Name: Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp. Kültürler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-16T15:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Öğrenin Fusarium spp. kültürlerinde toksin indüksiyonu ve protein ekstraksiyonu yöntemini. Bu standart protokol, MIAPE kılavuzlarına uygun olarak proteomik analizler için güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Servane Contal ve Boris Untereiner Biz kendi teknik katkılarından dolayı teşekkür ederim. Biz FNR &quot;FUTOX&quot; projesi destek kabul etmiş sayılırsınız.

Protokol, tamamlanması için 16 gün gereklidir. Zaman diliminde Şekil 1'de ayrıntılı olarak verilmiştir. Ayrıntılar tampon hazırlık <ul><li> Lizis tamponu (örnek başına 3ml) hazırlanması. </li><li> Yıkama tamponu (örnek başına 50ml) hazırlanması. Bu tampon önceden soğutulmuş ve saklanan derin dondurucuda -20 ° C'de daha fazla analiz kadar ve tüm prosedürü sırasında buz üzerinde tutulmalıdır olmalıdır. </li><li> Yağış tamponu (örnek başına 20ml) hazırlanması. Bu tampon, bütün prosedür sırasında gerekli ve buz üzerinde tutulmalıdır kadar derin dondurucuda -20 ° C'de önceden soğutulmuş ve saklanan olmalıdır. </li><li> 4 iş tercihen soğuk odasına yürütülen olmalıdır ° C </li></ul> Mantar türlerinin Proteomik analizleri için kullanılan üç tür morfolojik özellikleri ve Çeviri uzama faktörü Alpha-1 analizi temelinde Fusarium graminearum sınıflandırıldı (O'Donnell ve ark, 1998) Bu suşlar CRP-Gabriel Lippmann koleksiyonuna aitti ve korunur ve muhafaza edildi - 80 ° C 15% gliserol. Miseller, hazırlanması Mantarlar V8 25 ° C ışık ve karanlık bir dönem değişen her 12 saat, 4 gün boyunca yetiştirildi. Kültürler, steril bir bıçak ve bu kültürlerin adet 100 ml toksin tetikleyen medya içeren 250 ml Erlenmeyer şişeler aşılamak için kullanılmıştır kullanarak parçalandı. Miçel 10 gün sonra hasat edildi ve steril bir filtre ile kültür filtre ederek ortamdan ayrıldı. Miçel orta artıkları ve diğer bileşikler kaldırmak için steril su ile 3 kez yıkandı. Daha sonra hücrelerin sıvı azot ekleyerek hemen dondu ve -80 örnekleri tuttu ° C Protein ekstraksiyon Genel açıklama Protein örnekleri rakam 3A ve 3B açıklanan yöntem kullanılarak çıkarıldı. Fusarium örnekleri, sıvı azot zemin ve, toz, 10 ml teflon tüpler toplandı. Örnekler daha sonra lizis tamponu ile 30 dakika inkübe 10 dakika kaynatılır ve oda sıcaklığında (15 dakika için 12000g) 2 kez santrifüj edildi. Süpernatantlar -20 ° C'de bir gece yağış tamponu ile toplanır ve inkübe edildi. 4 ° C 30000g santrifüj sonrasında 45 dakika, çöktürülmüş proteinlerin pelet DTT içeren soğuk aseton ile 3 kez yıkandı. Son olarak, pelet hava kuru ve proteinlerin pH 8 'e ayarlayarak, etiketleme tampon resolubilized edildi. 30 ml'lik bir alt-örneklem total protein ölçümü için çıkarıldı ve kalan süpernatant protein elektroforezi kadar -20 ° C'de saklanır. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 prosedürü Timeline. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 birden fazla operatör örnek işleme Programı. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="Şekil 3a" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3a"> Şekil 3a. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="Şekil 3b" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3b"> Şekil 3b. Lütfen <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg">buraya tıklayın</a> daha büyük bir rakam 3a sürümünü ya da görmek için <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg">buraya</a> , daha büyük bir rakam 3b versiyonu için . Şekil 3a-b protein ekstraksiyon prosedürü Akış şemaları (A: ilk gün; B: ikinci gününde). <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="Şekil 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 protein özleri 1D resim. Proteinler lav Purple ile boyandı jel sonuna kadar mavi tam göç kadar çalıştırmak. Lütfen Şekil 4 büyük halini görmek için <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg">buraya tıklayın</a> .

