Name: Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-03T16:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Öğrenin, canlı zebra balığı embriyolarında bireysel nöron ve sinir kresti hücrelerinin hareketini ve aktin dinamiklerini floresan konfokal mikroskopi ile görüntüleme yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NS042228 MCH Olympus FV1000 konfokal UW Zooloji Bölümü (PI Bill Bement) için bir NIH paylaşılan enstrümantasyon hibe S10RR023717 ile satın alındı ​​R01 NIH tarafından desteklenmiştir. Erica Andersen, Namrata Asuri ve Matthew Kil bu kağıt eşit katkıda bulunmuştur.

1. Enjeksiyon slaytlar ve görüntüleme slaytlar Meclisi Enjeksiyon slaytlar: <ol><li> Sylgard silikon elastomer üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. </li><li> Bond üç standart cam mikroskop Sylgard kullanın kesiştiği uzun kenarları yan yana düzenlenmiş olan diğer iki slaytlar, üstüne bir slayt istifleme birlikte slaytlar. Üst slayt dik açılı bir köşesinde ya da üst ve alt slaytlar arasında "duvar" oluşturur. </li><li> Sylgard gecede ayarlanmış olsun. Bu slaytları yeniden kullanılabilir. </li></ol> Görüntüleme slayt: <ol><li> Odasına mikroskop sahnede slayt sahibinin uygun şekilde standart bir cam mikroskop lamı (75mm x 25mm x 1mm) aynı boyutta kesilmiş paslanmaz çelik dikdörtgenler kullanın. 1,5 cm delik dikdörtgenin merkezinde kesilir. </li><li> Sylgard metal dikdörtgen yapıştırmayın 22 mm 2 lamel. Iyice lamel mühür yeterli Sylgard kullanın. Inverted mikroskop görüntü, embriyolar bu lamel üzerine monte edilebilir ve alttan görüntülenmiş. </li><li> Sylgard gecede ayarlanmış olsun. Bu slaytları yeniden kullanılabilir ve kullanımlar arasında% 70'lik alkol ile temizlenmelidir. </li></ol> 2. DNA yapılarının hazırlanması Transgen bir doku belirli bir şekilde ifade etmek için, faiz gen hücre özel bir organizatörü arkasında klonlanmış. Biz zebrafish neurogenin1 gen (3.1ngn1) bir cis-düzenleyici element 2 ya da duyusal nöronların veya nöral krest hücrelerinden ifade sürücü sox10 gen (-4.9sox10) 3, sırasıyla kullanın. Hücre ve membran dinamikleri görselleştirmek için, sitoplazmik ifade veya membran lokalize fluorophores. F-aktin dağıtım için, kodlayan DNA mCherry (UtrCH-mCherry) erimiş utrophin calponin homoloji etki alanı ifade eder. UtrCH mCherry biyosensör prob aktin dinamikleri 1 ile müdahale olmadan F-aktin görselleştirme sağlar. Biz rekombinasyon tabanlı klonlama stratejisi 4 ve zebrafish Tol2kit 5 sağlanan vektörler Invitrogen Gateway kullanarak bu DNA yapıları oluşturur. <ol><li> Zebrafish Tol2kit 5 Multisite-Gateway Teknolojisi ve vektörler kullanarak ifade vektör (ler) oluşturun. Plazmidler pT2KXIGDin gelen Tol2 omurgası içerir. </li><li> QIAfilter Plazmid Midi Hazırlık kiti (QIAGEN A.