Name: KLRG1 tetramer Üretim için Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Öğrenin KLRG1 tetramer üretim protokolünü bakteriyel kültür ve IPTG indüksiyonu kullanarak. Bu yöntem immünolojik araştırmalarda ligand-reseptör etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr. Naidenko refolding koşulları optimize yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, araştırma hibe AI58181 tarafından desteklenen Laurent Brossay. Cindy Banh NIH NRSA F31 AI080230 tarafından desteklenmektedir. Stephanie Terrizzi ve Cindy Banh bu çalışmaya katkıda bulunur.

İçerme Organları Hazırlanması <ol><li> TB 4 x 500 ml'lik şişeler İnokülasyon her bir gecede KLRG1 plazmid inşa ifade bakteri kültürü ile 50 mcg / ml carbenicillin ve kloramfenikol içeren. OD 600 nm dalga boyunda 0.6 Å ulaştığında, 37 ilavesi ile 0.4 M IPTG neden ve kültür sallayarak ek bir 4 saat inkübe ° C </li><li> Hasat edilen hücrelerin tabanda tampon pH = 8.0 (50 mM Tris-HCl,% 25 (W / V), sukroz, 1 mM EDTA, 10 mM DTT) süspanse edin. Not: Bu aşamada pelet dondurulabilir. </li><li> Polipropilen beher bakteriyel resuspensions en fazla 60 ml Havuzu. Gerekli TE tamponu, pH 8.0 ile 60 ml ayarlamak ve karışımı yarım hızda karıştırın. </li><li> Karışımı karıştırarak için açılan bilge ekleyin: lizozim (son = 1 mg / ml), MgCl2 (son = 5 mM), 2 mg DNAz Ben 75 mM NaCl, Triton-X100 (son =% 1), DTT (% 50 gliserol içerdiği son = 10 mM). </li><li> 1.5 dakika süreyle buz üzerinde çözüm sonikasyon ve 10 dakika için 5,000 RPM lizatları santrifüj 4 ° C <ol class="lalpha"><li> Süpernatant Durusu. </li><li> 15 ml yıkama tamponu pH = 8.0 (50 mM Tris-HCl,% 0.5 Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li> Pelet tamamen yeniden süspanse kadar buz üzerinde, 1.5 dakika için çözüm sonikasyon. </li><li> 4 10 dakika için 5,000 RPM örnekleri Santrifüj ° C </li><li> Yıkama 5 kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> TE Tampon 4 ml Triton X-100, santrifüj ve tekrar süspansiyon olmadan yıkama tamponu ile 5b tekrarlayın. </li><li> 30 ila 100 mg / ml konsantrasyonda ıslak ağırlık dahil organları bulamacı ve TE tampon mağaza alın. </li></ol> KLRG1, Refolding <ol><li> Tampon pH refolding 1 L = 8.0 (0.4 M Arginin-HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0.2 mM PMSF, 3 EDTA-proteaz inhibitörü tablet, 5 mM GSH ve 0.5 mM GSSG) ve soğuk 4 ° C karıştırma iken. </li><li> Dahil organları katlama karışımın içine enjeksiyon için hazırlayın: protein konsantrasyonu son 2 3 mcM böylece her 5 10 0.25 0.5 mcM konsantrasyon ile enjeksiyon yapmak için idealdir. <ol class="lalpha"><li> 7 M GnHCl dahil organları bulamaç 50 mg hacmi 10 mM β-mercaptoethanol eritin. </li><li> Tutun 37 dahil organları / GnHCl karışımı ° C için 30 - 40 dakika ve vorteks her 5 dakikada tam bir erime sağlamak için (bulamaç tamamen erimiş olacak). </li><li> 4 mikrosantrifüj 30 dakika maksimum hızda Santrifüj ° C ve 15 ml santrifüj tüpüne süpernatantı aktarın. Küçük siyahımsı pelet herhangi bir transfer değil. </li></ol></li><li> Enjeksiyon tampon (3 M GnHCl, 10 mM NaAcetate pH 4.2,10 mM EDTA) ile ses seviyesini ayarlayın. </li><li> 1 ml seyreltilmiş dahil organları her saat enjekte edilir. Enjekte zaman, yüksek hızda karıştırın 2 saniye arasında her damla damla 1 ml seyreltilmiş dahil organları damla ekleyin. Enjeksiyonu yapıldığında, düşük hızda karıştırın. </li><li> 4 düşük hızda karıştırarak gecede Devam ° C </li></ol> Refolding Reaksiyonlar konsantrasyonu <ol><li> Millipore s protokolünü takiben, bir Amicon kullanarak önceden filtrelenmiş (0.22 mikron filtreli) refolding reaksiyon 1 L konsantre Hücre ve ~ 10 ml YM10 NMWL 10K ultrafiltrasyon membran (Millipore) Karıştırmalı. </li><li> ≤ 2 ml Konsantre bir Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li></ol> KLRG1 tetramer saflaştırılması <ol><li> 4 AKTAFPLC Kur ° C GE Healthcare kılavuzları göre. </li><li> Boyut dışlama kromatografisi ile bir Sephacryl S-200, 16/60, yüksek çözünürlüklü 20 mM HEPES sütun (GE Healthcare) ve 150 mM NaCl kullanarak KLRG1 monomer formu arındırın. (Bakınız Şekil 1). </li><li> Centriplus kullanarak 1 ml Konsantre YM-10 10K MWCO (Millipore). </li><li> KLRG1 monomer biotinylate Avidite s protokole göre Bira enzim kullanın. </li><li> Serbest biotin 2 boyut dışlama kromatografisi ile elimine edilir. </li><li> KLRG1 molekülü KLRG1 monomer 4 katlı molar aşırı PE konjuge streptavidin (BD Biosciences) ile karıştırılarak tetramerized. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"></a> Şekil 1 AKTA FPLC boyut dışlama kromatografisi. Temsilcisi olumlu sonuçlar KLRG1 refolded. Monomer ayırma (83,52 ml), dimer (56,36 ml) ve refolded KLRG1 multimer (36,26 ml) form grafiğini gösterir. 94,25 ml zirve tampon değişimi temsil eder.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