<ol><li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Extraction+from+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li>
<li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li>
<li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li>
<li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotoxin+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li>
<li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+sample+in+OMICS+technology%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li>
<li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana%3A+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li>
<li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li>
<li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+in+science.+Protocol+videos%3A+the+implications+for+research+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li>
<li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+%28MIAPE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li>
<li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li>
</ol>

Mantar biyoloji etki alanı içinde proteomik yaklaşımlar son zamanlarda ilgi, bu tekniği kullanarak (as Kim ve ark, 2007 gözden) yayınların sayısının artmasına yol açtı . Protein ekstraksiyon yöntemleri çıkarma prosedürlerinin kombinasyonu güveniyor; genellikle pek metodolojik bölümlerde açıklanan ve potansiyel sorun giderme yöntemleri ile ilgili uzmanlık gerektirir. , Örnek ve veri işleme için standartları belirleyen diğer &quot;omics&quot; yaklaşımlar, güvenilir bilimsel bilgi üretmek için esastır. Ayrıca manipülasyon örnekleri ve prosedürleri farklı &quot;omics&quot; deneyler sonucu yorumlama arasında paylaşılan izin vermek için yeterince tarif edilmelidir. Bu tamamen genomik, proteomik, metabolomik, çapraz veri madenciliği potansiyellik istismar için gerekli olacaktır ... (Morrison ve ark, 2006). Proteomik bir denemeyle ilgili asgari bilgileri bir denemenin bütün yönleriyle (Jel elektroforezi, Kütle Spektroskopisi, Moleküler Etkileşimler, Protein Değişiklikler, Proteomik Bilişim, Örnek İşleme) mücadele amacıyla hazırlanmıştır ve çalışma grupları kurulmuştur. Şu anda herhangi bir tanımlı bilgilerle örnek işleme prosedürleri mevcuttur. (Taylor ve ark, 2007) MIAPE kurallar çerçevesinde standardizasyon artırabilir prosedürleri uygulamak için, proteomik çalışmalar son kalitesini belirleyen protein çıkarma prosedürlerinin önemi göz önüne alındığında, biz örnek ayrıntılı bir video protokol önerdi işleme. Deneylerin video tanımı &quot;omics&quot; deneyler (Pasquali 2007) daha iyi tekrarlanabilirlik neden olabilir numune işleme hakkında bilgi sayısını artırmak için önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Gerçekten de, laboratuvarlar boyunca tekrarlanabilirliği proteomik sonuçları (http://www.fixingproteomics.org) geçerliliğini garanti altına almak için temel bir gerekliliktir. Farklı instrumentations ve farklı operatörler örnekleri manipüle: çapraz laboratuvar tekrarlanabilirliği iki faktör tarafından etkilenmektedir. Açıklanan protokol, biz gerçekleştirmek için teklif biyolojik veriler (yani sonuçların teknik değişimi dikkate alınır) güvenilirliğini artırmak için birden fazla operatörleri (Şekil 2 ve video) içeren çoğaltır. Protein ekstraksiyonu için açıklanan prosedür SDS ve ısıtma dayanmaktadır. Bu proteinlerin iyi bir saflık ve miktar (Bridge 1996), daha önce garanti gösterildi. SDS kaynatılarak ile birleştiğinde hücre duvarları, hidrofobik proteinler çözünür ve proteinlerin iptal yağış oligomerler oluşumunu önler. Kaynama proteazların inaktivasyonu da sağlar. Aynı etki, EDTA, PMSF ve tam mini proteaz inhibitörü tarafından da üretilir. DTT ve protein çözünmüş kolaylaştırılması proteinler arasındaki disülfit köprüleri kaldırır. IEF önce SDS kaldırmak için, proteinler, aseton / TCA / DTT çöktürülür. Ayrıca, bu bileşiklerin mevcut olduğunda, yağlar, nükleik asitler, tuzlar veya / ve fenolik bileşikler gibi bazı yabancı maddelerden kaldırarak aseton / TCA / DTT yağış sağlar. SDS gibi, bu molekülleri IEF sırasında iyi bir göçü önlemek. Bu yağış sonrasında, IEF ile müdahale gibi TCA kaldırmak için aseton / DTT, çöktürülmüş proteinleri yıkamak için gereklidir. İyi bir numune hazırlama, iyi sonuçlar için bir anahtardır. Bunun için, çevre proteinlerin toz ücretsiz eldiven ile çalışan ve iyi laboratuvar uygulamalarına saygı kirlenmesini önlemek için de gereklidir. Teknik açıdan, açıklanan protokol dahilinde, iki aşamada proteinlerin yeterli miktarda ve saflık elde etmek için en kritik adımlar. İlk olarak, öğütme hücrenin tam imha proteinler serbest bırakmak için temel aşaması ve ikinci, toplam proteinlerin saflaştırılması, lipid, DNA ve proteinlerin göç ile parazite neden olabilecek diğer kirleticiler çoğunluğu kaldırılması kapsayan bir faz.