Ş.) ve steril su Zehir ile plazmid DNA arındırın. DNA enjeksiyon için lineerleştirilmiş olması gerekmez. </li></ol> 3. DNA yapıları Enjeksiyon <ol><li> Su,% 0.2 fenol kırmızısı (enjeksiyon sırasında görünüm için) nihai konsantrasyonu 10-50 mg / ml DNA DNA sulandırınız. </li><li> Iğne doldurun ve kalibre: yaklaşık 1 ul DNA çözümü ile çekilmiş bir kılcal iğne Geri dolgu ve iğne tutucu (bir Picospritzer) enjeksiyon aparat takın. , Ince bir forseps kullanarak, iğne ucu açıklığı yaklaşık 10 mm çapında olduğu gibi kapalı ucunu kırmak. Oküler mikrometre ile mineral yağ damlacık çapı ölçülür. Nl hacmi yaklaşık 1 Bir damla almak için baskı süresi ayarını ayarlayın. </li><li> E3 embriyo orta (5mM NaCl, 0.17mM KCl, CaCl 2 0.33mM, 0.33mM MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7.0) 1-hücreli aşamada embriyoların toplayın. </li><li> Enjeksiyon slayt ve konumu, üst ve alt slaytlar arasında oluşan dik açı köşesinde embriyoların yaklaşık 30-60 embriyoların transferi. Embriyoların, yüzey gerilimi tarafından slayt düzenlenen E3 böylece en çıkarın. </li><li> Bükülmüş bir diseksiyon pin hücre enjeksiyonu slayt duvara böylece embriyolar döndürmek için kullanın. </li><li> Yumurta sarısı ve embriyo tek bir hücreye, embriyonun koryon üzerinden iğne kılavuzu mikromanipülatör kullanın. 0.5-1 nl DNA çözümü hücre içine enjekte edilir. </li><li> 28.5 E3 ve inkübe Petri kapları içine embriyo transferine ° C Gerekirse, geliştirme, düşük sıcaklıkta embriyolar inkübe edilmesiyle önlenebilir. </li></ol> 4. Görüntüleme için Montaj embriyolar <ol><li> Embriyolar görüntüleme (amaçlar için yaklaşık 14-17 saat sonrası döllenme) için istenilen yaş ulaşmadan önce yaklaşık bir saat ince forseps ile embriyoların chorions çıkarın. </li><li> Floresan ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak etiketli hücreler embriyo seçin. Biz uzun çalışma mesafesi ve yüksek büyütme kombinasyonu nedeniyle Nikon AZ100 kapsamı 4X objektif (40X büyütme) kullanın. </li><li> Bir embriyo yaklaşık 50 ul E3% 0.2 Tricaine anestezi (10X konsantrasyonda) içeren bir mikrofuge'de tüp içine yerleştirin. </li><li> Tricaine seyreltilmesi% 0.02 nihai konsantrasyonu 10 mM HEPES (42 ° C sıcaklıkta tutulan), 500 ul E3% 1 düşük erime noktası agaroz ekleyin. </li><li> Hemen bir agaroz açılan embriyo transferigeniş bir delik cam pipet kullanarak görüntüleme slayt lamel. </li><li> Agaroz sertleşir önce etiketli hücreleri ile bölgenin alt lamel (nöral krest hücreleri ve spinal duyusal nöronlar için aşağı dorsolateral sırt aşağı) karşı aşağı bakacak şekilde, embriyonun konumu. </li><li> Görüntüleme odasının birleştirin: Coat bir tarafı plastik, metal görüntüleme slayt silikon vakum yağ ve yapıştırmayın ile bir halka (2 cm dış çapı 3 mm, yüksek). Gres yağıyla halka diğer tarafında ceket. </li><li> E3 içeren 10 mM HEPES ve% 0.02 Tricaine odasının doldurun. Halka iyi yağlanmış yüzey 22 mm 2 lamel iliştirilmesi odasının üst Seal. </li></ol> 5. Olympus FV1000 konfokal IX81 mikroskobu ile hücre davranışlarının 4D görüntüleme Görüntü elde detayları mikroskop sistemi özelliklerine bağlıdır. Burada Olympus FV1000 konfokal mikroskop için geçen zaman satın alma süreci tanımlamak. Zeiss LSM 510 konfokal sistemi 6 time-lapse edinimi için önceki vallahi protokol bakın. <ol><li> Mikroskop sahnede slayt sahibinin görüntüleme odasına yerleştirin ve iletilen ışık altında 10X