Name: Kanser Hücrelerinin PuraMatrix Kapsülleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Öğrenin, PuraMatrix hidrojel kullanarak CAR5 yumurtalık kanseri hücrelerini kapsülleme ve 3D kültür ortamında mikrometastatik nodülleri taklit eden yapılar oluşturma yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Teknik Notlar: <ul><li> Katılaşma, tuz ilavesi ile başlatılır. Bu nedenle, jelleşme istenilen kadar hiçbir tuzları PuraMatrix ile temas geldiğini KRİTİK çok düşük iyonik kuvvet tuzları (örneğin, &lt;0.05 M) maruz kalma, geri dönüşü olmayan jelleşme neden olacaktır. </li><li> Tuzları ile temas gelmeyecek daha sonraki bir tarihte hazırlanan kalan stok solüsyonları kullanılabilir. Tekrar sonication hakkında endişelenmenize gerek yoktur. </li><li> Hava kabarcıkları santrifüj yoluyla takip steril tüpler içine PuraMatrix aliquoting silinebilir. </li><li> Aspirasyon PuraMatrix yatağına kolayca bozabilir medya değişimleri sırasında çok dikkatli olun. </li></ul> Malzemeler: BD PuraMatrix RAD16 Peptid Hidrojel% 1 (Cat # 354.250): sulandırılmamış karışımı toplam peptid konsantrasyonu 10 mg / ml. <ul><li> Su Banyosu sonikatör veya Vortex </li><li> 96-well hücre kültürü çanak </li><li> Hücre Kültürü Ortamı </li><li> Steril Filtreli H 2 O </li><li> Steril Filtreli% 20 Sakkaroz </li><li> Hücreler (5.000 hücreleri /): OVCAR-5 </li></ul> Tüm adımları aseptik koşullar altında yapılmalıdır. Prosedür: <ol><li> Kullanmadan önce viskoziteyi azaltmak için, 30 dakika süreyle su banyosunda sonikatör% 1 PuraMatrix (RAD16) sonikasyon. </li><li> % 1 PuraMatrix çözüm gelecek deneyler basitleştirmek için steril tüpler içine aliquoted olabilir. <ol class="lalpha"><li> Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek, onlar formu sadece 5 dakika 1000 rpm (300 xg) PuraMatrix içeren steril tüpler aşağı doğru döndürün. </li><li> Sulandırılmamış karışımının toplam peptid konsantrasyonu 10 mg / ml. </li></ol></li><li> İki setleri sırasıyla 2.5 mg / ml ve 1.25 mg / ml toplam peptid konsantrasyonu, 4 kuyu kaplama olacak. </li><li> Sırasıyla,% 10 sakaroz BD PuraMatrix 2x konsantrasyonu elde etmek için de 0.2 mikron toplam peptid konsantrasyonları 5 mg / ml ve 2.5 mg / ml filtrelenmiş steril% 20 ve% 13.3 sakkaroz sakaroz her PuraMatrix sulandırınız. <ol class="lalpha"><li> % 20 sukroz olun, sonra 10 g sakaroz, hacim, 50 ml su ile seyreltilmiş. </li><li> % 13 ve% 10 sakkaroz,% 20 stok solüsyonu seyreltilmesi ile hazırlanabilir. <ol class="lroman"><li> % 13 Sakkaroz (her 10 ml için): 6.5 ml% 20 sukroz + 3.5 ml steril H 2 O. </li><li> % 10 Sakkaroz (her 10 ml için): 5.0 ml% 20 sukroz + 5.0 ml steril H 2 O. </li></ol></li></ol></li><li> PuraMatrix peptid plaka niyetinde kuyu sayısı dayalı bir master karışımı hazırlayın. (Aşağıdaki örneğe bakın.) Daha sonra 25 ml ana karışımı içeren bireysel tüpler içine kısım. <ol class="lalpha"><li> Kaplama sırasında hücrelerin eşit hacmi ile seyreltilmiş olacak gibi ana karışımı, toplam peptid iki kez istenen nihai konsantrasyonu hazırlanmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"></li></ol></li><li> Hücre tek tabakalı hücre kültürleri trypsinizing, hücre süspansiyonları hazırlayın. <ol class="lalpha"><li> 2 ml% 0.05 tripsin EDTA her T-75 Flask için kullanılabilir. </li></ol></li><li> Tripsin ilavesi ile% 10 ısı inaktive fetal sığır serumu (önceki adımda kullanılan tripsin ml başına medya en az 2 ml.) Içeren hücre kültür ortamı nötralize </li><li> Pelet bir hücre oluşturmak için 5 dakika için 1000 rpm (~ 300 xg) hücreler santrifüjleyin. <ol><li> % 10 steril süzülmüş sakaroz hücrelerin tekrar </li><li> Hücre sayımı ve medya bulunan eser miktarda tuz kaldırmak için 5 dakika 1000 rpm (~ 300 xg) tekrar aşağı doğru döndürün. </li></ol></li><li> De başına nihai hücre sayısı her kuyuda 5.000 hücreler olacağı 5 hücre / ml, 2.0 x 10% 10 sakaroz OVCAR-5 hücreleri tekrar Aşağıdaki adımları hızla yapılmalıdır. </li><li> 2.0 x 10 5 hücre / ml süspansiyon 25 ul 25 ul PuraMatrix Yukarıdaki şemadan görüldüğü gibi ana karışımı içeren ilk kişisel tüp ekleyin. <ol class="lalpha"><li> Hızla olmadan tüp içinde hava kabarcıkları tanıtan pipetleme (yukarı ve aşağı ~ 5 kez) karıştırın. </li><li> Sonra, 96 iyi bir çanak uygun kuyuya 50 ul hücre süspansiyonu / PuraMatrix karışımı pipetle. </li><li> Iyi tarafı hafifçe 150 ul hücre kültür ortamı (RPMI +% 10 FBS) pipetleme BD PuraMatrix jelleşme başlatın <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"></li></ol></li><li> Tüm kuyuları kaplama kadar 8 özetlenen adımları tekrarlayın. </li><li> 30 dakika sonra çok yavaşça hidrojel pH denge sağlaması için 200 ul pipet kullanarak medya ~ 2 / 3 kaldırmak. <ol class="lalpha"><li> BU MATRIX bozacak AS VAKUM ASPIRATOR KULLANMAYIN </li><li> Böylece iyi pipet ucu yerleştirin .PuraMatrix yatağından hafifçe dokunmak ve iyi medya kaldırmak değildir. </li><li> Bakım PuraMatrix hücrelerin kültür sırasında matris bozmayacak alınmalıdır. </li></ol></li><li> Çok yavaşça PuraMatrix kapsüllenmiş içeren hücrelerin yan 150 ul taze hücre kültür ortamı ekleyin. </li><li> 10. ve 11. adımları dikkatlice tekrar ederek taze kültür ortamı ile her 48 saatte bir hücre kültür ortamı değiştirin. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 OVCAR-5 hücrelerin, yukarıda protokol açıklandığı gibi kapsüllü . Sapphire lazer 750 nm ayarlanmış: Görüntüler Spectra-Fizik DeepSee Ti ile donatılmış bir ters Olympus FV1000 mikroskop kullanılarak elde edildi. Görüntüleme oturumları gün 1, 3, 5 ve 7 post-kaplama yapılmıştır. 40x objektif daldırma bir uzun çalışma mesafesi, su (Olympus LUMPLFLN 0.8 NA) PuraMatrix üzerinden görüntü için kullanılır oldu. 1.47 mikron eksenel adımları görüntü yığınlarının satın alarak üç boyutlu birimler toplandı. Olmayan iki descanned dedektörleri otofloresans emisyon menekşe (440-490 nm) ve yeşil (510-550 nm) bant geçiren filtreler kullanılarak toplanmıştır. Son görüntüleri ve derinlik yığını filmleri her iki algılama kanallarını birleştirerek ImageJ kullanılarak işlendi. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> .

