Name: Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Öğrenin, insan kanından izole edilen nötrofilleri uyarıp Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakları (NET) oluşturmayı ve immünofloresan ile taramalı elektron mikroskobisi kullanarak bunları görselleştirmeyi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Insan kanı PMN İzolasyon Antikoagülan olarak EDTA veya heparin (10 U / ml) ile 24 ml insan kanı hakkında kullanın. <ol><li> 6 ml, 15 ml Falcon tüp Histopaque 1119 ekleyin ve dikkatle üst katmanı 5 ila 7 ml tam kan. </li><li> Frenleme olmadan 20 dakika boyunca 800 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Sarımsı ve açık üst katman aspire edin ve atın ve taze Falcon tüpler içine granülositler içeren alt kırmızımsı faz transfer. </li><li> 300 x g. 10 dakika PBS ve santrifüj Falcon tüpleri dolum hücreleri yıkayın </li><li> Bu arada% 100 Percoll, 2 ml 10x PBS, 18 ml Percoll karıştırılarak bir solüsyon hazırlanır. 1x PBS,% 85,% 80,% 75,% 70 ve% Percoll 65 4 ml çözümler hazırlıyoruz. </li><li> Katmanlama 2 ml azalan birbirlerinin üstüne her yüzde bir Percoll degrade ile 2 Falcon tüpleri hazırlayın. </li><li> Santrifüj süpernatantı kaldırdıktan sonra, 4 ml PBS pelet ve tekrar süspansiyon tortulaşmış hücreleri birleştirir. </li><li> Her degradelerin üzerine tabanda dikkatli katman 2 ml. </li><li> Frenleme olmadan 20 dakika boyunca 800 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj üst katmanı kaldırmak ve% 65 katmanlı en PBMC&#39;ler ile,% 85 katmanlı kadar yeni Falcon tüpler içine beyaz kalan interphases toplamak sonra. </li><li> 300 x g. 10 dakika PBS ve santrifüj ile Falcon tüpleri dolum hücreleri yıkayın </li><li> PBS 2ml supernatant ve tekrar süspansiyon tortulaşmış hücreleri (genellikle&gt;% 95 PMN.) Çıkarın. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li></ol> 2. Aktive PMN <ol><li> Steril bir 13 mm yuvarlak cam kapak kayma (1,5) her bir kuyunun içine koyarak 24-iyi bir hücre kültürü tabak hazırlayın </li><li> Tohum 2 x 10 500μl RPMI 5 hücreleri de başına (% 2 insan serum albümin içeren) ve 37 CO 2 inkübatör 1s inkübe ° C. </li><li> Bu arada RPMI 600 nM PMA çözüm hazırlamak ve 100μl de ortalama hücreleri ekleyin. CO 2 inkübatör 4 saat 15 dakika inkübe 37 ° ° C. </li><li> % 4 (son konsantrasyon) PBS içinde çözünmüş paraformaldehid hücreleri saptamak. </li></ol> PMA bir pozitif kontrol olarak hizmet veren ve bugüne kadar NET oluşumunu uyarmak için en güçlü bir ajandır. Alternatif olarak, patojenlerin diğer uyaranlara veya co-ekimi NET indüksiyonu için kullanılabilir. Zaman kursu devam ederken ek paralel olarak hazırladığı numuneler NET oluşumu ilgili durumu kontrol edilebilir. Sabit olmayan hücrelere Sytox Yeşil (Invitrogen) gibi olmayan bir permeant DNA boya eklenirse, sadece ekstraselüler DNA tespit edilecektir. Yeni NET&#39;ler oluşumu şekilde her zaman noktası için, Sytox varlığı bozulmuş olduğundan bir paralel örnek kullanılmalıdır. 3. NET immunolabeling tarafından tespit NET&#39;ler fiksasyon sonra bile çok kırılgan olduğu ve büyük bir dikkatle manipüle edilebilir aksi takdirde çoğunluğu hazırlanması sırasında kaybolan alacak. <ol><li> 24 kuyu kültür plaka takılı hücreleri ile cam kapak fişleri kavisli bir iğne ile kenarında yukarı kaldırarak dikkatlice çıkarın ve ince bir forseps ile ele geçirmek. PBS bir damla ters kapak kayma koyun. Bu bir test tüpü standı kapsayan bir Parafilm kağıda yapılabilir. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın. </li><li> Triton X-100 RT az 1 dakika hücreleri permeabilize için% 0.5 &#39;lik bir düşüş aynı şekilde kapak fişleri inkübe edin. 1 dakika için 3 kez PBS içinde yıkayın. </li><li> Parafilm ve ıslak mendil ile nemli bir oda hazırlayın. Lay kapağı engelleme tampon (% 5 eşek serum) bir damla baş aşağı kayar ve 37 ° 30 dakika inkübe ° C. </li><li> Tampon engelleme primer antikorlar, örneğin ms anti Histon ve rb anti nötrofil elastaz, sulandırınız. </li><li> Primer antikor bir damla üzerine tampon engelleme doğrudan nemli odasında fişleri kapağı ve 37 az 1 saat süreyle inkübe transfer ° C </li><li> PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayınız. </li><li> Ikincil antikorlar, örneğin dk anti ms Cy2 ve tampon engelleme dk anti-rb Cy3 sulandırınız. </li><li> Sekonder antikoru bir damla üzerine nemli odasına fişleri kapağı ve 1 saat boyunca inkübe 37 aktarma ° C. </li><li> PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayınız. Leke DNA UV eksitasyon veya Draq5 kadar kırmızı uyarma için ihtiyaç ve dist ile iki kez yıkamak Hoechst 33.342 (1 mcg / ml) ile 5 dakika ya, floresan mikroskopi seçenekleri bağlı. su. </li><li> Bir cam slayt üzerine Mowiol 20μl damla ayarlayın ve hücreleri ile kapak fişleri ters monte. Hücreleri kapak kayma ve slayt arasında olmak zorunda. Mowiol, açılan kapağı açılan kayma yerleştirilmiş homojen kalınlıkta ince bir tabaka oluşturacak. Normalde, örnek basın gerek yoktur. Olmayan daldırma lens kullanmak istiyorsanız, numunenin incelenmesi için hazır.Daldırma lensler ile mikroskobik inceleme için, Mowiol örnek kenarında katılaşmış kadar yaklaşık 1 saat için örnek kuru sağlar. </li></ol> 4. Hazırlanması NET&#39;ler Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) <ol><li> Hücreleri,% 2,5 glutaraldehid ile 24 plaka cam kapak bordroları düzeltmek Mesaj. </li><li> 24 kuyu kültür plaka hücreleri içeren cam kapak fişleri çıkartın ve bir damla su baş aşağı koymak. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın. </li><li> 30 dakika süreyle% 0,5 OsO4 ve inkübe içeren 24-kuyu hücre kültürü plakası kapak fişleri geri aktarın. </li><li> 24 kuyu kültür plaka hücreleri içeren cam kapak fişleri çıkartın ve bir damla su baş aşağı koymak. 3 kez 5 dakika boyunca bu gibi yıkayın. </li><li> 30 dakika süreyle% 1 tannik asit ve inkübe içeren 24-kuyu hücre kültürü plakası kapak fişleri geri aktarın. </li><li> Adımları tekrarlayın 4,2-4,4 </li><li> Aşağıdaki rejimi (5 dk her) aracılığıyla dehydrate: <ul><li> % 30 etanol </li><li> % 50 etanol </li><li> % 70 etanol </li><li> % 80 etanol </li><li> % 90 etanol </li><li> % 100 etanol </li><li> % 100 etanol </li><li> % 100 etanol </li></ul></li><li> Kritik nokta kurutma makinesi ve kuru örnekler sığar kapağı aktarın. </li><li> Coat yüzey ince bir tabaka evaporatör kullanılarak 5nm platin / karbon tabaka ile örnek </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Izolasyon yöntem genellikle,% 95 daha yüksek bir saflığa sahip unstimulated yaşayabilir nötrofil verir. Stimülasyon sonrasında farklı zaman noktalarında sabit, NETosis düzleşme hücre, nükleer lobülleri kaybı, granül kaybı ve nükleer (yani histon) ve granül (yani artan bir örtüşme yol açar çekirdeği bütünlüğünü sırasında morfolojik değişiklikler immün protokol sırasını gösterir nötrofil elastaz) boyama. Bu protokol, nötrofil ile patojenlerin özel etkileşimlerini analiz etmek için bir başlangıç ​​noktası olarak hizmet verebilir. Bu etkileşim, Taramalı Elektron Mikroskobu için hazırlık protokolü kullanılarak daha ayrıntılı olarak disseke edilebilir. NET Floresans NET bileşenleri (mavi = DNA, kırmızı = histon, yeşil = nötrofil elastaz) lekeli uyarılan nötrofillerin örnek. NET lokalizasyonu, nükleer DNA ve histon yerelleştirme ve nötrofil elastaz için granül desen görüntüleri yanı sıra, göstermektedir. SEM PMA stimülasyon Olmayan uyarılır ve PMA-uyarılan nötrofillerin gösteren tarama elektron mikrografı. Stimülasyon sonra, nötrofil düzleştirmek ve NET&#39;ler üretmek. SEM NET&#39;ler ve Shigella NET&#39;ler sıkışıp Shigella bakterileri Yüksek çözünürlüklü SEM görüntü.