Bu protokol, bu biotinylate arındırmak için nasıl gösterildiği ve tetramerize KLRG1. KLRG1 tetramer flow sitometri KLRG1 ligandlar etiketlemek için kullanılabilir. Refolding koşulları her protein için ampirik olarak test edilmesi olsa da, diğer C-tipi lektin benzer bir protokol kullanılarak tetramerized olabilir. Problar, C-tipi lektin reseptörleri yetim ligandlar olarak tetramerized proteinleri kullanarak potansiyel olarak tespit edilebilir.

<table><tbody><tr><td>BirA Enzimi ve Tamponu</td><td>Biyotinilasyon Kiti</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini Proteaz İnhibitör Tabletleri, EDTA içermeyen</td><td>Reaktif</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>Amicon Karıştırmalı Hücre</td><td>Ekipman</td><td>EMD Millipore</td><td>Model #8400</td><td>veya eşdeğeri</td></tr><tr><td>YM10 NMWL 10K ultrafiltrasyon membranı</td><td>Filtrasyon Malzemesi</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>15 ml YM10 konsantratör</td><td>Filtrasyon Malzemesi</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>Ekipman</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-200 16/60 yüksek çözünürlüklü kolon</td><td>Ekipman</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Strepavidin PE</td><td>Reaktif</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>veya eşdeğeri</td></tr></tbody></table>

