Name: Biyolojik Sistemleri Oksijen Görüntüleme Fosforlu Nanoprobes sentezi ve Kalibrasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Öğrenin biyolojik sistemlerde oksijen ölçümü için fosforlu nanoprobların sentezi ve kalibrasyonunu. Platin ve paladyum porfirin dendritik nanosensörler kullanılarak geliştirilen bu yöntem, oksijen görüntüleme uygulamalarında yüksek hassasiyet sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH ABD&#39;den EB007279 ve HL081273 hibe desteği minnetle kabul edilmektedir.

1. Oksijen ölçüm protokolü genel tanımı (Bu bölümde herhangi bir eylem var, ama kağıt geri kalanı anlamak için çok önemlidir. Ses eşliğinde, birkaç Power Point slaytları bir dizi olarak, örneğin, filme olabilir.) 1.1) prob ilgi ortama teslim edilir, örneğin bir hayvanın kan veya interstisyel sıvı enjekte. 1.2) nesne (doku yüzey) prob heyecanlı üçlü haline teşvik etmek için uygun dalga boyu ışık ile aydınlatılır. Tipik olarak uyarım, tek-foton mekanizması ile oluşur. Ancak, iki-foton geliştirilmiş özel problar durumunda, uyarım, yüksek çözünürlüklü mikroskopi uygulamalar problar kullanılarak izin veren iki-foton mekanizması yoluyla olabilir . Bir foton uyarım genellikle daha az uzaysal çözünürlüğü sağlar, ancak basit enstrümantasyon gerektirir ve LED tabanlı fiber-optik phosphorometers ile tek noktadan ölçümlerde kullanılabilir. 1.3) sensörü tarafından yayılan Fosforesans uzun ömürlü üçlü devlet kaynaklanır. Prob molekül özel üçlü devlet yüksek kuantum verimi vermek ve yerine floresan fosforesans yayacak şekilde tasarlanmış olmalıdır. Prob üçlü devlet iken, üçlü devlet de aktif hale getirebilirsiniz oksijen molekülleri ile çarpışma karşılaşmalar yaşayabilirsiniz - "su verme" olarak adlandırılan bir süreç Fosforesans çürüme dolayısıyla oksijen, üçüz devletin ömrü ve yokluğunda, τ 0. Oksijen varlığında, fosforesans ömrü (τ), ısıl işlem sonucu olarak kısaltılır. Üçüz devletin ömrü ve ortamda oksijen miktarı arasında doğrudan bir ilişki vardır. Bu oksijen konsantrasyonu [O 2] (veya oksijen kısmi basıncı pO2) fosforesans ömrü (τ) bağlayan bilinen Stern-Volmer ilişki: <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="Denklem" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="denklem"> Biyolojik sistemleri, oksijen kadar oksijen fosforesans su verme yöntemi çok seçici hale getirir fosforesans, en etkili söndürücü. 1.4) ömrü t ölçmek için, zaman içinde yayılan fosforlu fotonlar binned. Örneğin, fotonlar toplanana kadar ikaz darbe sonrasında, 200 fotonlar, bu nedenle, ilk 15 mikrosaniye önümüzdeki 15 mikrosaniye toplanan 150 fotonlar toplanan ve olabilir. Kutularına numaraları ömrü verim τ analiz fosforesans çürüme, zamana karşı çizilmiştir. Görüntülemede, bu yordamı fosforesans ömrü, haritalar, görüntünün her piksel uygulanır. Yaşamların ölçümleri, biyolojik örnekler için ortak nesne boyunca prob dağıtım heterojenite duyarsız. Böylece, ömürleri sadece oksijen rapor. Yaşamlarda τ Stern-Volmer ilişkiyi kullanarak oksijen konsantrasyonu dönüştürülür. 