<ol><li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.</li>
<li>Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+capture+and+kill+Candida+albicans+yeast+and+hyphal+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms.</a> Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).</li>
<li>M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+amazonensis+promastigotes+induce+and+are+killed+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps.</a> PNAS. 106, 6748-6753 (2009).</li>
<li>Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+expression+allows+the+pathogen+group+A+Streptococcus+to+escape+killing+in+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps.</a> Curr Biol. 14, 396-400 (2006).</li>
<li>Fuchs, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs.</a> Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).</li>
<li>Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+spontaneous+apoptosis+of+neutrophil+granulocytes+by+the+intracellular+parasite+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major.</a> J Immunol. , 169-898 (2002).</li>
</ol>

Sağlanan protokolü önemli saflık olmayan uyarılan nötrofillerin izolasyon, indüksiyon NET oluşumu ve NETosis sırasında morfolojik değişiklikleri analiz sağlayacaktır. Itina ile örneklerin tutarken, yani en gevşek bağlı NET&#39;ler kaybına neden olacak ağır yıkama koşullarına kaçınarak, farklı stimülasyon koşullar altında NET formasyonu (süresi, uyaran) miktarı mukayese edilebilir. Nötrofil / patojen etkileşimleri, uyaranlara dizisi, diğer bağışıklık hücreleri ile etkileşim: Bu bağlamda, verilen protokoller daha sofistike senaryolar analiz yöntemleri kurmak için bir başlangıç ​​noktası olarak hizmet verebilir.