veya 20X objektif kullanılarak embriyo odaklanmak. </li><li> 60X objektif (1.2 veya daha yüksek NA) geçin ve Epifloresans ile etiketli hücre odaklanmak. Biz ya immersiyon yağı (UPLSAPO 60xO NA 1.35) ya da su altında kalacak (UPLSAPO 60xW NA 1.20) lens kullanabilirsiniz. </li><li> FV yazılımı (Sür 1.7c), lazer tarama XY tekrar başlamak için tıklayın. </li><li> Satın alma ayarları ve görüntü elde etme denetimleri (lazer çıkış, tarama hızı, HV, kazanç ve ofset seviyeleri) en az (% 25 veya daha düşük), doku hasarı önlemek ve photobleaching azaltmak için lazer güç tutarak sinyal optimize etmek için ayarlayın. </li><li> Z-serisi elde etmek için, adım büyüklüğü ile birlikte, z yığının alt ve üst sınırları belirler. Derinlik simgesi XY Sweep simgesini XY ve Z vurgulanan o kadar meşgul olduğundan emin olun. XYZ Sweep simgesini tıklayarak satın alma başlayın. </li><li> Hızlandırılmış bir zaman serisi elde etmek için, Toplama Ayarlar penceresinde TimeScan başlığı altında bir zaman aralığı ve zaman noktalarının sayısını ayarlamak. XY Sweep simgesini XY (Z) ve T vurgulanan böylece Image Acquisition Kontrol Pencerede Zaman Simgesi tıklayın. XY (Z) T Sweep simgesini tıklayarak satın alma başlayın. </li><li> Alternatif olarak, TimeController bir zaman atlamalı kurmak için kullanılabilir. Büyük veri kümeleri oluştururken bellek ayırma aşmadığı Bu programlama, yararlı olur. Aygıt altında, TimeController pencere açın. Yeni bir görüntüleme Görev oluşturun. Görüntü parametre penceresi açılacaktır. Satın alma ayarlarını güncellemek için FV Durum düğmesini tıklatın. Emin olun Kaydet ve Sil sonlandırın başlığı altında kontrol edilir. Çıktı dosyası adı ayarlayın ve ayarları kaydetmek ve pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın. Loop fonksiyonu, zaman noktalarında istenen zaman aralığı ve sayı ayarlamak için kullanın. Hazır tıklayın ve satın alma işlemini başlatmak için Başlat. Duraklat ve Z-shift fonksiyonları ise görüntüleme yeniden odaklanabilmek için kullanılabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Rakamlar ve film örnekleri, membran hedefli fluorophores veya aktin biyosensör probu ile etiketlenmiş duyusal nöronlar ve nöral krest hücrelerinden tasvir. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 bir Tg (ngn1: GFP-caax) Konfokal görüntüleri (z-projeksiyonları): mCherry-caax DNA 25 pg ngn1 ile enjekte edilen transgenik embriyo. MCherry CAAX etiketler yeşil etiketli tüm Rohon Sakal duyusal nöronlar ile arka planda bir nöron kırmızı (A) (B) yeşil ve kırmızı kanalları C) Birleştirilmiş görüntü. Ölçek çubuğu = 50 mm. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Konfokal z projeksiyonları ~ 20 pg ngn1 ile enjekte edilen embriyolar nöronların:. MCherry-UtrCH DNA A) 16,5 hpf embriyo Rohon Sakal duyusal nöron. F-aktin sinyal büyüme konisi (ok başları) ve yeni kurulan aksonlar boyunca çıkıntılar güçlü B) Nöron 20 hpf embriyonun büyüme konileri dallı periferik akson (ok başları) ve daha olgun merkezi zayıf sinyal güçlü F-aktin sinyali gösteren aksonlar (oklar). Ölçek çubuğu = 50 mm.