Medya ve çözümler PDA: 39 g Patates Dekstroz Agar (Difco), 1 L distile su. V8 Agar: 200 ml V8 (Campbell, ABD), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (Difco), 800 ml distile su Toksin indükleyici medya: 1g K 2 HPO 4, KCl 0.5g, 0.5g MgSO 4 7H 2 O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamik asit, distile su 1L 10g sakaroz. Lizis Tampon: <table border="1"><tr><td></td><td> 100 mL </td><td> Final konsantrasyonu </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCL pH8 </td><td> 5ml </td><td> 50mm </td><td> 1M </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2G veya 10ml </td><td> % 2 </td><td> % 20 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 500ml </td><td> 10mM </td><td> 2M </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 20ml </td><td> 0.1mm </td><td> 0.5M </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 200ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Komple mini proteaz inhibitörü </td><td> 1 tablet </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Su </td><td> QSP </td><td></td><td></td></tr></table> Yağış Tampon: <table border="1"><tr><td></td><td> 100 mL </td><td> Final konsantrasyonu </td></tr><tr><td> TCA </td><td> 20ml </td><td> % 20 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1ml </td><td> % 0.1 </td></tr><tr><td> Aseton </td><td> QSP </td><td></td></tr></table> Tampon Yıkama: <table border="1"><tr><td></td><td> 100 mL </td><td> Final konsantrasyonu </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1ml </td><td> % 0.1 </td></tr><tr><td> Aseton </td><td> 100 mL </td><td></td></tr></table> Etiketleme Tampon (-18 ° C küçük alikotları mağaza): <table border="1"><tr><td></td><td> 1mL </td><td> Final konsantrasyonu </td></tr><tr><td> Üre </td><td> 140 mg </td><td> 7M </td></tr><tr><td> Tiyoüre </td><td> 50 mg </td><td> 2M </td></tr><tr><td> Chaps </td><td> 40 mg </td><td> % 4 </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 30 mcL </td><td> 30 mm </td></tr><tr><td> Su </td><td> 1 ml </td><td></td></tr></table>

toksin İndüksiyon ve protein ekstraksiyonu fusarium spp.</emproteomik araştırmalar> kültürler

