Mozaik Zebra balığı Transgenesis Enhancer Diziler değerlendirilmesi için

Merhaba, ben Pennsylvania Üniversitesi Hücre ve Gelişim Biyolojisi Bölümü'ndeki Shannon Fisher'ın laboratuvarından Erica Kgi. Ben Chris Weber, aynı zamanda Fisher Lab'den. Ve ben Shannon Fisher.

Bugün size zebra balığı transgenezini kullanarak geliştirici elementlerin işlevini analiz etmek için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü, iskelet gelişiminde önemli olan genlerin transkripsiyonel düzenlemelerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Aday genleri çevreleyen kodlamayan dizileri tanımlamak için, uc SC genom tarayıcısında bir parça olarak erişilebilen algoritma hızlı eksilerini kullanıyoruz. Öncelikle iskelet gelişimi sırasında ifade edilen genlerle ilgileniyoruz, ancak aynı yaklaşım erken gelişimde ifade edilen herhangi bir geni incelemek için de kullanılabilir. Burada gösterilen örnekte, korunmuş dizileri tanımladık.

İnsan tampon genini çevreleyen aralıkta, bitişik genlere olan tüm aralığı inceliyoruz ve kodlamayan dizinin yaklaşık olarak en üst %5'ine karşılık gelen düşük boyuta özgü bir log skoru kesimi belirliyoruz. Dizileri seçtikten sonra, insan genomiğinden her bir diziyi amplifiye etmek için primer üç kullanarak primerler tasarlayın, korunan bölgeyi ve her iki tarafta 30 veya daha fazla baz çiftini amplifiye etmek için DNA primerleri seçilmelidir. İnsan genomik DNA'sını kullanarak ilgilenilen bölgeyi yüksek kaliteli polimeraz ile çoğaltın, amplifiye edilmiş ürünü bir ekspresyon vektörüne klonlamak için standart laboratuvar moleküler biyoloji prosedürlerini kullanın.

Bu protokolde kullanılan vektör PG wc FOS GFPA ağ geçididir. Hedef vektör. Vektör oluşturmanın ardından transpoze edilmesi söylendi.

Transpozisyon için gerekli enzim ilk olarak deneysel enjeksiyonlardan önce Ambion'dan M mesajı M makine kiti ve PGB 600 plazmidi kullanılarak in vitro olarak transkribe edilir. Fare çorabı gibi bilinen bir güçlendirici enjekte ederek her bir transpoze partisini etkinlik açısından test edin. 10 arttırıcı.

Enjeksiyonlara hazırlanmak için, mikroenjeksiyon için kullanılan iğneleri bir Sutter P 97 mikropipet çektirme üzerindeki 1,2 milimetre dış filament kılcal camdan çekin. Temiz bir tıraş bıçağı ve mikrometre kaydırağı ile sağlam corion'lara nüfuz etmek için keskin bir konik ile güçlü bir uç veren bir program kullanın. Uçları stereo mikroskop altında elle yaklaşık 15 mikrometre dış çapa kadar kırın.

İğneler kapalı bir tutma kabında bir gün boyunca saklanabilir. Zebra balığı popülasyonunu, mikro enjeksiyonları gerçekleştirmeden bir gün önce standart koşullar altında 14 saat ışıkla düzenli bir aydınlık karanlık döngüde tutun. Küçük üreme tanklarında zamanlanmış çiftleşmeler için balık hazırlayın.

Işık döngüsü başladıktan kısa bir süre sonra mikro enjeksiyonların sabahında tank başına üç dişi veya iki erkeği paralel sıralar halinde yerleştirin. Yumurta üretimi için erkekleri ve dişileri temiz sistemle arıtılmış suda birleştirin. Balıkları sık sık kontrol edin ve iyi senkronize edilmiş partiler elde etmek için yumurtaları üretimden sonraki birkaç dakika içinde toplayın.

Sabahları taze balık gruplarını lateks ampul ile donatılmış geniş delikli beş ve çeyrek inçlik bir cam pipetle birleştirmeye devam ederek yumurta üretimini iki ila üç saat sürdürün. Toplanan embriyoları, 50 embriyoluk gruplar halinde kısmen embriyo ortamı ile doldurulmuş 60 x 15 milimetre Petri kaplarına sıralayın. Her yemeğin kapağında toplanan zamanı işaretleyin.