<ol><li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
<li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li>
<li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li>
<li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination%3A+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li>
<li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li>
</ol>

DNA enjekte optimum konsantrasyon organizatörü büyüklüğü ve gücü oluşturmak ve ampirik olarak tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir. Transgen ifade enjekte embriyo çok küçük bir oranı çok az neden olurken çok fazla DNA enjeksiyonu, geniş hücre ölümü ile sağlıksız embriyolar yol açabilir. DNA ekspresyon seviyesi hücreden hücreye değişir fluorofor sinyal gücü ile ilişkilidir. Epifloresans altında embriyolar sıralama iken, son derece yüksek seviyede ifade olanlar dahil değildir. Çok parlak görünür etiketli hücreler ...

<table><tbody><tr><td>Tricaine (Etil 3-aminobenzoat metansülfonat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Plazmid Midi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0302-900</td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı embriyolar bireysel nöronlar ve sinir crest hücreler aktin sitoiskelet hücre motilite ve canlı görüntüleme

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Zebra balığı, in vivo geliştirme sırasında görüntüleme hücre davranışları için ideal bir model . Zebra balığı embriyolar dışarıdan döllenmiş ve gelişimin her aşamasında böylece kolayca ulaşılabilir. Ayrıca, doğal ortamda sağlam embriyonun hücre ve moleküler dinamiği yüksek çözünürlüklü görüntüleme, optik netlik sağlar. Biz nöral krest hücrelerinin göç ve nöron akson akıbet ve rehberlik sırasında hücre davranışlarını analiz etmek için canlı bir görüntüleme yaklaşımı kullanıyor. Canlı görüntüleme, hücre hareketi süreçleri düzenleyen mekanizmalar anlamak için yararlıdır. Gibi çıkıntılı aktivite ve moleküler dinamik olarak hücre hareketi detayları, görselleştirmek için, tek tek hücrelerin etiketlemek için avantajlıdır. Zebra balığı, plazmid DNA enjeksiyonu, geçici bir mozaik ifade desenini verim ve diğer hücre etiketleme yöntemleri üzerinde farklı avantajlar sunuyor. Örneğin, transgenik çizgiler genellikle tüm hücre popülasyonlarının etiket ve böylece tek bir hücrenin ince çıkıntılar (veya moleküler dağılımında değişiklikler) görselleştirme gizleyebilir. Buna ek olarak, tek hücreli aşamada DNA enjeksiyonu, daha az invazif ve daha sonraki aşamada boya enjeksiyonu çok daha hassas. Burada bireysel gelişmekte olan nöronların veya nöral krest hücreleri ve görüntüleme in vivo olarak davranışlarını etiketleme için bir yöntem açıklanmaktadır . Biz mozaik transgen ifadesi sonuçları 1-hücreli dönem embriyoların, plazmid DNA enjekte edilir. Vektörlerin hücre özel rehberleri içeren duyusal nöronların veya nöral krest hücrelerinin bir alt kümesi olan ilgi bir gen sürücü ifadesi. Biz membran hedef GFP ile veya canlı hücreleri 1 F-aktin görselleştirme sağlayan bir biyosensör probu ile işaretli hücrelerin örnekler sunuyor. Erica Andersen, Namrata Asuri ve Matthew Kil, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu.

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Zebrafish, in vivo gelişim sırasında hücre davranışlarının görüntülenmesi için ideal bir modeldir. Zebrafish embriyoları dış döllenmeye sahiptir ve bu nedenle kolayca...