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria farklı toksinler üretebiliriz ipliksi mantarlar. Fusarium mikotoksinler deoksinivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric asit, moniliformin, vb gibi .. insan hem de hayvan sağlığı üzerindeki olumsuz etkileri ve bazı patojenite faktörleri olarak kabul edilmektedir. Proteomik çalışmalar Fusaria potansiyel patojenik faktörler (Kağıt ve diğerleri, 2007, Houterman ve ark, 2007) tanımlamak için toksin üretimi mekanizmaları (Taylor ve ark, 2008) yanı sıra çözmekte etkili olduğunu gösterdi. Bu nedenle, protein ekspresyonu deneyler, zorlama ve laboratuarlar arasındaki gerçek farklar bulundu güvenmek için proteomik çalışmalar arasında bir karşılaştırma için güvenilir yöntemler kurmak için temel haline gelir. Açıklanacaktır işlemi iki şekilde proteomik prosedürlerin standartlaştırılması artan bir düzeyde katkıda bulunmalıdır. Filme protokol tam olarak tarif edilebilir ayrıntıları seviyesini artırmak için kullanılır. Ayrıca, biyolojik bir süreç standart prosedürlerin mevcut ekstraksiyon prosedürü teknik tekrarlanabilirlik içinde insan faktörü de dikkate alınarak, daha yüksek bir veri sağlamlığı garanti çoğaltır. Kültürler ve protein ekstraksiyonu (Şekil 1) için iki gün için ondört gün açıklanan protokol, onun tamamlanması için 16 gün gerektirir. Kısaca, Fusarium suşları 4 gün boyunca katı ortam üzerinde yetişen, daha sonra el ile parçalanmış ve 10 gün boyunca, modifiye edilmiş bir toksin indükleyici medya (Jiao ve ark, 2008). aktarılır. Miselyum Miracloth bir katmanı sayesinde filtrasyon ile toplanır. Taşlama soğuk bir odasında yapılır. Farklı operatörler çıkarma yapılan teknik farklılıkları (Şekil 2) nedeniyle önyargı dikkate almak için (n = 3) çoğaltır. Ekstraksiyon Taylor ve ark açıklandığı gibi bir SDS / DTT tampon dayalı. (2008) hafif değişiklikler. Toplam protein izolasyonu Aseton / TCA / DTT tampon gecelik ve DTT / Aseton yıkama (Şekil 3a, 3b) kullanarak proteinlerin bir yağış süreci gerektiriyordu. Proteinler sonunda, protein etiketleme tampon resolubilized ve ölçüldü. Ekstraksiyon Sonuçları 2D jeller (IEF / SDS-PAGE) geçmeden önce, bir 1D jel (Şekil 4, SDS-PAGE) görüntülendi. Aynı prosedür, büyüyen diğer medya ve diğer ipliksi mantarlar (Miles ve ark, 2007) proteomik analizler için uygulanabilir .

Protein ekstraksiyonu mantar türlerinde proteomik analizleri için en az bir proteomik deney (MIAPE) kuralları hakkında bilgi göre, başarılı olmak için standardizasyon yüksek düzeyde gerektirir. Biz toksin indüksiyon ve protein izolasyonu sırasında deneysel önyargı en aza indirmek için bir prosedür içeren bir video protokol mevcut<em&gt; Fusarium spp.</em

Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp.</emProteomik Araştırmalar> Kültürler

Fusaria, farklı toksinler üretebilen filamanöz mantarlardır. Deoksynivalenol, nivalenol, T2, zearalenon, fusarik asit gibi Fusarium mikotoksinleri...