klrg1 tetramer Üretim için protokol

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Öldürücü hücre lektin-benzeri reseptör G1 (KLRG1) C tipi lektin-benzeri süperailesinin ait bir tip II transmembran glikoprotein inhibitör reseptör. KLRG1 bir monomer olarak ve bir disülfit bağlantılı homodimer olarak var. Bu iyi korunmuş reseptör, en olgun ve en yakın zamanda aktif NK hücreleri gibi efektör / bellek T hücrelerinin bir alt kümesi bulunur. KLRG1 tetramer yanı sıra diğer yöntemleri kullanarak, E, K, ve R-cadherins KLRG1 ligandlar olarak tespit edilmiştir. Bu Ca 2 + bağımlı hücre-hücre adezyon molekülleri, hücre-hücre etkileşimleri, bir transmembran bir etki alanı ve aktin hücre iskeletinin bağlı bir sitoplazmik etki alanı için sorumlu beş kaderin tekrarlar içeren bir ekstrasellüler etki oluşur. KLRG1 tetramer Üretimi KLRG1 ligandlar belirlenmesi için gerekli idi. KLRG1 tetramer immün yanıt ve doku bütünlüğünü düzenleyen rolleri cadherin ve KLRG1 oyun aydınlatmak için de eşsiz bir araç.

Bu protokol KLRG1 ligandların analizi için güçlü bir araçtır KLRG1 tetramer, üretim açıklamaktadır.

KLRG1 tetramer Üretim için Protokol

Killer hücre lektin benzeri reseptör G1 (KLRG1), C tipi lektin benzeri süper ailesine ait tip II transmembran glikoprotein inhibitör reseptördür. ...