Canlı organizmada bireysel hücrelerin davranışlarını görüntülemek için, bir floroforun veya biyosensörün ekspresyonunu yönlendiren hücreye özgü bir promotör içeren plazmid DNA, zebra balığı embriyolarına enjekte edilir. F efektine ve utrophin'in bağlanma domainine dayalı bir biyosensör kullanılarak, efekt dağılımındaki dinamik değişiklikler in vivo olarak görselleştirilir. Yeni döllemiş embriyolar, enjeksiyon lamı boyunca sıralanır ve üst ile alt lamlar arasında oluşan köşeye yerleştirilir.Floroforları veya biyosensörleri kodlayan DNA hücreye enjekte edilir. Ertesi gün embriyolar agaroz içine yerleştirilir.Görüntüleme lamı üzerinde, embriyolar etiketli hücreler aşağı gelecek şekilde yerleştirilir ve hazne bir lameliyle kapatılır. Merhaba, ben Wisconsin Madison Üniversitesi Zooloji ve Anatomi bölümleri ile Mary Hallin Laboratuvarı'ndan Erica Anderson. Ben de Hallin Laboratuvarı'ndan Nam Tauri.Ben Hallin Laboratuvarı'ndan Matt Clay. Bugün size, zebrafish embriyolarında tek tek işaretlenmiş hücrelerin canlı görüntülemesine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, akson uzaması ve nöral krista hücresi göçü sırasındaki hücre hareketliliğini ve aktin dinamiklerini incelemek için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Enjeksiyon lamlarını monte etmek için öncelikle, üreticinin talimatlarına göre cyl guard silikon elastomer hazırlayın. On birim elastomer bazıyla bir birim kürleme ajanını karıştırın.Üç standart cam mikroskop lamını birbirine yapıştırmak için silindir koruyucu kullanın. İki lamı uzun kenarları boyunca yan yana yerleştirin. Üçüncü lama ARD uygulayın ve onu diğer iki lamın üzerine yerleştirin.Slaytlar arasından fazla sızma olmayacak şekilde, slaytları mühürlemeye yetecek kadar cigar kullanın. Herhangi bir fazlalık ertesi gün bir jilet yardımıyla temizlenebilir. Görüntüleme slaytları için SIL korumasının gece boyunca donmasına izin verin.Merkezinde 1,5 santimetrelik bir delik bulunan, standart bir cam mikroskop lamı ile aynı boyutta kesilmiş paslanmaz çelik dikdörtgenler kullanıyoruz. 22 milimetrekarelik bir lamelle (cover slip), syl guard ile çelik dikdörtgene sabitlenmiştir. Hem enjeksiyon lamları hem de görüntüleme lamları yeniden kullanılabilir olup, embriyoları enjekte etmeden önce 70% etanol ile temizlendikten sonra su ile durulanabilir.DNA'yı 10 ila 50 mikrogram/mililitre nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Su içerisinde %0,2 fenol kırmızısı içeren DNA kullanın. Fenol kırmızısı, enjeksiyon sırasında görselleştirmeyi sağlar.Ardından, iğneyi doldurun ve kalibre edin. Apol kapiler iğneyi yaklaşık microliters DNA çözeltisi ile geri doldurun. İğnenin dolmasını bekleyin ve ardından ince bir pens yardımıyla iğneyi enjeksiyon düzeneğinin iğne tutucusuna yerleştirin.İğne ucunu, uç açıklığı yaklaşık 10 mikrometre çapında olacak şekilde kırın. Mineral yağ içindeki damlacığın çapını bir oküler mikrometre ile ölçün. Enjeksiyon hacmini hesaplamak için pico spritzer'ın süre ayarını düzenleyin.Böylece damlacık çapı 0,12 mikrometre veya hacimce yaklaşık bir nanolitre olur. 10 ile 30 milisaniye arası bir süre tipiktir. Tek hücreli evredeki embriyoları E3 embriyo besiyerinde toplayın ve yaklaşık 30 ila 60 embriyoyu enjeksiyon lamına aktarın.Embriyoları üst lamın kenarına hizalayın ve embriyoların yüzey gerilimiyle lama tutunması için E3 ortamının çoğunu bükülmüş bir diseksiyon iğnesi yardımıyla uzaklaştırın. Embriyoları, hücre enjeksiyon lamının duvarına gelecek şekilde döndürün. İğneyi embriyo koriyonundan, vitellustan geçirip embriyonun tek hücresine yönlendirmek için bir mikromanipülatör kullanın.Hücreye 0.5 ila 1 nanolitre DNA çözeltisi enjekte edin. Enjekte edilen embriyoları E3 içeren Petri kaplarına aktarın ve 28.5 °C sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin. Gerekirse, enjeksiyondan sonraki gün embriyolar daha düşük sıcaklıkta inkübe edilerek gelişim yavaşlatılabilir.Embriyolar görüntüleme için istenen yaşa ulaşmadan yaklaşık bir saat önce görüntüleme hazırlıklarını yapın. Koryonları (CORs) ince pens yardımıyla embriyolardan çıkarın. Embriyoların görüntülemesine genellikle döllenmeden yaklaşık 14 ila 17 saat sonra başlarız.Ardından, floresan donanımlı