Bu video, bazı türlerde toksin sentezini indüklemek için kullanılan bir prosedürü (bu örnekte Fusarium için) ve laboratuvarımızdaki proteomik çalışmalarda kullanılan tüm protein ekstraksiyonu protokolünü açıklamaktadır. Prosedürün süresi 16 gündür; fungal büyüme için dört gün, toksin sentezi için 10 gün ve protein ekstraksiyonu için iki gün ayrılmıştır. Dört gün sonra, koloniler hala plağın kenarlarına doğru aktif olarak büyümektedir.Tipik hava miselyumu oluşturulur ve laminer akış kabini altında, plaka yüzeyi hafifçe kazınarak steril bir bıçak kullanılarak toplanır. Miselyum beş küçük parçaya bölünür ve 25 milliliter toksin indükleme besiyeri içeren bir Erlenmeyer flaskına eklenir. Toksin indüksiyonu karanlık ortamdan daha verimlidir.Erlenmeyer flask alüminyum folyo ile kaplanır. Kültürler daha sonra 10 gün boyunca, dakikada 150 devirle 25 °C'de çalkalanır. Besiyeri SAPH olup yüksek konsantrasyonlu S row çözeltisi içerir.Karanlıkla birlikte yatağın, ria'da toksin sentezini kolaylaştırdığı bilinmektedir. Daha sonra miselyum, MI yakın doku üzerinde filtreleme yapılarak toksin içeren sıvıdan ayrılır. Sıvı, toksin miktarını ölçmek için kullanılabilirken, miselyum protein ekstraksiyonu için kullanılır.Besiyeri kalıntılarından kaçınmak için misel hattı steril su ile üç kez yıkanır. Fazla su uzaklaştırılmalıdır. Ardından, sıvı nitrojen eklenir ve örnekler -80°C'de saklanabilir veya protein ekstraksiyonu için kullanılabilir. Protein ekstraksiyon prosedürü SDS ve TCA kullanımına dayanmaktadır ve farklı lizis aşamalarından oluşmaktadır.Birden fazla operatörün gerçekleştirmesini kapsayan bir yöntem önerilecektir. Biyolojik replikatların ekstraksiyonu sırasında, her bir replikat farklı bir operatör tarafından gerçekleştirilir. Bu prosedür, replikatları işleyen farklı operatörler tarafından ekstraksiyon prosedüründe oluşturulabilecek farklılıkları dikkate almaktadır.Operatör değişkeninin tekrarlar dahilinde yer alması nedeniyle, biyolojik tekrarlar karşılaştırıldığında daha yüksek bir dayanıklılık göstermelidir. Aynı zamanda, birden fazla operatörün kullanılması işlem süresini kısaltır. Örnek, misel ince bir toz haline gelene kadar sıvı azot kullanılarak steril bir havan içerisinde ezilir.Bu adım, proteinlerin kalitesi ve miktarı açısından kritik öneme sahiptir. Miselyum, tüplerin toplam hacminin onda dördü oranında olacak şekilde 10 ml'lik Teflon tüplere toplanır. Ardından SDS ve farklı proteaz inhibitörleri içeren lizis tamponu eklenir.Ardından tüpler, homojen bir çözelti elde edilene kadar çalkalanır. Daha sonra numuneler, daha fazla homojenleştirilmek üzere soğuk odada 30 dakika boyunca çalkalanır; hücre duvarlarını ve hidrofobik proteinleri çözmek için numuneler kaynatılır. SDS varlığı, proteinlerin çökelmesini engelleyen oligomerlerin oluşumunu önler.Bir santrifüj adımı üç fazı birbirinden ayırır. Proteinler, buz üzerinde tutulan yeni bir tüpe toplanan şeffaf çözeltide süspande haldedir. Ardından pelet, vorteksleme, kaynatma ve santrifüjleme işlemlerinin tekrarlandığı ikinci bir liz adımı gerçekleştirmek için kullanılır.İki lizattan elde edilen süpernatantlar, aseton, trikloroasetik asit ve DTT içeren çöktürme tamponu ile çöktürme işlemini gerçekleştirmek üzere birleştirilir. Proteinlerin çökmesine izin vermek için örnekler ardından -20 °C'de 16 saat boyunca gece boyu saklanır. Çöktürmeyi artırmak için proteinler tüplerin dibine çöker.Tüpler 45 dakika boyunca yüksek hızda santrifüj edilir. Pelet artık net bir şekilde görülmektedir. Süpernatanlar beş mililitrelik bir pipet ucu kullanılarak atılabilir.Ardından, aseton ve DTT içeren 25 milliliter buzlu yıkama tamponu eklenerek TCA uzaklaştırılır. Daha sonra iyice ve kuvvetlice çalkalanır. Sonrasında yeni bir santrifüj adımı gerçekleştirilir.Protein pelleti şu an yüzmektedir, bu nedenle pelletin çöktürülmesine dikkat edilmelidir. Yıkama tamponu eklenip, çalkalama ve santrifüjleme işlemlerinin ardından ikinci bir yıkama adımı gerçekleştirilir. Süpernatan uzaklaştırılır ve örnek bir vakum pompası kullanılarak kurutulur.Numune kuruduğunda, protein toz benzeri bir kıvamdadır. Saklamak için, plastik tüpün elektrostatik etkileşimini azaltmak amacıyla numune protein tüpten alınmalıdır.Elektrostatik bir tabanca kullanılır ve protein tozu metal bir spatula yardımıyla toplanır. Proteinler daha sonra doğrudan etiketleme tamponunda yeniden süspanse edilir. 2D için kullanılır - dakikada 800 gram hızında 30 dakika boyunca.Çözündürmek için yeterlidir. Pahalı 2D etiketleme işlemine geçilmeden önce protein hazırlanır. Protein kalitesi, görüldüğü üzere tek boyutlu SDS-PAGE jeli üzerinde test edilir.Şeridin kenarında belirgin yayılmaların (smear) olmaması, numunenin kalitesinin iyi olduğunu gösterir.

toxin-induction-protein-extraction-from-fusarium-spp-cultures-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Steril koşullar altında toplanması için bir prosedür Gibberella zeae ascospores gelişim süreçleri incelemek için en üst düzeyde protokol açıklamasına bilgi üretmek için filme. Bu deney, çok önemli bir yönü tam genom ekspresyon profil testleri uygulanmaktadır tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak gerekir.

