayını şırınga pompasına ve akış hücresinin çıkış borularına bağlayın.Daha geniş çaplı konnektör tüpler kullanarak, akış hücresinin giriş tüplerini bloklama tamponuna yerleştirin ve tüplerdeki hava kabarcıklarını gidermek için şırıngayı geri çekin; akış hücresine sıkışmış hava kabarcıklarını temizlemek için çıkış tüplerine hafifçe vurun. Tüm hava kabarcıkları giderildikten sonra, giriş tüplerinden birini bir iğne ile tıkayın ve çıkış tüplerinden birini 180 derece büküp yapışkan bantla sabitleyerek mühürleyin. Hücreye DNA eklemeden önce, stok DNA kalıbını bir mililitre DGAs one x bloklama tamponunda 10 picomolar olacak şekilde seyreltin. DNA'nın yüzeyi iyi kaplamasını sağlamak için kalıbı orta düzey bir akış hızında hazneye aktarın.Stok boncuk çözeltisini, mililitre başına 2 ila 4 x 10⁶ boncuk olacak şekilde seyreltin. Bir mililitre DGAs 1x bloklama tamponu ekleyin. Ardından karışımı vorteksleyin ve 20 saniye boyunca sonikasyon uygulayın.Seyreltilmiş boncuk çözeltisini hücreye akıtın. Boncuklar eklendikten sonra akışı kapatın ve hücrenin dengeye ulaşmasını bekleyin. Ardından her iki çıkış tüpünü kapatın.Hazne kapalı değilken tüplerde yapılan herhangi bir değişiklik, boncuklar üzerinde güçlü bir kuvvet uygulayarak bağlanan DNA moleküllerini koparacak basınç dalgalanmalarına neden olacaktır. Boncukların yüklenmesi için kullanılan giriş tüpünü, ikinci giriş tüpünü kullanarak bir iğne ile tıkayın. Akış hücresini, bloklama tamponu yıkama çözeltisinin 1x DGAs konsantrasyonu ile kapsamlı bir şekilde yıkamaya başlayın.Yüzeye spesifik olmayan şekilde yapışmış boncukları temizlemek için sahneye hafifçe vurarak sarsın ve kontrol edin. Boncuklar DNA'ya bağlıdır. Akış yönünü değiştirmeyi deneyin.Serbest boncuklar yeterince uzaklaştırıldıktan sonra, akışı kapatın ve haznenin dengeye ulaşmasını bekleyin. Metin protokolünde belirtildiği üzere replikasyon proteinleri içeren taze reaksiyon karışımı hazırlayın. Açık olan çıkış tüpünü kapatın ve giriş rezervuarını yeni hazırlanan reaksiyon karışımına yönlendirin.Enzimatik reaksiyona geçmek için hızlı basınç değişimlerini önlemek amacıyla çıkışı yavaşça açın. İlk olarak, protein çözeltisini DNA'ya etkili bir bağlanma sağlamak için orta düzeyde bir akış hızında hücreye akıtın. Akışı kapatın ve hücrenin dengeye ulaşmasını bekleyin.Çıkış tüplerini kapatın ve reaksiyon karışımını içeren tüpü değiştirin. Yıkama işleminden sonra serbest proteinleri uzaklaştırmak için, DGAs yıkama tamponu içeren tüp ile bölmeyi yıkayın. Akışı tekrar kapatın ve bölmenin dengeye ulaşmasını bekleyin.Çıkış tüplerini kapatın ve yıkama tamponu içeren tüpü değiştirin. T7 replikasyon tamponu içeren tüpü yerleştirin; T7 replikasyon tamponu, replikasyon reaksiyonunun başlamasını tetikleyen magnezyum klorür içerir. Bu protokolde açıklanan koşullar altında, DNA bağları üzerinde üç piko Newton'luk bir sürükleme kuvvetine karşılık gelen 0,012 mililitre/dakika akış hızını kullanın.Boncuklar ile yüzey arasındaki spesifik olmayan etkileşimleri önlemek için görüntüleme öncesinde akış hücresinin üzerine nadir toprak elementli bir kalıcı mıknatıs yerleştirin. Fiber aydınlatıcıyı, 10 x objektif ve CCD kamera ile mikroskop görüş alanının yakınına, 10 derece ile mikroskop tablasına paralel olan bir geliş açısıyla konumlandırın. Bağlı boncuk kullanılarak boncuk görüntüleme odağındaki kontrastı artırmak için karanlık alan aydınlatması uygulanır.Düşük bir kare hızında 20 ila 30 dakika boyunca veri toplama işlemini başlatın. Başarılı bir deneyde, 100 boncuk eş zamanlı olarak gözlemlenebilir. Deney, öncü zincir DNA sentezini gösteren çok sayıda iz sağlamalıdır.DNA açılma ve polimerizasyon hızlarını ve prosesivitesini ölçmek için, öncelikle boncukların kesin konumlarının belirlenmesi gerekir. Bu konumları iki boyutlu Gaussian fonksiyonları ile fit edin. İzleme yazılımı kullanarak her karedeki boncuk konumunu takip ederek yörüngeyi görselleştirin.Ardından, hız verilerini elde etmek için herhangi bir grafik yazılımı kullanarak boncuk konumunu zamana göre grafiğe dökün. Grafikleri doğrusal regresyonla uydurun ve prosessiflik için eğimi hesaplayın. Bir kısalma olayının başlangıcından sonuna kadar olan toplam DNA uzunluğunu belirleyin.Tüm tekil ölçümleri birleştirin ve verileri sırasıyla Gauss ve tek eksponansiyel fonksiyonlar kullanarak fit ederek hız ve üretkenlik dağılımlarını grafiğe dökün. Size tek molekül düzeyinde DNA replikasyon hızlarının ve prosesivitesinin nasıl ölçüleceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, kuvvetin ve laminar akıştan kaynaklanan belirli etkilerin, replikasyon proteinlerinin enzimatik aktivitelerini etkilemediğinden emin olmak önemlidir.İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