bir diseksiyon mikroskobu kullanarak işaretli hücrelere sahip embriyoları seçin; uzun çalışma mesafesi ve yüksek büyütme kombinasyonu nedeniyle Nikon Z 100 mikroskobunda Forex objektif kullanıyoruz. Bir embriyoyu, yaklaşık 50 µL V3 içeren bir mikrosentrifüj tüpüne yerleştirin. Geniş ağızlı bir cam pipet kullanarak, nihai konsantrasyonu %0,02 trica olacak şekilde trica stoğu ve eritilmiş %1 düşük erime noktalı agaroz ekleyin.Embriyoyu, agar damlası içindeyken agar sertleşmeden önce hemen görüntüleme lamının ön camına aktarın; embriyoyu, işaretli hücrelerin bulunduğu bölge alt ön cama bakacak şekilde konumlandırın. Ardından, görüntüleme haznesini kurun. Plastik bir halkanın bir tarafını silikon vakum gresiyle kaplayın ve metal görüntüleme alanına sabitleyin.Halkanın diğer tarafını gresle kaplayın. Hazneyi 10 millimolar HEPES ve %0,02 Triton X-100 içeren E3 çözeltisiyle doldurun. Halkanın üstteki gresli yüzeyine 22 mm²'lik bir lamelle kapak sabitleyerek hazneyi mühürleyin. Embriyo, bir sonraki bölümde gösterileceği üzere 4D görüntüleme için hazırdır.Görüntüleme detayları, kullandığınız mikroskop sisteminin özelliklerine bağlı olarak değişiklik gösterecektir. Burada, Olympus FB 1000 konfokal mikroskobu için zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleme süreci gösterilmektedir. Zeiss LSM five 10 konfokal sistemi ile zaman ayarlı görüntüleme için önceki JO protokolüne bakınız.Görüntüleme odasını mikroskop tablasındaki lam tutucuya yerleştirin ve 10 x veya 20 x objektif kullanarak embriyoya odaklanın. Geçirgen ışık altında, numerik açıklığı 1.2 veya daha yüksek olan 60 x objektife geçiş yapın ve FV yazılımında epi-floresans ile işaretlenmiş bir hücreye odaklanın. Lazer taramayı başlatmak için xy repeat seçeneğine tıklayın.Bir Z serisi elde etmek için görüntüleme ayarlarını ve görüntüleme kontrollerini optimize edin. Z ekseninin üst ve alt sınırlarını, adım boyutuyla birlikte belirleyin. Görüntüleme kontrol penceresindeki derinlik simgesine tıklayın ve bir zaman serisi (time lapse) elde etmek için XY, Z suit simgesine tıklayarak görüntülemeyi başlatın.Zaman taraması (time scan) başlığı altındaki zaman aralığını ve zaman noktası sayısını ayarlayın. Görüntüleme ayarları penceresindeki başlıkta, görüntüleme kontrol penceresindeki zaman simgesine tıklayın ve XYZT suit simgesine tıklayarak görüntüleme işlemini başlatın. Burada, tekil olarak işaretlenmiş hücrelerin temsili videolarını ve görüntülerini sunuyoruz.Tek tek nöronlar işaretlendiğinde, aksonları diğer işaretli hücreler tarafından kapatılmaz ve böylece aksonlar ve büyüme konileri üzerindeki OD uzantıları net bir şekilde görülür. Bu film, membrana hedefli RFP etiketiyle işaretlenmiş bir duyusal nöronu göstermektedir. Görüş alanının dışına doğru büyüyen, zıt yönlerde iki akson uzatır.Hücre gövdesinden dik olarak uzanan üçüncü bir akson dallar oluşturur. Benzer şekilde, tekil nöral krest hücrelerinin işaretlenmesi, hücre hareketliliği ile ilişkili ince hücresel süreçlerin görüntülenmesine olanak tanır. Burada, iki nöral krest hücresi membrana hedeflenmiş GFP ile işaretlenmiştir.Anterior yönde göç ederken kapsamlı protrusif aktivite sergilerler. Bir popülasyon içindeki komşu hücreler arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için transgenik bir hat içindeki bireysel hücreleri etiketlemek genellikle faydalıdır. Bu görüntü, tüm duyusal nöronlarda stabil GFP ekspresyonuna sahip olan ve yeşil nöronlar arka planında bir nöronu kırmızıya boyamak için RFP etiketini kodlayan DNA enjekte edilmiş bir embriyoyu göstermektedir.Aktin biyosensör probu, hücre gövdesine kıyasla büyüme konilerinde ve yeni oluşmuş aksonlar boyunca dinamik çıkıntılarda daha güçlü bir sinyal etkisi göstermektedir. Daha ileri bir aşamada, sinyal büyüme konilerinde güçlü kalmaya devam ederken, olgun aksonlarda sinyal önemli ölçüde daha zayıftır. Zebrafish embriyolarındaki tek tek işaretlenmiş nöronların ve nöral krist hücrelerinin canlı görüntülemesinin nasıl yapılacağını göstermiş olduk.Bu prosedürü uygularken, DNA'nın toksisiteye veya hücre ölümüne neden olacak kadar yüksek seviyelerde eksprese edilmediği embriyoların seçilmesi önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

