Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Tek tek hücrelerin davranışını görüntülemek için, in vivo plazma DNA'sı, bir flora dörtlüsünün veya biyosensörün ekspresyonunu yönlendiren hücreye özgü bir promotör içeren zebra balığı embriyolarına enjekte edilir. Dağılımdaki etkideki dinamik değişiklikler, F etkisine ve utrofinin bağlanma alanına dayalı bir biyosensör kullanılarak in vivo olarak görselleştirilir. Yeni döllenmiş embriyolar enjeksiyon lamı boyunca sıralanır ve üst ve alt lamlar arasında oluşan köşeye yerleştirilir.

DNA kodlayan floro dörtlüsü veya biyosensörler hücreye enjekte edilir. Ertesi gün. Embriyolar aros içine monte edilir.

Görüntüleme slaytında, embriyolar etiketli hücreler aşağı bakacak şekilde konumlandırılır ve oda bir kapak fişi ile kapatılır. Merhaba, ben Mary Hallin Laboratuvarı'ndan ve Wisconsin Madison Üniversitesi Zooloji ve Anatomi bölümlerinden Erica Anderson. Ben Nam Tauri, aynı zamanda Hallin Laboratuvarı'ndanım.

Ve ben Hallin Laboratuvarı'ndan Matt Clay. Bugün size zebra balığı Embriyolarında ayrı ayrı etiketlenmiş hücrelerin canlı görüntülenmesi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü, akson büyümesi ve nöro krest hücre göçü sırasında hücre motilitesini ve aktin dinamiklerini incelemek için bir laboratuvarda kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Önce enjeksiyon kızaklarını monte etmek için, silindirli silikon elastomeri üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Elastomer tabanın 10 kısmını bir kısım kürleme maddesi ile karıştırın.

Üç standart cam mikroskop slaytını birbirine bağlamak için silindir koruyucuyu kullanın. Uzun kenarlarda iki slaytı yan yana yerleştirin. ARD'yi üçüncü slayda uygulayın ve diğer iki slaydın üzerine yerleştirin.

Slaytlar arasından fazla sızıntı olmadan slaytları kapatmak için yeterli miktarda puro kullanın. Fazlalıklar ertesi gün bir tıraş bıçağı ile çıkarılabilir. Slaytları görüntülemek için SIL korumasının gece boyunca ayarlanmasına izin verin.

Ortasında 1,5 santimetrelik bir delik açılmış standart bir cam mikroskobu Slaytı ile aynı boyutta kesilmiş paslanmaz çelik dikdörtgenler kullanıyoruz. 22 milimetre karelik bir kapak kayması, çelik dikdörtgene silce korumalı olarak yapıştırılır. Hem enjeksiyon slaytları hem de görüntüleme slaytları tekrar kullanılabilir ve% 70 etanol ile kullanımlar arasında temizlenebilir, ardından embriyoları enjekte etmeden önce su ile durulanabilir.

DNA'yı mililitre başına 10 ila 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Suda% 0.2 fenil kırmızısı DNA. Fenil kırmızısı, enjeksiyon sırasında görselleştirmeyi sağlar.

Ardından, iğneyi doldurun ve kalibre edin. APOL kılcal iğneyi yaklaşık mikrolitre DNA çözeltisi ile doldurun. İğnenin dolmasını bekleyin ve ardından ince forseps kullanarak enjeksiyon aparatının iğne tutucusuna yerleştirin.

İğnenin ucunu, uç açıklığının çapı yaklaşık 10 mikrometre olacak şekilde kırın. Mineral yağdaki damlacığın çapını bir oküler mikrometre ile ölçün. Enjeksiyon hacmini hesaplamak için pico spritzer'ın süre ayarını yapın.

Yani damlacık çapı 0.12 mikrometre veya hacim olarak yaklaşık bir nanolitredir. 10 ila 30 milisaniye arasında bir süre tipiktir. E üç embriyo ortamında bir hücre aşaması embriyoları toplayın ve yaklaşık 30 ila 60 embriyoyu enjeksiyon slaydına aktarın.

Embriyoları üst sürgünün kenarı boyunca konumlandırın ve E üçünün çoğunu çıkarın, böylece embriyolar bükülmüş bir diseksiyon pimi ile yüzey gerilimi ile slayta tutulur. Embriyoları, hücre enjeksiyon slaytının duvarına dayanacak şekilde döndürün. İğneyi embriyo koryonundan yumurta sarısı boyunca ve embriyonun tek hücresine yönlendirmek için bir mikro manipülatör kullanın.

Hücreye 0.5 ila bir nanolitre DNA çözeltisi enjekte edin. Enjekte edilen embriyoları E 3'teki Petri kaplarına aktarın ve 28.5 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Gerekirse, enjeksiyondan sonraki gün embriyoları daha düşük sıcaklıkta inkübe ederek gelişim yavaşlatılabilir.

Embriyolar görüntüleme için istenen yaşa ulaşmadan yaklaşık bir saat önce embriyoları görüntüleme için hazırlayın. COR'ları ince forseps ile embriyolardan çıkarın. Genellikle embriyoları döllenmeden yaklaşık 14 ila 17 saat sonra görüntülemeye başlarız.

Daha sonra, floresan ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu kullanarak etiketli hücrelere sahip embriyoları seçin, uzun çalışma mesafesi ve yüksek büyütme kombinasyonu nedeniyle bir Nikon a Z 100 dürbünü üzerinde bir Forex objektifi kullanıyoruz. Bir embriyoyu yaklaşık 50 mikrolitre V üç içeren bir mikro füj tüpüne yerleştirin. Geniş bir borg cam pipet kullanarak %0,02'lik bir trica'lık nihai konsantrasyon elde etmek için trica stoğu ve erimiş %1 düşük erime noktalı agros ekleyin.

Aros sertleşmeden önce embriyoyu hemen bir agro damla içinde görüntüleme slaytının kapak fişine aktarın, embriyoyu etiketli hücrelerin bulunduğu bölge alt kapak kızağına bakacak şekilde konumlandırın. Ardından, görüntüleme odasını monte edin. Plastik bir halkanın bir tarafını silikon vakum yağı ile kaplayın ve metal görüntülemeye yapıştırın.

Halkanın diğer tarafını kaydırarak gresle kaplayın. Hazneyi, 10 milimolar yığın içeren E üç ile doldurun ve halkanın üst yağlanmış yüzeyine 22 milimetre karelik bir kapak kaymayı sabitleyerek hazne üstünü %0.02 Trica sızdırmaz hale getirin. Embriyo artık bir sonraki bölümde gösterileceği gibi dört boyutlu görüntüleme için hazırdır.

Görüntü elde etmenin ayrıntıları, mikroskop sisteminizin özelliklerine bağlı olacaktır. Burada Olympus FB 1000 konfokal mikroskop için zaman atlamalı çekim sürecini gösteriyoruz. Zeiss LSM beş 10 konfokal sistem ile hızlandırılmış çekim için önceki JO protokolüne bakın.

Görüntüleme odasını mikroskop tablasındaki slayt tutucuya yerleştirin ve 10 x veya 20 x objektif kullanarak embriyoya odaklanın. İletilen ışık altında, 1,2 veya daha yüksek 60 x objektif sayısal açıklığa geçin ve FV yazılımında epi floresan ile etiketlenmiş bir hücreye odaklanın. Lazer taramaya başlamak için xy tekrarına tıklayın.

Bir Z serisi elde etmek için görüntüyü optimize etmek için çekim ayarlarını ve görüntü alma kontrollerini ayarlayın. Zack'in üst ve alt sınırlarını adım boyutuyla birlikte ayarlayın. Görüntü alma kontrol penceresindeki derinlik simgesini devreye sokun ve zaman atlamalı bir seri elde etmek için XY, Z paketi simgesine tıklayarak çekime başlayın.

Zaman taraması altındaki zaman aralığını ve zaman noktalarının sayısını ayarlayın. Başlık Edinme ayarları penceresinde, görüntü edinme kontrol penceresindeki zaman simgesine tıklayın ve XYZT paketi simgesine tıklayarak edinimi başlatın. Burada, tek tek etiketlenmiş hücrelerin temsili filmlerini ve resimlerini sunuyoruz.

Bireysel nöronlar etiketlendiğinde, aksonları diğer etiketli hücreler tarafından gizlenmez ve bu nedenle aksonlar ve büyüme konileri üzerindeki OD uzantıları açıkça görülebilir. Bu film, zar hedefli etiket RFP ile etiketlenmiş bir duyusal nöronu göstermektedir. Görüş alanından çıkan iki aksonu zıt yönlerde uzatır.

Üçüncü bir akson, hücre gövdesinden ortogonal olarak uzanır ve dallar oluşturur. Benzer şekilde, bireysel nöral krest hücrelerinin etiketlenmesi, hücre motilitesi ile ilişkili ince hücresel süreçlerin görüntülenmesine izin verir. Burada iki nöral krest hücresi membran hedefli GFP ile etiketlenmiştir.

Anterior yönde göç ederken geniş çıkıntılı aktivite sergilerler. Bir popülasyon içindeki komşu hücreler arasındaki etkileşimleri görselleştirmek için transgenik bir çizgi içindeki tek tek hücreleri etiketlemek genellikle yararlıdır. Bu görüntü, yeşil nöronların arka planında bir nöronu kırmızı olarak etiketlemek için DNA kodlama etiketi RFP ile enjekte edilen tüm duyusal nöronlarda stabil GFP ekspresyonu olan bir embriyoyu göstermektedir.

Aktin biyosensör probu, hücre gövdesine kıyasla yeni oluşan aksonlar boyunca büyüme konileri ve dinamik çıkıntılarda sinyalde daha güçlü etki gösterir. Daha sonraki bir aşamada, büyüme konilerinde sinyal güçlü kalırken, olgun aksonlar önemli ölçüde daha zayıf sinyale sahiptir. Zebra balığı embriyolarında ayrı ayrı etiketlenmiş nöronların ve nöral krest hücrelerinin canlı görüntülemesini nasıl yapacağınızı gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, DNA'nın toksisiteye veya hücre ölümüne neden olacak kadar yüksek seviyelerde ifade edilmediği embriyoları seçmek önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.