nötrofil ekstrasellüler tuzaklar: onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Periferik kan lökosit nötrofil granülositler en bol bulunan bir grup. Profesyonel fagositler olarak, yutma bakteri ve hücre onları öldürmek phagosome ile antimikrobiyal granül sigorta. Biz nötrofil mikroorganizmaları öldüren ek bir yolu olduğunu bulundu: Etkinleştirme üzerine, birlikte ekstrasellüler lifler oluştururlar granül proteinleri ve kromatin serbest bağlama patojenler. Bu yeni yapılar, veya nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), virülans faktörleri aşağılamak ve bakteri 1, 2 ve parazitler 3 mantar öldürmek. NET&#39;ler yapısal omurga DNA ve DNases varlığı hızla bozulmuş. Böylece, DNases ifade bakteri 4 daha öldürücü. TEM, SEM, immünofloresan ve canlı hücre görüntüleme teknikleri birleştirerek bağıntılı mikroskopi kullanılarak stimülasyon üzerine, nötrofil çekirdekleri şekillerini kaybeder ve ab-ve heterokromatin homojenize gösterebilirim. Daha sonra, nükleer zarf ve granül membranlar NET bileşenleri karıştırma izin parçalanır. Son olarak, NET&#39;ler hücre zarı kesmeleri olarak yayımlanır. Bu hücre ölüm programı (NETosis) apoptoz ve nekroz farklıdır ve NADPH oksidaz 5 Reaktif Oksijen Türleri nesil bağlıdır. Nötrofil ekstrasellüler tuzakları akut inflamasyon bölgelerinde bol miktarda bulunmaktadır. NET&#39;ler bağlama mikroorganizmaların ki, yayılmasını önlemek ve virülans faktörleri düşürebilir ve böylece nötrofil hatta ömrü ötesinde antimikrobiyal fonksiyonu yerine getirmek için izin patojenleri öldürmek için yüksek antimikrobiyal ajanların yerel yoğunlaşmasını sağlamak, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının bir formu olarak görünür. Kanıtlar artmaktadır, ancak bu NET&#39;ler olan hastalıklar da katılıyor oto-immün sendromlar kısırlık 6 aralığı. Biz, insan periferik kan 7 ila nötrofil Granülositler izole ve NET&#39;ler oluşturmak için onları teşvik etmek için yöntemleri açıklanmaktadır . Ayrıca ışık ve elektron mikroskobu NET&#39;ler görselleştirmek için protokolleri içerir.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), patojen bakteriler, mantarlar ve parazitler mücadele için önemli bir doğuştan gelen bağışıklık mekanizması. Burada insan kan nötrofil granülositler izole etmek ve NET&#39;ler oluşturmak için bunları etkinleştirmek yöntemleri açıklanmaktadır. Biz ışık ve elektron mikroskobu NET&#39;ler görselleştirmek için hazırlama teknikleri mevcut.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Nötrofil granülositler, periferik kandaki en bol lökosit grubudur. Profesyonel fagositler olarak bakterileri yutarlar ve onları yok ederler...