direct-observation-enzymes-replicating-dna-using-single-molecule-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

DT40 bir model omurgalı genetik sistemi, protein fonksiyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağlar. Burada tek bir molekül düzeyinde DT40 hücrelerinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametreler nitel analiz sağlayan basit bir yöntem açıklanmaktadır.

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Bu çalışma, tek bir molekül flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak çift sarmallı DNA ilmek dinamiklerini ölçmek için bir ayrıntılı deneysel prosedür sunmaktadır. Protokol ayrıca J faktörü denilen döngü olasılık yoğunluğunu ayıklamak için nasıl açıklar.

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Bu iletişim kuralı tek boyutlu (1 D) Difüzyon boyunca DNA moleküllerinin çalışmak için bir basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek molekül akışı uzanan tahlil göstermektedir.

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

Bu iletişim kuralı DNA polimeraz yakın kızılötesi fluorescently etiketli DNA Jel Elektroforez ve jel görüntüleme kullanarak değişiklikleri gözlem yoluyla değiştirilmiş DNA sentezi karakterizasyonu açıklar. Akrilamid jelleri yüksek kararlılık düşsel boyutuna bağlı olarak farklı fiyatlara geçiş kısa nükleik asitler ayrılması için kullanılır.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

TEK molekül düzeyinde DNA'nın bölgeye özgü dekoltesini ölçmek için son derece paralel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, kısıtlama enonuclease NdeI kullanarak tekniği göstermektedir. Yöntem kolayca siteye özgü DNA bölünmesi ile sonuçlanan herhangi bir süreci incelemek için değiştirilebilir.

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, etiketlenmemiş protein kullanırken kısıtlama endonükleazlarının reaksiyon mekanizmasını araştırabiliriz. Bu tek moleküllü teknik, bireysel protein-DNA etkileşimlerinin büyük ölçüde çoğullanmış gözlemine izin verir ve veriler, iyi doldurulmuş bekleme süresi dağılımları oluşturmak için bir araya getirilebilir.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Metodoloji, nanopartiküllerin varlığında DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonun analizine yardımcı olur. İlgilenilen malzemenin sitotoksisite seviyesine bağlı olarak farklı metodolojiler benimsenebilir. Ek olarak, DNA lifi analizine yardımcı olmak için görüntü analizinin bir açıklaması sağlanmıştır.

DNA Hasarını Araştırmak ve Nanopartiküllerin İndüklediği Onarım Dinamiklerini Araştırmak için DNA Fiber Testinin Gösterilmesi

Proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın zenginlenmesi ve dizilenmesi (eSPAN), iki çoğalan DNA zincirinde kromatin ilişkili proteinin göreceli bolluğunu tespit etmek için geliştirildi ve böylece kromatin replikasyonu ve bağlı süreçler hakkında moleküler içgörüler ortaya çıktı. Bu protokol, maya ve fare embriyonik kök (ES) hücrelerinde eSPAN prosedürlerini tanımlar.

Proteinle İlgili Yeni DNA Zincirlerinin Zenginleştirilmesi ve Dizilenmesi Yoluyla Proteinlerin Zincire Özgü Analizi

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Bu protokol, DNA polimerazlar ve G-dörtlü yapılar gibi engeller arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan floresan mikroskobu tabanlı tek moleküllü DNA replikasyon testini ana hatlarıyla belirtir.

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Öğrenin, geniş alan optik mikroskopi kullanarak tek molekül düzeyinde DNA replikasyonunu gerçek zamanlı gözlemleme yöntemini. Lambda DNA ve boncuk etiketleme ile replikasyon dinamiklerini doğrudan izleyin.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Daha fazla video keşfet