live-imaging-cell-motility-actin-cytoskeleton-individual-neurons

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Dying hücreler komşu hücrelerle birlikte daralma bariyer fonksiyonunu bozmadan epitel dokuların ekstrüde. Gelişmekte zebrafish optik netlik epitel yaşam ekstrüzyon görselleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Burada hücresel çözünürlükte larva zebrafish epidermisin neden ve görüntü ekstrüzyon yöntemleri açıklanmaktadır.

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Kaynak: Williams, A. L.,  et al. Gelişimi Gerçek Zamanlı Olarak Görselleştirmek için Çoklu Foton Hızlandırılmış Görüntüleme: Zebra Balığı Embriyolarında Göç Eden Nöral Krest Hücrelerinin Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, bir zebra balığı embriyosundaki nöral krest hücrelerinin göçünü gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlükte görselleştirmek için çok fotonlu hızlandırılmış bir görüntüleme protokolünü göstermektedir.

Çoklu Foton Zaman Atlamalı Görüntüleme Kullanarak Bir Zebra Balığı Embriyosunda Nöral Krest Hücre Göçünü Görselleştirme

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Burada açıklanan protokoller, zebra balığı embriyolarını in vivo bir sistemde kullanarak, ilgilenilen hücre tipinde seçici olarak ifade edilen bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI) ile birlikte uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerinin incelenmesine izin verir.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Gelişmekte olan zebra balığı optik tektumunda mikroglia hücrelerinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için hızlı taramalı konfokal mikroskopiden yararlanan ve bu hücrelerin dinamiklerinin in vivo analizine olanak tanıyan bir yöntem gösteriyoruz.

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak GCaMP kalsiyum göstergelerini eksprese eden transgenik zebra balıklarının beyin bölgelerindeki nöral aktiviteyi incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

In vivo (İn canlı) Kısmen Kısıtlanmış Larva Zebra Balıklarında Duyusal Stimülasyonla İndüklenen Nöral Aktivitenin Konfokal Floresan Görüntülemesi

Zebra balığı larva nöromüsküler kavşağı, sinaptik fizyolojiyi incelemek için çekici bir modeldir. Elektrofizyoloji ve optik görüntüleme dahil olmak üzere birçok deneysel tekniğe uygundur. Burada, dik bir epifloresan mikroskobu altında pHluorin bazlı bir prob kullanarak sinaptik iletimi görüntülemek için bir protokol açıklıyoruz.

Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin, canlı zebra balığı embriyolarında bireysel nöron ve sinir kresti hücrelerinin hareketini ve aktin dinamiklerini floresan konfokal mikroskopi ile görüntüleme yöntemini.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet