Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp. Kültürler

Bu video, bu durumda bazı türlerde toksin sinezisini indüklemek için kullanılan bir prosedürü ve laboratuvarımızdaki proteomik çalışmalar için kullanılan tüm prote ekstraksiyonu protokolünü açıklamaktadır. İşlemin uzunluğu, 16 gün, mantar büyümesi için dört gün, toksin sinezi için 10 gün ve protein ekstraksiyonu için iki gün. Dört gün sonra, koloniler hala aktif olarak plakanın kenarına doğru büyüyor.

Tipik hava miselyumu oluşturulur ve plakanın yüzeyini nazikçe çizerek lamina akış kutusunun altında bir steroid bıçak kullanılarak toplanır. Miselyum beş küçük parçaya bölünür ve 25 mililitre toksin indükleyici ortam içeren erken bir şişeye eklenir. Toksin indüksiyonu koyu tozdan daha etkilidir.

Şişe alüminyumla kaplanmıştır. Kültürler daha sonra 10 gün boyunca, 25 santigrat derecede dakikada 150 tur çalkalanır. Ortam SAPH'tır ve yüksek konsantrasyonlu S row çözeltisi içerir.

Yatağın karanlıkla birlikte ria'da toksinlerin sinezisini kolaylaştırdığı bilinmektedir. Miselyum daha sonra MI yakın dokusu üzerinde süzülerek toksin içeren sıvıdan ayrılır. Sıvı, toksin içeriğini ölçmek için kullanılabilirken, miselyum protein ekstraksiyonu için kullanılır.

Medyanın taşınmasını önlemek için tavanım üç kez steril su ile yıkandı. Daha sonra sıvı nitrojen gibi fazla su atılmalıdır ve numuneler eksi 80'de saklanabilir veya protein ekstraksiyonu için kullanılabilir. Protein ekstraksiyon prosedürü, SDS ve TCA'nın kullanımına dayanır ve farklı lizis adımlarından oluşur.

Gerçekleştirmek için birden fazla operatörü kapsayan bir yöntem önerecektir. Aynı zamanda biyolojik kopyaların çıkarılması, her bir kopyayı farklı bir operatör gerçekleştirir. Bu yordam, çoğaltmaları işleyen farklı operatörler tarafından oluşturulabilecek ayıklama yordamındaki farklılıkları dikkate alır.

Bu nedenle, operatör değişkeni replikasyona dahil edildiğinden, biyolojik replikalar karşılaştırıldığında daha yüksek sağlamlık göstermelidir. Aynı zamanda, birden fazla operatörün kullanılması işlem süresini azaltır. Numune, miselyum ince bir toz olana kadar sıvı nitrojen kullanılarak steril bir havanda öğütülür.

Bu adım, proteinlerin kalitesi ve miktarı için çok önemlidir. Miselyum, tüplerin toplam hacminin onda dördü oranında 10 mili Teflon tüplerde toplanır. Daha sonra SDS ve farklı proteaz inhibitörleri içeren lizis tamponu eklenir.

Tüpler daha sonra homojen bir çözelti elde edilene kadar çalkalanır. Daha sonra numuneler daha fazla homojenize edilmek üzere kod odasında 30 dakika çalkalanır, hücre duvarlarını ve hidrofobik proteinleri çözmek için numuneler kaynatılır. SDS'nin varlığı, proteinlerin çökelmesini durduran oligomerlerin oluşumunu önler.

Bir santrifüjleme adımı üç fazı ayırır. Proteinler, buz üzerinde tutulan yeni bir tüpte toplanan şeffaf çözelti içinde süspanse edilir. Palet daha sonra girdaplama, kaynatma ve santrifüjlemeyi tekrarlayan ikinci bir adımı gerçekleştirmek için kullanılır.

İki lizisten elde edilen snat, buzul çökeltmesi, asit tonu içeren tampon, tri asidik asit ve DTT ile çökeltme yapmak için birleştirilir. Numuneler daha sonra proteine izin vermek için eksi 20 santigrat derecede 16 saat boyunca gece boyunca saklanır. Yağış proteinleri, yağışı iyileştirmek için tüplerin altına yerleştirilmiştir.

Tüpler 45 dakika boyunca yüksek hızda santrifüjlenir. Damak artık iyi görünüyor. Süpernatantlar, beş mililitrelik bir boru pedi kullanılarak atılabilir.

TCA daha sonra aseton ve DTT içeren 25 mililitre buzul yıkama tamponu eklenerek uzaklaştırılır. Daha sonra iyice ve kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Daha sonra yeni bir santrifüjleme aşaması gerçekleştirilir.

Protein damağı şimdi yüzüyor, bu nedenle çıtırtıyı ortadan kaldırmak için bir gerginlik ödenmelidir. Yıkama, tampon, çalkalama ve santrifüjleme ekleyerek ikinci bir yıkama aşaması gerçekleştirilir. SUP ajanı elimine edilir ve numune bir hız torbası kullanılarak kurutulur.

Numune kuruduğunda, protein toz benzeri bir kıvamdadır. Saklamak için. Plastiğin elektrostatik girişimini azaltmak için numune proteini tüpten toplanmalıdır.

Elektrostatik bir tabanca kullanılır ve protein tozu metal bir spatula kullanılarak toplanır. Proteinler daha sonra doğrudan etiketleme tamponunda tekrar süspanse edilir. Dakikada 800 gramda 30 dakika 2D çizgi için kullanılır.

Çözündürmek için yeterlidir. Pahalı 2D çizgi etiketlemeye geçmeden önce protein. Protein kalitesi görüldüğü gibi SDS birinci sayfa jel üzerinde test edilmiştir.

Bir şeridin kenarında önemli lekelerin olmaması, numunenin iyi kalitede olduğunu gösterir.