Nötrofil hücre dışı tuzakları veya NET'ler, sitoplazmik ve granül proteinlerinin yanı sıra kromatin salınımı yoluyla patojenlerin nötrofiller tarafından temizlenmesini sağlayan, yakın zamanda tanımlanmış bir mekanizmadır; nötrofiller, patojenleri hapseden hücre dışı lifler oluşturur. Bu videoda, granülositler insan tam kanından histopath yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile izole edilmektedir. Nötrofiller ise granülosit preparasyonundan per coral gradyanı ile izole edilir.Lam üzerine ekilen ve kimyasal veya biyolojik uyaranlar kullanılarak ağ oluşturması için stimüle edilen hücreler, ardından ağların görselleştirilmesi amacıyla immün etiketleme veya EM için işlenir. Merhaba, ben Max Planck Enfeksiyon Biyolojisi Enstitüsü mikroskopi merkezinden Christian Gosman. Bugün size insan kanından nötrofil granülositlerini saflaştırma ve bunları nötrofil hücre dışı tuzakları veya NET'ler oluşturmaları için stimüle etme prosedürünü göstereceğiz.Ardından, NET'leri immünofloresan ve taramalı elektron mikroskobu ile görselleştireceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, NET oluşumuna yol açan mekanizmaları incelemek ve NET'lerin antimikrobiyal özelliklerini analiz etmek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Bu protokole, dört adet 15 mL'lik Falcon tüpünün her birine altı mililitre histo 1119 hazırlayarak laminer akışlı kabinde başlayın. Her bir santrifüj tüpündeki histo üzerine dikkatlice beş ila yedi mililitre tam kan ekleyerek tabakalama yapın ve yaklaşık 800 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüj işlemi tamamlandığında frenin kapalı olduğundan emin olun. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın.Tüp, yukarıdan aşağıya doğru belirgin şekilde ayrılmış dört katman içerecektir. Bunlar; eritrositlerin bulunduğu koyu kırmızı bir katman, bazı eritrositlerle birlikte nötrofil granülositlerin bulunduğu açık kırmızı bir katman, lökosit ve serumun bulunduğu beyazımsı sarı bir katman ve şeffaf sarı bir serum katmanıdır.Yine lamine akışlı kabin içerisinde çalışın. Üstteki sarı tabakayı dikkatle aspire etmek için vakum sistemine bağlı pipeti kullanın. Ardından, her tüpteki granülositleri içeren kırmızımsı fazı bir pipet yardımıyla yeni bir falcon tüpüne aktarın.Ardından, granülositleri yıkamak için tüpleri PBS ile doldurun. Daha sonra, hücreler dönerken yaklaşık 300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek onları çöktürün. 18 mililitre per co ile iki mililitre 10x PBS'yi karıştırarak %100'lük bir per coll çözeltisi hazırlayın.Ardından, %100'lük koll çözeltisi ve 1x PBS kullanarak her birinden dört mililitre olacak şekilde %65, 70, 75, 80 ve 85'lik çözeltiler hazırlayın. Bu çözeltileri kullanarak, her bir tüpe her çözeltiden ikişer mililitre dikkatlice katmanlayarak per core gradyanları hazırlayın. Her tüpe iki mililitre %85'lik çözeltiyi ekleyerek başlayın.Ardından %85'lik solüsyonun üzerine, iki mililitre %80'lik solüsyonu dikkatlice katman şeklinde ekleyin. %65'lik solüsyon en üstte kalacak şekilde, her bir solüsyonu azalan konsantrasyon sırasıyla ikişer mililitre eklemeye devam edin. Çökelmiş lökositleri çeker ocak altında santrifüjden çıkarın.Süpernatantı atın ve hücreleri bir mililitre PBS içinde yeniden süspande edin. Ardından, yeniden süspande edilen hücreleri yeni bir tüpte birleştirin. Yeniden süspande edilen granülositlerin iki mililitresini, Percoll gradyanlarının her birinin üzerine dikkatlice katmanlar halinde ekleyin.Ardından, santrifüj sonrası frenin kapalı olduğundan emin olarak yaklaşık 800 ×g hızda 20 dakika boyunca santrifüjleyin. En yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle ara yüzeyler net bir şekilde görünmelidir. Periferik kan mononükleer hücrelerini veya pBMC'leri içeren üst tabakayı ve %65'lik tabakanın büyük bir kısmını atın.Her gradyandan %65-70 arayüzünü, %70-75 arayüzünü ve %80-85 arayüzünü birlikte toplayarak yeni, temiz falcon tüplerine