Toplanan her bir embriyo kavraması için, yumurta koleksiyonları arasında enjekte edilmeyen kontrol için 50 embriyodan oluşan bir tabak saklayın. Aşağıdaki malzemeleri bir mikro fuge tüpünde karıştırarak taze enjeksiyon solüsyonları hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. Enjeksiyon iğnelerini tutma tabaklarına yerleştirin ve 1,5 ila iki mikrolitre enjeksiyon solüsyonu ile doldurun.

Pipetleme ile her iğnenin geniş ucuna 500 nanolitrelik damlalar damlatılır. Sıvı, kılcal hareket yoluyla uca çekilecektir. Her enjeksiyon çözeltisi için en az iki iğne hazırlayın.

Doldurulmuş iğneyi bir pnömatik pico pompasının veya benzer bir basınç enjektörünün el tipi iğne tutucusuna yükleyin. Üreticinin talimatlarına göre yapılandırılmış ve bir nitrojen tankına bağlanmıştır. Tipik olarak 120 milisaniyelik bir enjeksiyon süresi olan bir mikrometre slaytı üzerinde mineral yağa atılan damlacıkların çapını ölçerek enjeksiyon hacimlerini kalibre edin.

20 PS'lik bir basınçla, altı ila 10 x büyütmede bir stereo mikroskop kullanarak yaklaşık bir nanolitrelik bir damlacık vereceğim. Embriyoyu bir çift ince forseps ile yerinde tutun ve enjeksiyon iğnesini corion'dan bir hücre veya erken iki hücre aşamasında bir embriyonun yumurta sarısına sabit bir basınçla itin, iğne ucunu blastomerlerin hemen altındaki yumurta sarısına yerleştirin, yaklaşık bir litre enjeksiyon solüsyonunu dışarı atın ve enjeksiyon tamamlandıktan sonra 200 embriyoya eşit veya daha büyük enjekte ettiğimiz her yapı için iğneyi geri çekin. Döllenmemiş yumurtaları, hasarlı embriyoları ve başarısız enjeksiyonları veya küfürlerde fenol kırmızısı olmayan embriyoları çıkararak embriyoları sıralayın.

Daha sonra embriyoları ve embriyo ortamını gözlemler için uygun zamana kadar 28.5 santigrat derecede inkübe ediyoruz. Şimdi size zebra balığı embriyosunda dokuya özgü GFP ekspresyonu paternleri üreten arttırıcı elementlerin bazı temsili sonuçlarını göstereceğiz. sırasında kemik veya kıkırdakta ifade edilen genleri inceliyoruz.

İşte döllenmeden üç gün sonra kraniyal yüz kıkırdağında ekspresyonunu düzenleyen acan geninin yukarısındaki bir güçlendirici eleman örneği. İşte bu sefer kemik hücrelerinde ekspresyonu düzenleyen tampon geninden başka bir güçlendirici. Tanımladığımız birçok güçlendiricinin beş gününde, gene göre konum ile ifadenin düzenlenmesi arasında çok az korelasyon bulduk.

Test edilecek dizileri seçerken, bir güçlendiricinin bir genin yukarı veya aşağı akışında veya bu embriyoda görüldüğü gibi intronlardan birinde yüzlerce kilobaz olabileceğini hatırlamak önemlidir. Dizilerin önemli bir kısmı dokuya özgü ekspresyonu düzenliyor gibi görünmemektedir. Bunlar genellikle çok az floresan gösterir veya ektopik ekspresyon için iki yaygın bölgede, epidermis ve iskelet kasında birkaç dağınık hücreye sahip olabilir.

Zebra balığında mozaik transgenezi yoluyla dizi koruma yoluyla potansiyel geliştirici elementleri nasıl tanımlayacağınızı ve işlevlerini nasıl test edeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken, enjeksiyonlar için DNA ve RNA'nızın kalitesini incelemek önemlidir. Ayrıca, enjekte edilen tüm embriyolarınızı dikkatlice incelediğinizden emin olun, özellikle de yalnızca küçük bir satış grubunda ifade bekliyorsanız.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.