Merhaba, Brown Üniversitesi Moleküler Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'ndeki Lauren Parce laboratuvarından Stephanie Resi ben. Bugün size K LRG one Tetramerlerinin üretimi için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda K LRG one koherent etkileşimlerini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Öncelikle, uygun antibiyotikler içeren dört adet 500 mililitre TB tamponlu erlene K LRG one plazmid yapısını eksprese eden bakterileri inoküle edin ve 37 °C'de çalkalayarak büyütün. OD600 değeri 0.6'ya ulaştığında, 0.4 molar IPTG ekleyerek T7 promotörü aracılığıyla ekspresiyonu indükleyin ve kültürü 37 °C'de çalkalamaya devam ederek dört saat daha inkübe edin. Dört saatlik inkübasyonun ardından bakterileri santrifüj tüplerine aktarın ve kültürleri 4 °C'de 3000 RPM ile 20 dakika boyunca santrifüjleyin.Gerektiğinde, pelletler daha sonra kullanılmak üzere bu aşamada -80 °C'de dondurulabilir. Hasat edilen hücreleri 30 mL Resus süspansiyon tamponunda yeniden süspande edin. Ardından, bakteriyel Resus süspansiyonlarını polipropilen bir beherde 60 mL hacme ulaşana kadar birleştirin.Gerekirse, toplam hacmi ek TE tamponu (pH 8) ile 60 mililitreye tamamlayın ve karışımı bir ısıtıcı karıştırıcı üzerinde yarı hızda karıştırın; bu esnada birleştirilmiş Resus süspansiyonu karıştırılırken şu çözeltileri karışıma damla damla ekleyin: Lizozim, magnezyum klorür, DNase I ve TRITON X 100. Ve son olarak DTT.Çözeltiyi, %30 genlikle ultrasonik konvertörlü bir sonikatör kullanarak ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Çözeltiyi buz üzerinde 1,5 dakika boyunca sonikasyonla parçalayın ve lizatı 4 °C'de 10 dakika boyunca 5.000 RPM'de santrifüjleyin, ardından süpernatanı dökün ve 15 mililitre yıkama tamponu ekleyin. Pelet tamamen resüspanse olana kadar sonikasyon işlemini daha önce olduğu gibi tekrarlayın ve santrifüjlemeyi yeniden gerçekleştirin; yıkama, sonikasyon ve peletleme adımlarını beş kez tekrarlayın.Son olarak, peleti Triton X 100 içermeyen yıkama tamponu kullanarak yeniden süspande edin. Bir kez daha santrifüjleyin ve dört mililitre TE tamponu içinde yeniden süspande edin. Bunlar inklüzyon cisimciklerinizdir.İnklüzyon cisimciklerini ıslak ağırlık üzerinden nicelendirin. İnklüzyon cisimciği bulamacı, 30 ila 100 mg/mL konsantrasyonlardaki stok tamponlar içinde 4 °C'de saklanabilir. İnklüzyon cisimcikleri hazır olduğunda, artık refolding işlemi için hazırlıklara başlayabilirsiniz.Bir litrelik taze Refolding tamponu hazırlayarak ve soğutmak için dört derece Celsius'ta düşük hızda karıştırarak yeniden katlanma prosedürüne başlayın. Ardından, inklüzyon cisimciklerinin yeniden katlanma tamponuna enjekte edilmesi için yedi adet enjeksiyon hazırlayacaksınız. İlk olarak, inklüzyon cisimciği süspansiyon stokunu, yedi molar guine hydrochloride artı 10 millimolar beam mercaptoethanol içeren ve toplam hacmi 1,4 mililitre olan bir mikro santrifüj tüpü içerisinde, 37 derece Celsius'taki bir su banyosunda 30 ila 40 dakika boyunca eritin.Her beş dakikada bir vorteksleme yapın. Bulamaç berraklaştığında, eritme işleminin tamamlandığını anlayacaksınız.Eritilmiş karışımı, dört santigrat derecede, bir mikro santrifüjde maksimum hızda 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, küçük siyahımsı peletten herhangi bir miktar toplamamaya dikkat ederek süpernatantı 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Enjeksiyon için hacmi, enjeksiyon tamponu ile yedi mililitreye tamamlayın. İlk olarak, katlanma karışımının karıştırma hızını yükseltin. Ardından bir mililitre seyreltilmiş inklüzyon cisimciği ekleyin.Her damla arasında sadece iki saniye olacak şekilde damla damla ekleyin. Her enjeksiyon arasında bir saat bekleyerek, her seferinde bir mililitre seyreltilmiş inklüzyon cisimciği ekleyin. Karıştırma hızını tekrar düşüğe getirin.Dört santigrat derecede düşük hızda karıştırmaya gece boyunca devam edin. Proteinler böylece konsantrasyon ve saflaştırma işlemine hazır hale gelecektir. Yeniden katlanmış KLRG one tetramerlerini konsantre etmeye başlamak için.Öncelikle reaksiyonu 22 µm'lik bir filtre ile ön filtreleme işleminden geçirin. Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak, bir Millipore Amicon karıştırmalı hücre ve 10 kDa nominal moleküler ağırlık sınırına sahip bir ultrafiltrasyon membranı kullanarak reaksiyonu bir litreden yaklaşık 10 mL'ye konsantre edin. Daha sonra, Millipore 10 kDa moleküler ağırlık kesim noktalı bir ultrafiltrasyon membranı kullanarak hacmi 2 mL veya daha altına gelecek şekilde daha fazla konsantre edin.Kromatografi sisteminizi üretici talimatlarına göre kurun. Biz, yüksek çözünürlüklü bir kolon kullanarak, dört santigrat derecede GE healthcare ACTA hızlı protein sıvı kromatografi sistemini kullanıyoruz. K lrg'nin monomer formunu, 20 millimolar heaps ve 150 millimolar sodyum klorür içeren tamponla boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırın.Enjekte edilen hacim, kolondaki toplam jel hacminin %2'sinden daha az olmalıdır. KLG1 monomerini üretici talimatlarına uygun olarak, bir Millipore 10 kilodalton moleküler ağırlık kesim sınırına sahip ultrafiltrasyon membranı kullanarak bir mililitrelik nihai hacme kadar daha fazla konsantre edin. Tetramer elde etmek için boyut dışlama kromatografisi kullanarak daha önce yapıldığı gibi saflaştırma işlemi gerçekleştirerek serbest biyotini uzaklaştırın.KL LRG one monomerlerini, dört kat fazla molariteye sahip FICO rine konjuge streptavidin tetramerleri ile karıştırın; bunlar artık reseptör ligandlarının işaretlenmesi için kullanılabilir. Bu grafik, soldan sağa doğru, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak yeniden katlanmış K lrg one proteinlerinin ayrımının pozitif sonucunu göstermektedir. Pikler, K LRG one'ın multimer, dimer ve monomer formlarını örneklendirmektedir.En sağdaki pik, tampon değişimini temsil eder. Yeniden katlanma koşullarının her protein için ampirik olarak test edilmesi gerekse de, diğer C tipi lektin reseptörleri benzer bir protokol kullanılarak tetramer haline getirilebilmeli ve böylece diğer ligandların potansiyel olarak tanımlanması sağlanmalıdır. Bu prosedürü uygularken KLRG tetramerinin nasıl oluşturulacağını size göstermiş olduk.İndüksiyon seviyelerini kontrol etmeyi ve yeniden katlanma koşullarına kesinlikle uymayı hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