aktarın. Tüpü PBS ile doldurarak hücreleri yıkayın ve santrifüj sonrası hücreleri çöktürmek için yaklaşık 300 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve çökmüş polimorfnükleer lökositleri veya PMN'leri iki mililitre PBS içinde yeniden süspande edin.Bu aşamada, preparasyondaki hücrelerin %95'i veya daha fazlası mns olacaktır. Bir hemositometre kullanarak hücre sayıları belirlenir, ardından 15 milimetre boyutundaki kuyucuklara sahip kültür plaklarına yerleştirilmiş steril yuvarlak lameller üzerine 500 mikrolitre RPMI içinde 200.000 hücre ekleyin. Hücrelerin lamellere tutunmasını sağlamak için 37 derece Celsius sıcaklıktaki %5CO2 inkübatöründe bir saat boyunca inkübe edin.İstenen stimülanı içeren 100 µL RPMI ekleyin. Zaman serisi deneyi için, her bir koşullu zaman noktası için en uzun stimülasyon süresinden başlayarak stimülanı sırayla ekleyin. RPMI içinde 600 nM PMA ekleyerek bir pozitif kontrol hazırladığınızdan emin olun.Ayrıca, her bir koşul veya zaman noktası için, yalnızca RPMI ekleyerek bir negatif kontrol hazırlayın; stimülasyon sırasında 37 °C'de bir CO2 inkübatöründe dört saate kadar inkübe edin, NET oluşumu parlak alan mikroskopisi kullanılarak izlenebilir. Stimülasyondan kısa bir süre sonra, çekirdekler formlarını belirgin şekilde değiştirir. LOE'lerini kaybederek yuvarlaklaşırlar ve ardından genişlerler; istenen zaman noktasında her bir kuyucuğa oda sıcaklığında 600 µL %8 paraformaldehit çözeltisi ekleyin.Final konsantrasyonu %4'e getirmek için, immün markalama amacıyla iki ila dört saat inkübe edin. Yaklaşık 15 milimetre çapında, üç kere sekiz delikli bir test tüpü rafının üzerine bir paraform sayfası yerleştirin. Kuyucuklar oluşturmak için, kuyucukları PBS ile doldurun.Kültür plakasındaki paraldehit üzerinden her bir lameli kaldırmak için kavisli bir iğne kullanın. Ardından, pens yardımıyla lameli kavrayın ve paraform üzerindeki bir damla PBS yüzeyine ters çevirerek yerleştirin. Bu aşamada, nötrofil ekstrasellüler tuzakları oldukça hassastır ve hücre kaybını önlemek için manipülasyon sırasında büyük özen gösterilmelidir.Beş dakika sonra, lamelleri yeni PBS damlalarına aktararak yıkama işlemini tekrarlayın. Toplam üç yıkama olacak şekilde işlemi tekrarlayın. Ardından, hücreleri permeabilize etmek için lamelleri bir dakika boyunca oda sıcaklığındaki %0.5 Triton X 100 damlasına aktarın.Ardından, her bir yıkama işlemi bir dakika sürecek şekilde PBS ile üç kez yıkayın. Boyama işlemine beraberindeki yazılı protokole uygun olarak devam edin. İnkübasyon ve yıkama adımlarının her birini, lamel camı paraform üzerinde ters çevirerek gerçekleştirin.Hücreler boyandıktan sonra, bir lam üzerine 20 µL MO damlatın ve hücreler lam ile lamel arasında kalacak şekilde lamelleri ters çevirerek yerleştirin. Bir saat sonra, MOY katılaşmış olmalı ve hücreler mikroskobik analiz için hazır hale gelmelidir. İmmerziyon objektifleri ile, hücreleri bir kimyasal çeker ocak altında taramalı elektron mikroskobu için hazırlayın.Cam lamlar üzerindeki hücreleri, 24 kuyucuklu bir plaka içerisinde PBS içinde %2,5 glutaraldehit ile 30 dakika boyunca sabitleyerek fiksleyin. İnkübasyon sırasında, yaklaşık 15 milimetre çapında sekizli deliklerden üç adet bulunan bir test tüpünün üzerine paraform bir tabaka yerleştirin.Kuyu oluşturmak için kuyucukları distile su ile doldurun. Lamellerin her birini glutaraldehit çözeltisinden kaldırmak için kavisli bir iğne kullanın.Ardından penset kullanarak lamelden tutun ve lameli Paraform yıkama alanındaki distile su damlalarına aktarın. Her biri beş dakika sürecek şekilde toplam üç yıkama işlemini tekrarlayın; lamelleri, distile su içerisinde %0,5 osmiyum tetroksit içeren hücre kültürü plakası kuyucuklarına geri aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Lamelleri plakadan çıkarın ve daha önce olduğu gibi distile su ile üç kez yıkayın.Ardından, her kuyucuğunda 0,5 mililitre %1 tannik asit bulunan 24 kuyucuklu plakaya geri koyun ve 30 dakika inkübe edin. Sonrasında, lamelleri beşer dakikalık sürelerle üç kez yıkayın. Ardından osmiyuma tetroksit ile fiksasyonu ve yıkama işlemini tekrarlayın.Ardından, test tüpünün ağzını kapatın. Yeni bir parafilm parçası kullanın. Hücreleri, sırasıyla 30, 50, 70, 80, 90 ve 100'lük etanol çözeltilerinde beşer dakikalık bir dizi inkübasyonla dehidre edin.Ve son olarak, bir kez daha %100 ethanol içinde. Rafı, ethanol dolu bir numune teknesinin içine daldırın. Numunelerin kurumadığından emin olarak, lamel camları hızla metal rafa yerleştirin.Ardından numune teknesini soğutulmuş bir kritik nokta kurutucusuna veya CPD'ye aktarın. CPD haznesini sıvı CO2 ile doldurun. Sıvı seviyesini korumak için giriş valfini tamamen açık bırakın ve haznenin tabanında CO2 fazının altında bir etanol fazı görünür görünmez alt kısımdaki tahliye valfini açın.Etanolün çoğunu uzaklaştırmak için haznenin yaklaşık 30 dakika boyunca yıkanmasına izin verin. Yıkama işleminden sonra giriş valfini kapatın ve sıvı seviyesini teknenin üst kısmının hemen altına indirin.CPD'nin ceketinden sıcak su geçirin. Sıcaklık 36 ile 38 °C'ye ulaştığında ve basınç 1,200 pounds per square inch seviyesine yükseldiğinde, sıvı-gaz sınır hattı kaybolacak ve numuneler kritik noktanın üzerine çıkacaktır. Kritik noktaya ulaşıldığında, gazı beş dakikalık bir süre boyunca yavaşça tahliye edin.Yoğuşmayı önlemek için sıcaklık 40 °C civarında tutulmalıdır. Bu süre zarfında kapıyı açın ve tekneyi çıkarın. Dehidratasyon solventinin buharlaştığını doğrulayın.Kapak lamlarını, alüminyum numune tutucunun yapışkanlı kısmına doğru yönüyle yapıştırın ve yüksek çözünürlüklü kaplama sistemine aktarın. Kaplama silindirini 2 × 10⁻⁵ mbar basınç seviyesine kadar vakumlayın. Ardından cihazı 1,8 kV ve 70 mA değerlerine ayarlayın ve platon karbon tabakası 5 nm kalınlığa ulaşana kadar tabaka kalınlığını bir kuvars kristali kalınlık ölçer ile izleyin.Yüksek çözünürlüklü kaplama sisteminin kaplama silindirini tahliye edin. Ardından, pens kullanarak numuneleri kaplamacıdan çıkarın. SEM haznesini normal basınca getirin.Kapağı açın. Ardından numuneleri numune tutucuya yerleştirin ve hazne içindeki havayı tahliye edin. SEM analizi için.Stimülasyon sonrası farklı zaman noktalarında fikse edildiğinde, NETosis sırasındaki morfolojik değişiklikler immunofloresan mikroskopi ile gözlemlenebilir. Bu şekilde, DNA mavi renkte, histon-DNA kompleksi kırmızı renkte ve nötrofil elastaz ise [renk eksik/belirtilmemiş] renkte gösterilmiştir.NETozis'in ilk aşamasında, bir granül markörü yoğunlaşmış çekirdeklerde sadece nükleer periferide yeşil renkte görünür. Daha sonra, kromatin daha fazla dekondanse olduğunda, çekirdeğin büyük bir kısmı dekondanse netlerde boyanır. Boyama homojendir.Bu görüntü paneli, NETozis ile birlikte meydana gelen nükleer ve granüler boyamanın örtüşmesini detaylandırmaktadır. Bu taramalı elektron mikrografı, stimüle edilmemiş nötrofilleri göstermektedir; Ella bakterisi ile stimülasyon sonrası nötrofiller yassılaşır ve nötrofil hücre dışı tuzakları üretir. Burada bir jel bakterisinin tuzaklar tarafından yakalandığı görülmektedir.Jel benzeri bakteriler, ağlarda bulunan enzimler tarafından immobilize edilir ve öldürülür. Size az önce, insan kanından nötrofil granülositlerin nasıl izole edileceğini ve nötrofil hücre dışı tuzaklarının oluşumunu tetiklemek için bunların nasıl stimüle edileceğini gösterdik. Bunlar daha sonra immunofloresans veya taramalı elektron mikroskobu ile analiz edilebilir.Bu prosedür uygulanırken, ağların fiksasyondan sonra bile çok kırılgan olduğunu unutmamak önemlidir. Ağ kaybını en aza indirmek için, uyarılmış nötrofillerin bulunduğu lamelleri kuyucuklardan çıkarır ve prosedürün büyük bir kısmını lameller üzerindeki tampon damlalarının yüzeyinde gerçekleştiririz. Bu durumda dahi, örneklerin nazikçe ve yavaşça hareket ettirilmesi önemlidir.Her şey bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