Gibberella zeae Ascospore Üretim ve Tahsilat Mikroarray deneyler için.

Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

Burkholderia cinsin üyeleri klinik önemi patojenlerdir. Bu, mekanik bozulma ve daha sonraki analiz için proteomik 2-D jel elektroforezi kullanılarak, toplam bakteri protein çıkarımı için bir yöntem tarif eder.

Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri<em&gt; Burkholderia</em&gt; Türler

Bu fungus, Aspergillus flavus aflatoksin sentezi genleri sessizleşme RNA-parazit sinyalleri içeren yerfıstığı tohumlarda aflatoksin ve transgen ekspresyonunun analizi için bir yöntem ortaya koymaktadır. Bitkilerde mikotoksin RNAi aracılı kontrolü önceden bildirilmemiştir.

Yerfıstığı aflatoksin RNAi aracılı Kontrol: Yöntem Yerfıstığı Mikotoksin Üretim ve Transgen Anlatım Analiz /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

Aspergillus flavus büyüme ve aflatoksin üretim mısır çekirdekleri antifungal bir protein ifade içinde analiz etmek için bir iletişim kuralı mevcut burada.  A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak biz izlenen enfeksiyon ve gerçek zamanlı olarak olgun çekirdekleri içinde mantar yayılmasını. Tahlil hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Bu protokolün amacı, anaerobik odacıklar kullanılmadan, özellikle b ve D gerinim tipleri üreten epsilon toksini olmak üzere, yerel olarak satın alınan gıdalarda farklı Clostridium perfringens toksinlerini tespit etmektir.

Perakende Gıda Numunelerinde Clostridium Perfringens Toxinotypes Zenginleştirme ve Algılama

Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.

Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

Burada, maldi-TOF-TOF tandem kütle spektrometresi ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz kullanılarak genomik olarak sıralanmış patojenik bakteriler tarafından üretilen proteinlerin şirket içinde geliştirilen yazılımla hızlı tanımlanması için bir protokol sunuyoruz. Metastable protein iyonları, aspartik asit etkisi nedeniyle parçalanır ve bu özgüllük protein tanımlaması için yararlanılmıştır.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve Yukarıdan Aşağıya Proteomik Analiz kullanılarak Escherichia coli'de Antibakteriyel Bağışıklık Proteinlerinin Tanımlanması

Burada, toprak örneklerinden entomopatojenik mantarların (EPF) izole edilmesi ve seçilmesi için kullanılan yemek kurdu (Tenebrio molitor)-yem sistemine dayanan bir protokol sunuyoruz. Sahada zararlı mikrobiyal kontrolü için fizyolojik özelliklere göre yüksek strese dayanıklı EPF seçmek için etkili bir konidia sayısı (ECN) formülü kullanılır.

Toprak Örneklerinden İntomopatojenik Mantarların İzolasyonu ve Seçimi ve Böcek Zararlılarına Karşı Mantar Virülansının Değerlendirilmesi

Entomopatojenik mantar kolonileri, Tenebrio yemi, Galleria yemi ve seçici yapay ortam, yani kloramfenikol, tiyabendazol ve sikloheksimid (CTC ortamı) ile desteklenmiş maya özü ile zenginleştirilmiş patates dekstroz agarı kullanılarak tropikal toprak örneklerinden izole edilir.

Entomopatojenik mantarları toprak örneklerinden izole etme yöntemlerinin karşılaştırılması

Bu makale, bitki ilişkili endofitik mantarların izolasyonu, izolatların uzun süreli korunması, morfolojik karakterizasyon ve sonraki moleküler tanımlama ve metagenomik analizler için toplam DNA ekstraksiyonu için ayrıntılı ve yeterli protokoller sağlamayı amaçlamaktadır.

Mikoheterotrofik Bitkilerde Endofitik Mantarları Tanımlamak için İzolasyon, Karakterizasyon ve Toplam DNA Ekstraksiyonu

Öğrenin Fusarium spp. kültürlerinde toksin indüksiyonu ve protein ekstraksiyonu yöntemini. Bu standart protokol, MIAPE kılavuzlarına uygun olarak proteomik analizler için güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp. Kültürler

Daha fazla video keşfet