a-protocol-for-the-production-of-klrg1-tetramer

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Kindlins İntegrinlerin yoluyla hücre yapışması temel vardır ama bunların çalışmalar bakteriyel konaklarda rekombinant olarak bunları ifade karşılaşılan zorluk engel olmuştur. Burada bakulovirüs ile enfekte olmuş böcek hücrelerinde bunların verimli üretimi için yöntemleri tarif eder.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

CRISPR ile ilişkili protein Cpf1, özel olarak tasarlanmış bir CRISPR RNA (crRNA) yardımıyla, istenilen noktalarda çift sarmallı DNA'yı parçalayıp yapışkan uçlar üretebilir. Bu karakteristiğe dayanarak, bir DNA montaj standardı (C-Brick) oluşturuldu ve kullanımını ayrıntılandıran bir protokol burada açıklandı.

Cpf1&#39;i Kullanarak C-Brick DNA Standart Montajı İçin Protokoller

Burada, dize derleme gRNA (STAgR), klonlama mevcut CRISPR/Cas9 yaklaşıyor kolayca gRNA vektörler multiplex için bir yöntem. STAgR basit, etkili ve özelleştirilebilir gRNA çoğullama yapar.

Dize birleştirme gRNA için özelleştirilebilir bir protokol klonlama (STAgR)

Bu iletişim kuralı tanımlamak ve reseptör-ligand etkileşimleri ölçmek için kullanılan bir muhabir sistem kurmak açıklar.

Reseptör-Ligand etkileşimleri çalışmak için bir BW muhabir sistemi

Burada sunulan HJ çözünürlüğü çalışma için tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi gerçekleştirmek için bir protokoldür. Dissosilasyon sabitlerini belirlemek için iki renkli alternatif uyarma kullanılır. Tek renkli zaman atlamalı smFRET daha sonra HJ çözünürlüğünden önce çalışma süresi dağılımını elde etmek için gerçek zamanlı dekolte tahlillerinde uygulanır.

HOLLIday Kavşak Çözünürlüğünün GEN1 Tarafından Gerçek Zamanlı İncelenmesi için Tek Moleküllü Förster Rezonans Enerji Transfer Yöntemleri

Burada, pLEXSY sistemini kullanarak eGFP genini stabil bir entegre transgen olarak eksprese eden L. panamensis ve L . donovani suşlarını oluşturmak için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Transfekte edilen parazitler, seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve her iki türde de en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar, ilaç tarama testlerinde daha fazla kullanılmak üzere seçildi.

eGFP'nin Yapısal Ekspresyonu ile Leishmania Tür Suşlarının Gelişimi

Bu makale, Modüler Klonlamanın (MoClo) polisistronik operonların klonlanması için nasıl uyarlanabileceğini gösteren adım adım bir protokol sunmaktadır.

In-Cloning araç setini kullanarak Modüler Klonlama (MoClo) ile Polisistronik Operonların Standartlaştırılmış Modüler Montajı

Bu çalışma, Escherichia coli ve memeli hücrelerinde insan enolaza-1'in (hENO1) belirli bölgelerinde laktil-lizin (Klac) ve süper klasör GFP'nin (sfGFP) belirli bölgelerinde genetik kod genişlemesini kullanan bir yöntem geliştirdi.

E. coli ve memeli hücrelerinde genetik kod genişletmesiyle siteye özgü lizin laktilasyonu

Öğrenin KLRG1 tetramer üretim protokolünü bakteriyel kültür ve IPTG indüksiyonu kullanarak. Bu yöntem immünolojik araştırmalarda ligand-reseptör etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araç sunar.

KLRG1 tetramer Üretim için Protokol

Daha fazla video keşfet