neutrophil-extracellular-traps-how-to-generate-and-visualize-them

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, nötrofiller tarafından dışarı atılan hücre dışı DNA bileşenleri olan nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) floresan boyanmasını göstermektedir. Bu teknik, kanser hücreleri ve NET'ler arasındaki yapıştırıcı etkileşiminin görselleştirilmesini sağlar.

Nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin floresan mikroskobu: kanser hücreleri ve NET'ler arasındaki yapışkan etkileşimi gözlemlemek için bir teknik

Bu videoda, nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) oluşturmak ve izole etmek için kullanılan bir in vitro teknik gösterilmektedir. Nötrofiller periferik kandan izole edilir ve NET üretmek için forbol miristat asetat (PMA) ile uyarılır. İnkübasyon sırasında, nötrofiller, granüler sitoplazmik proteinlerle karıştırılmış yoğunlaştırılmış kromatin içeren NET'leri serbest bırakmak için bir hücre ölümü (NETosis) sürecinden geçer.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzakları Oluşturmak için İn Vitro Teknik

Bu video, anti-nötrofil sitoplazmik antikorlar içeren hasta serumu kullanılarak önceden etiketlenmiş nötrofillerde nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin indüksiyonunu ve görselleştirilmesini göstermektedir. Ayrıca, geçirimsiz bir DNA boyası ve floresan mikroskobu kullanmak, NET'lerin görüntülenmesini sağlar.

Önceden Etiketlenmiş Nötrofillerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İndüksiyonu ve Görselleştirilmesi

Makrofaj hücre dışı tuzakları yeni açıklanan bir varlık vardır. Bu makale confocal mikroskobu yöntemleri üzerinde konsantre ve nasıl olduklarını vitro ve in vivo akciğer örneklerinden görüntülenir.

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Burada, postoperatif peritoneal lavaj sıvı, kurtarılan insan düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), büyük nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) üretmek ve verimli bir şekilde daha sonra grow ücretsiz tümör hücreleri tuzak bir yöntem mevcut.

Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Burada, nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETTs) ve işletim NETQUANT, immünororesans görüntüleri NTs quantification için tam otomatik bir yazılım seçeneği oluşturmak için bir protokol salıyoruz.

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Bu iletişim kuralı bir son derece hassas ve yüksek üretilen iş nötrofil hücre dışı tuzak (NET) tahlil için ex vivo NET oluşumu miktar yarı otomatik ayirt üç boyutlu confocal mikroskobu tarafından açıklanır. Bu iletişim kuralı NET oluşumu ve bozulma farklı uyaranlara sonra değerlendirmek için kullanılan ve potansiyel NET hedefli tedaviler çalışma için kullanılabilir.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETs) uyarılmış nötrofil granülositler tarafından oluşturulan üç boyutlu yapılardır. Son yıllarda NET'lerin çok çeşitli hastalıklara karıştıkları ortaya çıkmıştır. Dokudaki NET'lerin saptanması tanısal bir önemi olabilir, bu nedenle NET bileşenlerinin etiketlenmesi için standart protokoller gereklidir.

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Burada in vitro nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) indüksiyonu ve analizi için bir protokol sunulmaktadır. DNA, katelisidin (LL37) ve enzim aktivitesinin nicelleştirilmesi, benzer kontrollü koşullar altında mikrobiyal ve kimyasal uyaranlar tarafından indüklenen NET'lerin bileşimindeki ve morfolojisindeki değişkenliği gösteren veriler vermiştir.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ve immünofloresan genellikle görselleştirmeleri için kullanılır. Bununla birlikte, çeşitli boyama protokolleri vardır ve çoğu durumda sadece bir doku türü incelenir. Burada, fare ve insan dokusunda NET'lerin boyanması için genel olarak uygulanabilir bir protokol oluşturuyoruz.

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Öğrenin, insan kanından izole edilen nötrofilleri uyarıp Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakları (NET) oluşturmayı ve immünofloresan ile taramalı elektron mikroskobisi kullanarak bunları görselleştirmeyi.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Daha fazla video keşfet