<ol><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li>
</ol>

kanser hücrelerinin puramatrix kapsülleme

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Artan kanıtlar özetlediği karmaşıklığı tümör biyolojisi daha doğru bir şekilde üç boyutlu olarak bu kültür kanser hücrelerinin önerir. Bu modellerin çoğu, bu hücre kültürü modelleri büyümesini etkileyebilir büyüme faktörleri ve sitokinler değişebilen miktarda içerir hayvanlardan elde edilen sulandırılmış bazal membran kullanır. Burada, ayrıntılı olarak tarif PuraMatrix, hayvansal kaynaklı malzeme ve yumurtalık kanseri hücre hattı, OVCAR-5 saklanması ve yaymak için patojenler yoksun bir piyasada mevcut kendinden montaj peptid jel hazırlanması ve kullanılması. Biz kullanmadan önce PuraMatrix nasıl hazırlanacağını açıklayan başlar. Sonra, hidrojel hücrelerin düzgün kapsüllemek PuraMatrix ve hücre süspansiyonu karıştırmak için nasıl göstermektedir. Ayrıca, fizyolojik bir ortama hücre kültür ortamı veya enjeksiyon üzerine, PuraMatrix peptit bileşeni hızla kendini 500-200 nm ortalama gözenek boyutu ile nanometre ölçekli lifli yapısı sergiler 3D hidrojel içine toplanır<sup&gt; 1</sup&gt;. Buna ek olarak, kapsüllü PuraMatrix yetiştirilen kültürlerini yaymak için nasıl gösterilmektedir. PuraMatrix içinde kapsüllü, OVCAR-5 hücre morfolojisi in vitro modeller tek tabaka daha klinikte gözlenen mikrometastatik nodüllerin daha yakından benzediği, üç boyutlu asiner yapıları içine monte. Konfokal mikroskopi kullanılarak günde 1, 3, 5, ve 7 yazılan kaplama PuraMatrix kapsüllenmiş temsilcisi OVCAR-5 hücre görünümünü göstermektedir. Kültür kanser hücrelerinin PuraMatrix hastalık anlayışımızı geliştirmek ve bize daha fazla klinik prediktif model sistemleri tedaviye yanıtı değerlendirmek için izin vermelidir.

Bu video PuraMatrix, peptid jel montaj piyasada bulunan kendini saklanması ve kültür kanser hücrelerinin nasıl gösteriyor.

Kanser Hücrelerinin PuraMatrix Kapsülleme

Kanser hücrelerinin üç boyutlu olarak kültüre edilmesinin, tümör biyolojisinin karmaşıklığını daha doğru bir şekilde yeniden oluşturduğuna dair kanıtlar giderek artmaktadır. Bunların çoğu...

Monolayer hücre kültürü modelleri, kanser dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların incelenmesinde oldukça yararlı araçlar olmuştur. Ancak, bu modeller in vivo ortamda gözlemlenen üç boyutlu çevreyi yeniden oluşturmakta yetersiz kalmaktadır. Bu video, CAR five over kanseri hücre hattını kapsüllemek ve çoğaltmak için ticari olarak temin edilebilen, kendi kendine organize olan bir peptit jeli olan saf Matrixx kullanımını gösterecektir.Hücre süspansiyonu, saf Matrixx ve hücre kültürü ile karıştırılır. Saf Matrixx içinde kapsüllendirilip kültüre edildiğinde, saf Matrixx'in aktivasyonunu başlatmak için besiyeri eklenir; beş hücre, mikrometastatik nodüllerin morfolojisine benzeyen 3D ASIN R yapılarını oluşturur. Merhaba, ben Adnan Abbi.Massachusetts General Hastanesi'ndeki Kadın Foto Tıp Merkezi'nde, Dr. TBA Hassan'ın laboratuvarında araştırma görevlisiyim. Bugün size, "pure matrix" adı verilen sentetik bir matris içerisinde bir yumurtalık kanseri hücre hattının nasıl kapsülleneceği ve kültüre edileceğine dair bir protokol göstereceğiz. Laboratuvarımızda yumurtalık kanseri için tedavi yanıtını değerlendirmek amacıyla bu modeli kullanıyoruz.Haydi başlayalım. BD 1%pure matrix RAD 16 peptid hidrojeli, kullanım öncesinde toplam 10 mg/mL peptid konsantrasyonuna sahiptir. Steril koşulları koruyarak, su banyosunda 30 dakika boyunca sonikasyon uygulayarak pur matrix'in viskozitesini düşürün.%1'lik saf matris çözeltisini steril tüplere paylaştırın. Gelecekteki deneyleri kolaylaştırmak için hava kabarcığı oluşumundan kaçının; eğer kabarcık oluşursa, saf matris içeren steril tüpleri 1000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Bu gösterimde, iki set dörtlü kuyucuğu sırasıyla 2,5 mg/mL ve 1,25 mg/mL toplam peptid konsantrasyonunda ekileceğiz. Eklemeyi planladığınız kuyucuk sayısına göre (bu durumda sekiz), iki adet saf matris peptid ana karışımı hazırlayın.Her bir master mix, ekim sırasında eşit hacimde hücre ile seyreltileceği için toplam peptidin istenen nihai konsantrasyonunun iki katı konsantrasyonda hazırlanmalıdır; master mix'leri hazırlamak için saf matriksi, toplam peptit konsantrasyonları sırasıyla 5 mg/mL ve 2,5 mg/mL olacak şekilde steril %10 sükroz ve %13,3 sükroz ile seyreltin; %10 sükroz içinde saf Matrixx'in 2x konsantrasyonuna ulaşmak için ardından master mix'lerden 25 µL'lik alikotları sekiz ayrı tüpe aktarın. Saf matriks master mix'leri artık hücre enkapsülasyonu için hazırdır. Bu deneyde CAR five over kanseri hücre hattı enkapsüle edilecek ve çoğaltılacaktır; tripsinizasyon öncesinde hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen 10 mL steril PBS ile 15 ila 20 dakika inkübe edin.PBS'yi aspire edin ve hücre tek tabaka kültürüne tripsin uygulayın, ardından %10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovine serum içeren hücre kültürü medyumu ekleyerek tripsini nötralize edin. Önceki adımda kullanılan her bir mililitre tripsin için en az iki mililitre medyum kullanın. Ardından, hücreleri santrifüj tüplerine aktarın ve bir hücre peleti oluşturmak için hücreleri 1000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Santrifüj sonrası, hücre peletini %10 steril filtrelenmiş sükroz içinde süspanse edin. Hücreleri sayın ve 1000 RPM'de beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Besiyerinde bulunan eser miktardaki tuzu uzaklaştırmak için, her kuyucuk başına final hücre sayısının 5,000 hücre olacağı şekilde, hücreleri %10 sükroz içinde mililitrede iki x 10⁵ hücre yoğunluğunda süspanse edin.Hücreler artık saf Matrixx içerisine enkapsülasyon için hazırdır. Hücrelerin saf matrise enkapsüle edilmesine yönelik şu adımlar hızla gerçekleştirilmelidir: Önceden hazırlanmış hücre süspansiyonundan 25 µL, 25 µL saf Matrixx master mix içeren ilk bireysel tüpe eklenir. Hava kabarcığı oluşturmadan, tüp içinde pipetle yaklaşık beş kez aşağı yukarı hareket ettirilerek hızlıca karıştırılır.Ardından, 50 µL hücre süspansiyonlu saf Matrixx karışımını 96 kuyucuklu bir hücre kültür plağının uygun kuyucuğuna pipetleyin. Kuyucuğun kenarına nazikçe 150 µL hücre kültür medyumu ekleyerek BD saf matrisin aktivasyonunu başlatın. Hücrelerin enkapsülasyonu için uygulanan bu adımları kalan kuyucuklar için tekrarlayın.Bu adımların hızlıca gerçekleştirilmesi gerektiğini ve tüm enkapsülasyon prosedürünün, bir sonraki kuyucuğa geçmeden önce tek bir kuyucuk için tamamlanması gerektiğini unutmayın. Sekiz kuyucuğun tamamına ekim yapıldıktan sonra, hücreleri 30 dakika boyunca bekletin. 30 dakika sonra, 200 µL'lik bir pipet kullanarak, pipet ucunu saf matriks yatağına değmeyecek şekilde kuyucuğa yerleştirin ve medyumunu çok nazikçe çekin. Hidrojelin pH değerini dengelemek için medyumun yaklaşık üçte ikisi uzaklaştırılmalıdır.Matrisi bozacağı için vakum aspiratörü kullanmayın. Ardından, saf Matrixx içine kapsüllenmiş hücreler içeren kuyucuğun kenarına çok nazikçe 150 µL taze hücre kültürü medyumu ekleyin. Daha önce gösterildiği şekilde, medyumun üçte ikisini uzaklaştırın ve kalan kuyucuklara taze medyum ekleyin.Her bir kuyucuktaki hücre kültürü medyasını her 48 saatte bir taze kültür medyasıyla değiştirin. Ocar beş hücreleri, prosedürde gösterildiği şekilde kapsüllendi. Protokol temsilcisi 3D render görüntüleri; 1, 3, 5 ve yedinci günlerde saf matris içinde kapsüllenen ve kültüre edilen OR beş hücrelerini göstermektedir.Böylece size OCar5 over kanseri hücre hattının, Pure Matrixx adı verilen sentetik bir matris içinde kültürde nasıl enkapsüle edileceğini göstermiş olduk. Pure Matrixx kullanırken, bu protokolün OCar5 hücre hattı için optimize edildiğini fark etmek önemlidir. Her araştırmacının, protokolü kendi özel hücre hattına göre optimize etmesi ve ince ayarlar yapması gerekecektir.Besiyeri değişimleri yaparken, matris yatağının çok hassas olması nedeniyle onu bozmamaya dikkat etmeniz çok önemlidir; asla aspiratör kullanmayın ve her zaman pipet kullanın. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için çok teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada anlatılan mezotel klirensi tayini floresan ile işaretlenmiş hücreler ve zaman atlamalı video mikroskopi görselleştirmek ve kantitatif yumurtalık kanseri çok hücreli sferoidler ve mezotel hücre tek katmanlarının etkileşimleri ölçmek için yararlanır. Bu test yumurtalık kanseri metastaz erken adımları modeller.

In vitro Mezotelyal Gümrükleme Assay o Yumurtalık Kanseri Metastaz Erken Adımlar modeller

Mitoz geçiren kanser hücrelerinde fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite canlı konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir. PJ-34 eradike insan meme kanseri MDA-MB-231 mitoz İlave sentrozom barındıran hücreler. Normal iki odak mitoz farklı olarak, ekstra-sentrozom PJ-34 varlığında iki kutup mili kümelenmiş değildi.

Anormal Mitoz ile İlişkili Hücre Ölümü Canlı Kanser Hücreleri Konfokal Görüntüleme Uyacakları

Doku mühendisliği fibroblast türevli doğal matris epitel hücre çoğalmasını ve farklılaşmasını destekleyen bir stromal alt-tabakayı üretmek için gelişmekte olan bir araçtır. Burada tümör hücre biyolojisi farklı stromal hücre tiplerinin etkisini değerlendirmek için bu yöntemi uygulayarak bir protokol sunulmuştur.

Kanser Hücre Invasion Uygulama ile Tümör Stromal mikroçevresinin Doku Mühendisliği

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Burada, karın içi yağ dokusunda ısı üretimi için lipitleri tüketen ve obez farelerde enerji dağılımını artıran katabolik hücrelerin kapsüllenmesi için bir protokol sunuyoruz.

Yağ Dokusu Depolarında içine Nakli Enkapsülasyon termojenik Preadipositler

Bu yöntem, kanser hücresinin sferoidlerden çevredeki bir 3B matrise invazyonunu değerlendirir.  Sferoidler, asılı damla kültürü yöntemi ile üretilir ve daha sonra bazal membran malzemeleri ve tip I kollajenden oluşan bir matrise gömülür.  Spheroidlerin istilası daha sonra izlenir.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

Burada, anti-kanser terapötiklerine yanıt olarak tek hücreleri uzunlamasına izlemek için uzun süreli hızlandırılmış mikroskopi yöntemini açıklıyoruz.

Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Burada, doğrudan/dolaylı ilişkileri monosit ve kollajen bozulması, bağışıklık hücre işe alım, hücre gibi sonuçlar ile çalışma olarak birincil meme kanser hücrelerinin de Morfoloji çözümlenecek bir üç boyutlu kültür yöntemi açıklamak işgali ve promosyon inflamasyon kanserle ilgili.

Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

Droplets tarafından Başlığı Hücre Kapsülleme

Öğrenin, PuraMatrix hidrojel kullanarak CAR5 yumurtalık kanseri hücrelerini kapsülleme ve 3D kültür ortamında mikrometastatik nodülleri taklit eden yapılar oluşturma yöntemini.

Kanser Hücrelerinin PuraMatrix Kapsülleme

Daha fazla video keşfet