2. Fosforlu probları İnşaatı Biyolojik sistemlerde oksijen ölçümleri için Fosforlu probları dendrimers yapılmış kafesler içine kapsüllü fosforlu kromoforlar (çekirdek), son derece düzenli hyperbranched polimerler oluşur [3]. Dendrimers çevre ile etkileşim çekirdeği korumak ve mümkün probların hassasiyet ve dinamik aralık (Stern-Volmer ilişkisi sabit k q) optimize etmek için, çekirdek oksijen difüzyon hızını kontrol. Dendrimers Termini probları yüksek suda çözünür ve biyolojik makromoleküller ile etkileşimleri önlemek, kimyasal olarak inert hidrofilik polietilen glikol (PEG) grupları ile modifiye edilmiştir. Probların Fosforlu çekirdek porfirinler ve π genişletilmiş porfirin Pt veya Pd kompleksleri. π Genişletilmiş porfirinler pirol halkaları dış aromatik parçaları ile kaynaşmış olan porfirinler. π-Eklenti belirli bir görüntüleme uygulaması (örneğin mikroskopi vs tomografi) gereksinimlerini karşılamak için problar spektroskopik özellikleri ayarlama sağlar. Bir örnek olarak, Pd tetaaryltetrabenzoporphyrins sentezi (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP spektrum ve güçlü fosforesans uzak-kırmızı parçası güçlü emme bantlar var, iyi biyolojik oksijen ölçümleri için uygundur. PdAr 4 TBP sentezi aşağıdaki adımlardan oluşur: Lindsey yoğuşma tetraaryltetracyclohexenoporphyrins 2.1) Hazırlama (Ar4TCHP) [5] yerine benzaldehydes ile tetrahydroisoindole. 0,01 M CH tetrahydroisoindole (1 eq) bir çözüm için &lt;alt&gt; 2 CL 2 aromatik aldehit (1 eq), argon gazı altında eklendi . Reaksiyon karışımı RT BF 3 xEt 2 O (0.2 eq) karanlıkta 10 dakika süreyle karıştırıldı eklendi ve reaksiyon karışımı ilave bir 2 saat için rt karıştırıldı DDQ (1 eq) eklendi, karışımı sürekli karıştırma altında bir gece kaldı. 3 çözüm% 10 aq Na 2 SO yıkandı,% 10 aq Na 2 CO 3,% 5 aq HCl ve nihayet tuzlu su ile. Organik faz, daha sonra vakum yoğunlaşmış, Na 2 SO 4 üzerinden kurutulur. Tert-bütil eter karışımı Ar yeşil toz olarak 4 TCHP vermek için kalıntı CH 2 Cl 2 kristallendirildi. Verim% 50 civarında. 2.2 PD) Ekleme PdAr 4 TCHPs elde etmek için. Serbest baz porfirinler (1 eq) Et 3 N (20 eq) aşan varlığı CH 3 CN kaçmasını PdCl 2 veya Pd (oac) 2 (1.2 eq) ile tedavi edildi. UV-vis spektroskopi dönüşüm izlenir (solvent CH 2 Cl 2-AcOH) ve 468-472 nm dikte Soret bant sonra tamamlanmış sayılır kayboldu. Karışım CH 2 Cl 2 ile seyreltilmiş ve Celite Pd (0) kaldırmak için ince bir tabaka süzgecinden soğuması. Çözücü uçurulur ve kalıntı çözücü olarak CH 2 Cl 2 silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırılır. Koyu kırmızı fraksiyon toplandı, hedef neredeyse kantitatif verim PdAr 4 TCHPs vermek çözücü uçurulur. 2.3) PdAr 4 TBP PdAr 4 TCHPs oksidasyonu kaynatılır THF DDQ 2 kat daha fazla (16 eq) tarafından hazırlanmıştır. Reflüye yol boyunca, derin, koyu kırmızı-yeşil renk değiştirdi. Çözücü buharlaştırılır, kalıntı% 10 aq Na 2 SO 3, su ve tuzlu su ile yıkanır, CH 2 Cl 2 ile sulandırıldı. Organik faz Na 2 SO 4 üzerinden kurutulur ve vakum yoğunlaşmıştır. Kalıntı silika jel kromatografisi (Eluent CH 2 Cl 2) ile saflaştırılır oldu. PdAr4TBP Kullanıcı mavi-yeşil bir toz% 85-90 vermek vakum konsantre ilk koyu yeşil fraksiyonu toplanmıştır. 2.4) Pd, Periferik ester gruplarının Tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl) tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP)% 1 (v / v) su / rt az THF KOH 10 kat daha fazla kullanarak hidrolize edildi. Solvent PdAr4TBP Kullanıcı karboksilik asit türevleri oluşan potasyum tuzları çökelti dekante oldu. Suda çözünmüş katı madde, kons ile asitlendirilmiş ek 2 saat, kıpırdandı. HCl pH: ~ 4-5. Elde edilen çökelti su ile yıkanır ve kurutulur vakum, santrifüj yoluyla izole edilmiştir. Dendrons korunması. Dendrimer Her bireysel şube dendron denir. Korunması dendrons aril-glisin (AG) yapı taşlarını inşa edilir. AG dendrons kolayca ucuz başlangıç ​​maddeleri sentezlenen ve kromatografisi-yöntemleri ile yüksek saflık ve verim izole edilebilir. Yeni nesil 2 (G2) AG-dendron sentezi aşağıdaki adımlardan oluşur: Fischer haloacyl halide yöntemi kullanarak yapı taşları 2.4) sentezi, Boc korumalı, 3,5 dicarboxyphenyl glycineamide ve 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide. 2.5) CDMT / NMM peptid kaplin kimya kullanarak yapı taşlarından Kaplin. 2.6), oda sıcaklığında 2 saat TFA G2 dendron çözümü karıştırma fokal amino grubu access 2.7) daha yüksek nesil dendrons montajı için, kaplin / deprotection adımları tekrarlanır. Dendrimer montaj HBTU / DIPEA kaplin kimya PdAr4TBP (ya da diğer porfirin) kullanarak deprotected dendrons kaplin ile elde edilir . 2.8) İlk olarak, Boc koruyucu gruplar dendron kaldırılır. Örneğin, Boc korumalı G3 dendron (0.58 g) TFA (15 ml) dağıldı ve karışım 2s RT tepki kaldı. Asit TFA tuzu olarak dendron verimli, döner buharlaşma tarafından kaldırıldı. Kalıntı kuru NMP (10 ml) içinde çözünmüş ve TFA izlerini gidermek için, DIPEA bir birkaç damla ilave edildi. 2.9) kaplin reaksiyon başlamadan önce, porfirin tamamen erimesi için kritik öneme sahiptir. Örneğin, Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0.061 g), 140 kuru NMP (65 ml) ısıtma dağıldı ° C 10 dakika, azot akışı altında. 2.10) çözümü oda sıcaklığına kadar soğutulur, HBTU (0,211 g) eklendi ve karışım 5 dakika süreyle karıştırıldı. 2.11) DIPEA (0.35 ml), hemen soluti ek ardından, bir kısmı karışıma eklendiNMP dendron (2.8) TFA-tuz karışımı geceleme karıştırma altında kaldı. 2.12) karışımı% 3 aq dökülür. NaCl (350 ml), ve ortaya çıkan çökelti santrifüj tarafından toplanan ve tekrarlayan süspansiyon / santrifüj hedef porfirin-dendrimer verim için su, MeOH ve Et 2 O ile yıkandı. Periferik ester gruplarının hidroliz için 2.13) dendrimer, ilk olarak 20-60 dk süre içinde tam solvent kaldırma takip DMSO / MeOH NME 4 OH (~ 5 mM) ile tedavi edildi. Bu prosedür, sulu çözünürlük vermek karboksilat grupların yeterli sayıda dendrimers oluşturmak için izin verdi. Hidroliz tamamlamak için, dendrimer 0.1N sulu NaOH (gece) ile tedavi edildi. Sonuç olarak, saf porfirin-dendrimer karboksilik asitler,% 80-95 verim izole olabilir. Dendrimer çevre modifikasyonu Bu noktada, aynı porfirin-dendrimer başlayarak, ya bir ya da iki-foton probları sentezlenmiş olabilir. İlk durumda, tüm periferik karboksil grubu PEG birimleri ile değiştirilir - PEGylation olarak bilinen bir yöntem. İkinci durumda, birkaç karboksil grubu ilk iki foton anten kromoforlar (Kumarin-343) kalan carboxyls PEGylation takip etilendiamin (EDA) linkers ile modifiye edilmiş [6]. Birleştiğinde Dendrimers HBTU / DIPEA kaplin kimya kullanarak monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. MW 1000) kullanarak pegile. NMP dendron (veya DMF) (1-10 mM) HBTU 1.25 kat daha fazla bir çözüm için 2.14) eklendi ve reaksiyon karışımı oda sıcaklığında 10 dakika karıştırılır. M-PEG-NH2 1.25 kat daha fazla hemen ilave edilerek takip DIPEA 6.25-Fold fazla eklendi. Reaksiyon karışımı rt az 2 gün süreyle karıştırıldı. Dietil eter reaksiyon karışımına eklendi, oluşan çökelti THF dietil eter eklenerek santrifüj ve yeniden çöktürülmüş ayrıldı. 2.15) Final arıtma ilk ön faz toplama boyut dışlama kromatografisi ile elde edildi. Pegile porfirin-dendrimer THF (~ 15 ml) küçük bir miktar çözülür ve polistiren SEC faz (Biorad, Biobeads S-X1) ile dolu bir kromatografik sütun üstüne yüklenmişti. Sütun saf THF ile yıkandı ve ön hareket eden koyu renkli bant toplanmıştır. 2.16) THF döner buharlaştırıcı çıkarıldı ve geri kalan malzeme vakum kurutulur. 3. Probe karakterizasyonu Photophysical karakterizasyonu prob absorpsiyon ve emisyon spektrumları, fosforesans ömürleri τ 0 ve Stern-Volmer oksijen su verme sabitleri k q altında fizyolojik şartlar ölçümleri içerir. 3.1), standart enstrümantasyon (spektrofotometre ve kararlı flüorometre) kullanarak ortam koşulları altında absorpsiyon ve emisyon spektrumları elde edilir. ~ 1 mcM çözümler prob kullanılır. 3.2) yanında, Stern-Volmer kalibrasyon arsa elde edilir. Bu, en önemli ölçü, bize oksijen konsantrasyonu probun ömrü ilişki sağlar çünkü. 3.3), PBS (pH 7.2) probu bir çözüm portları ile uyarma ve emisyon optik fiberler ışık geçirmez bir kafes içinde bulunan ısı kontrollü odasının içine yerleştirilmiş özel bir silindirik küvet yerleştirilir. Lifler dik açılı geometri odası içinde küvet ile yakın temas haline getirilir. 3.4) küvet içine son derece hassas bir Clark-tipi oksijen elektrot (CK-oksijen elektrot) eklenir, bir stoper ile kapatılmıştır. Stoper de argon giriş ve çıkış için iki iğne portları içerir. Iğneler sadece çözüm yüzeyi üzerinde gaz akışını akışını sağlamak ise elektrot, çözüm içine batırılır. İlk başta, argon girişine bağlı değildir. 3.5), sıcaklık istenen değere (genellikle 36-37 ° C) ayarlanır ve çözüm dengeleme için karıştırma altında bırakılmıştır. 3.6) uyarma fiber bir PC tarafından işletilen bir dijital phosphorometer ikaz portu, bağlı. Phosphorometer çıkış 333 kHz D / A yönetim kurulu tarafından kontrol edilir bir yüksek güç LED ışık kaynağı. Emisyon fiber optik, son derece duyarlı kızılötesi APD (çığ fotodiyot) ile birleştiğinde phosphorometer, başka bir bağlantı noktasına bağlanır. Diyot çıkış amplifiye ve eksitasyon ve emisyon kanalları arasında senkronizasyon sağlayan aynı kumanda panosu, A / D kanal içine beslenir. 3.7) kontrolü yazılımı aluyarma bakliyat, rasgele seçilen bir süre (genellikle 2-3 ms) sırasında fosforesans çürüme koleksiyon tarafından istenen herhangi bir uzunluğu (örneğin 5 veya 10 ms), alçak nesil. Tek bir ömür boyu ölçümü için gerekli süre genellikle 0.5-1 s, ancak, ölçümler gibi hızla saniyede 10-20 olarak elde edilebilir. 3.8) aynı bilgisayarda başka bir A / D board içine oksijen elektrot çıkış amplifiye ve yönlendirilir. Bu, belirli zaman dilimlerinde geçerli olan elektrot kaydetmek için kullanılan düşük frekanslı kurulu (1 kHz max). Elektrot veri kayıt için program phosphorometer yazılımı ile aynı anda çalışır. 3.9), çözüm sıcaklığı dengelenmiş sonra phosphorometer ve elektrot programları ölçümleri her 10 sn gerçekleştirmek için, aynı anda başlatıldı. Onların çıkışları iki ayrı dosyalar halinde eş zamanlı olarak kaydedilir. Bundan sonra, argon, küvet stoper giriş bağlantı noktasına bağlanır. 3.10), argon gibi karıştırılır çözüm yüzey üzerinde akar, yavaş yavaş oksijen yerine geçer. Elektrot akımı bir azalma ve fosforesans ömrü, phosphorometer ile ölçülen bir artış ile sonuçlanır. Genellikle, oksijen verileri tamamen dosyaları otomatik olarak kaydedilir ve bu süre boyunca, yaklaşık 2 saat sonra tamamen formu çözüm yerinden edilir. 3.11) titrasyon çalışması sona erdikten sonra, elektrot veri ve fosforesans ömürleri standart bir analiz programı (örneğin Miocrocal Kökeni) alınır. Oksijen konsantrasyonu elektrot akımı doğrusal bağlıdır ve elektrot için sıfır oksijen neredeyse sıfırdır. Atmosferik basınç altında, pO 2 (150 mm Hg hakkında) bilinir. Böylece, elektrot veri doğrudan oksijen ölçeğine dönüştürülür, vs pO 2 ters fosforesans ömrü, arsa ve inşa edilebilir. Bu komplo, eğim gibi oksijen su verme sabit kq vermek için en küçük kareler yöntemi kullanarak düz bir çizgi ile donatılmıştır. Fosforesans ömrü t0 da aynı uyum (önünü ters gibi) ya da doğrudan sıfır oksijen ölçüm elde edilir. 3.12), yüksek konsantrasyonlarda kan plazma bulunan bir protein, - Gerekirse, albümin varlığında prob bir çözüm kullanarak titrasyon tekrarlanır koşulları taklit etmek amacıyla (bir hayvanın kan gerçek deneysel sistem bir araya geldi in vivo). Elde Stern-Volmer araziler dendrimer prob iyi koruyor ve PEG gruplar albümin ile temas probu izole eğer aynı olmalıdır. Aksi takdirde, prob ve kan proteinleri etkileşimde bulunacak ve oksijen ölçümleri belirsizlik neden değişmiş bir Stern-Volmer arsa yol açacaktır. Böylece elde edilen kalibrasyon sabitleri, oksijen konsantrasyonu, a priori bir bilinmeyen görüntüleme deneylerinde kullanılır.

<ol><li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li>
<li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+phosphorescence%3A+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li>
<li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li>
<li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li>
<li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited%3A+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Porphyrins+and+Phthalocyanines%22%5BJournal%5D)">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li>
</ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Kısaltma</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Tam isim</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-methylpyrrolidinone</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Trifloroasetik asit</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropylethylamine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimethylsülfoksit</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-kloro-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

biyolojik sistemleri oksijen görüntüleme fosforlu nanoprobes sentezi ve kalibrasyon

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oksijen ölçüm fosforesans su verme [1, 2] tarafından aşağıdaki adımlardan oluşur: 1) prob ilgi orta (örneğin, kan veya interstisyel sıvı) teslim edilir, 2) nesne için uygun dalga boyu ışık ile aydınlatılmış heyecanlandırmak için , üçlü haline prob; 3) yayılan fosforesans toplanan ve zaman ders oksijen konsantrasyonu (veya kısmi basıncı, pO dönüştürülür fosforesans ömrü, verim için analiz<sub&gt; 2</sub&gt;). Prob biyolojik çevre ile etkileşim ve bazı durumlarda ölçüm tamamlanmasının ardından orta atılır) 4. Bu adımların her biri, ölçüm protokolü sadece invaziv bileşeni oluşturan fosforlu probları, moleküler tasarım gereksinimleri dayatır. Burada, biyolojik sistemlerde oksijen ölçümleri için dendritik fosforlu nanosensors tasarım gözden geçirin. Probları Pt veya polietilen glikol (PEG) artıkları ile periferik değiştirilmiş Pd porfirin-tabanlı polyarylglycine (AG) dendrimers oluşur. Etkili iki foton uyarma için, dendrimers Termini (Förster Rezonans Enerji Transferi) FRET uyarma enerji yakalama ve intramoleküler üzerinden probları üçlü çekirdek kanal iki foton anten kromoforlar, değişiklik olabilir. Biz, problar ve mevcut Ayrıntılı kalibrasyon protokolü anahtar photophysical özellikleri açıklanmaktadır.

Biz fosforesans giderici ve biyolojik sistemlerde oksijen görüntüleme için porfirin-tabanlı dendritik nanosensors gözden tasarım ilkeleri oksijen ölçümleri sunuyoruz.

Biyolojik Sistemleri Oksijen Görüntüleme Fosforlu Nanoprobes sentezi ve Kalibrasyon

Fosforesans sönümlemesi ile oksijen ölçümü [1, 2] şu adımlardan oluşur: 1) prob, ilgili ortama (örneğin kan ...

Platin ve paladyum porfirin DER'lerine dayalı, oksijen için fosforesan probların tasarımını sunuyoruz. Problar, dendron ve periferik hidrofilik polietilen glikol tabakasını kapsülleyen metal porfirin çekirdeklerinden oluşmaktadır; probların yapılandırmaları ve kalibrasyonları bu makalede gösterilecektir. Merhaba, benim adım Luis Sinks.Pennsylvania Üniversitesi Biyokimya ve Biyofizik Bölümü'nde Profesör Sergei OV ile birlikte çalışıyorum. Ben de Vina'dan Emmanuel Losis. Ben de Sergei V.'yim. Fosfor ve sönümleme ile biyolojik oksijen ölçümleri, doğrudan ilgili ortama yerleştirilen ekzojen fosfor ve problar kullanılarak gerçekleştirilir.Kan veya interstisyel sıvı probları, tasarımında özel dikkat gerektiren ölçüm şemasının tek invaziv bileşenidir. Bugün size, oksijen ölçümü ve biyolojik sistemler için dendritik fosforesan nano probların sentezi ve kalibrasyonuna yönelik bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü, yarı ve iki katlı oksijen ölçümleri için problar sentezlemek ve karakterize etmek amacıyla kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Probları oluşturmaya başlamadan önce, prob fosforesansının arkasındaki temel teoriyi inceleyelim. Fosforesans, uzun ömürlü triplet durumdan kaynaklanır.Prob molekülü, triplet durumun yüksek kuantum verimini sağlayacak ve floresans yerine fosforesans yayacak şekilde tasarlanmalıdır. Probların uyarılması tek fotonla veya özel iki foton geliştirilmiş problar durumunda iki foton mekanizmasıyla gerçekleşir. Tek foton uyarımı genellikle daha düşük uzamsal çözünürlük sağlar, ancak daha basit cihaz gereksinimleri vardır ve LED tabanlı fiber optik fosperimetrelerle yapılan tek nokta ölçümlerinde kullanılabilir.Prob triplet durumdayken, triplet durumu deactivate edebilen ve söndürme (quenching) olarak adlandırılan bir süreçle oksijen molekülleriyle çarpışmalı etkileşimler yaşayabilir. Bu nedenle, oksijen varlığında fosforesans ömrü kısalır. Söndürmenin bir sonucu olarak, triplet durum ömrünün ortamdaki oksijen miktarına olan bağımlılığı Stern-Volmer denklemi ile karakterize edilir.In vivo deneylerde, prob hayvanın kanına veya interstisyel sıvısına iletilir ve probu uyarılmış triplet durumuna getirmek için doku yüzeyi uygun dalga boyundaki ışıkla aydınlatılır. Fosforesans ömür süresini ölçmek için, yayılan fosforesans fotonları zaman bazlı olarak kaydedilir. Örneğin, uyarım impulsundan sonra ilk beş mikrosaniyede 3.609 foton, sonraki beş mikrosaniyede 1.421 foton toplanabilir ve bu işlem hiç foton toplanmayana kadar devam eder.Kutulardaki sayıların zamana karşı grafiğe dökülmesi fosforesans sönümlemesini verir ve bu veriler fosforesans ömrünü elde etmek için analiz edilir. Görüntülemede bu prosedür, görüntünün her bir pikseline uygulanarak fosforesans ömür haritaları oluşturulur. Ömür ölçümleri, biyolojik numunelerde yaygın görülen prob dağılımındaki heterojenliklere karşı duyarsızdır.Şimdi probların nasıl oluşturulacağını görelim. Bir aromatik aldehidi, tetra hidro izo indolün 0,01 molar çözeltisine ekleyerek sentez prosedürüne başlayın. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dakika boyunca karıştırın.Ardından boron triflorür dietil eterat ekleyin ve iki saat daha karıştırmaya devam edin. Sonrasında, rengin soluk kırmızıdan koyu yeşile dönmesini sağlayan diklorosiyanobenzoquinon veya DDQ ekleyin ve karışımı sürekli karıştırma altında gece boyunca bekletin; ertesi gün çözeltiyi yıkayıp kurutun ve ardından vakum altında konsantre edin.Kalıntının yeniden kristallendirilmesi, hedef ürünü yeşil bir toz olarak verir. Verimler genellikle %50 civarındadır. Ardından, serbest baz porfirini paladyum asetat ile işleme tabi tutun. Dönüşümü UV-vis spektroskopisi ile takip edin.Dion'un 468 ile 472 nanometre arasındaki sabun bandı kaybolduğunda dönüşüm tamamlanmış olur. Porfirin, silika jel üzerinde kolon kromatografisi ile izole edilir. Palladium tetra benzo porfirin hazırlamak için palladium tetra siklo porfirini okside edin.Reflü sırasında renk koyu kırmızıdan derin yeşile döner; çözücüyü uçurun, kalıntıyı diklorometan ile seyreltip yıkayın, organik fazı kurutun ve vakumda konsantre edin. Silika jel üzerinde kromatografi yaptıktan sonra, palladyum tetrabenzoporfirini mavi-yeşil bir toz olarak izole edin. Ardından, palladyum tetrabenzoporfirinin periferik ester gruplarını hidroliz edin.İlk olarak tetra benzo porfirin esterini tetra hidro furan içinde baz ile işleme tabi tutun. Ardından hidrolizi sulu baz ile sürdürün, porfirini hidroklorik asit ekleyerek çöktürün ve vakumda kurutun. Bu işlem porfirin sentezini tamamlar.Şimdi entronsların nasıl sentezleneceğini görelim. Problar birleştirilmeden önce, Denmark kollarını oluşturan entronsların önceden sentezlenmesi gerekir. Kromatografi gerektirmeyen yöntemlerle uygun maliyetli başlangıç materyallerinden kolayca hazırlanabilen aero gly'ler, aynı DER'ler kullanılır.Odak noktalarında amino grupları bulunan teronlar, az önce yapılışını gösterdiğimiz phy üzerindeki caril gruplara bağlanır. Ardından, DME'nin çevresindeki ester grupları, porfirinin çevresindeki karboksilik gruplara benzer şekilde hidrolize edilir. Bu noktada, Porfirin DME polikarboksilik asitten başlayarak, iki foton problarını sentezlemek için bir veya iki foton probu sentezlenebilir.İlk olarak, birkaç iki foton anten fragmanını demer çevresindeki birkaç karboksil grubuna farklı yönlerde bağlayın. Şimdi, demer üzerindeki geri kalan karboksilik asit kalıntılarının modifikasyonuna geçin. Porfirin rimer'in yüksek konsantrasyonlu bir çözeltisine 1,25 kat fazla HBTU ekleyerek başlayın ve reaksiyon karışımını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karıştırın.Şimdi, diizopropil etilamin ve metoksi polietilen glikolamin ekleyin. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında iki gün boyunca karıştırın ve ardından etil eter ekleyin. Santrifüj ile çöktürerek formu ayırın ve dietil eter ekleyerek tetrahidrofuran içinden birkaç kez yeniden çöktürün.Son olarak, probu tetrahedran çözücü kullanarak polistiren boncuklar üzerinde boyut dışlama kromatografisi ile saflaştırın. Şimdi prob karakterizasyonu ve kalibrasyonuna bakalım. Probun absorbsiyon ve emisyon spektrumları, standart bir spektrofotometre ve kararlı durum florimetresi kullanılarak ortam koşullarında 1 µM prob çözeltileri ile elde edilir.Ardından, probun ömrünü oksijen konsantrasyonu ile ilişkilendirmemize olanak tanıyan Stern-Volmer kalibrasyon grafiğini elde etmek için, prob çözeltisini özel silindirik bir kaba yerleştirin. Kap, uyarılma ve emisyon optik fiberleri için girişleri bulunan, ışık geçirmeyen bir kafesin içindeki sıcaklık kontrollü bir hazneye yerleştirilmiştir. Kabı, içine yüksek hassasiyetli Clark tipi bir oksijen elektrodu yerleştirilmiş olan bir tıpa ile kapatın.Tıpanın ayrıca argon girişi ve çıkışı için iki iğne portu bulunmaktadır. Sıcaklığı 36 ila 37 °C'ye ayarlayın ve çözeltiyi dengeye ulaşana kadar karıştırmaya bırakın. Eksitasyon fiberini, bir bilgisayar tarafından kontrol edilen dijital bir fosforimetrenin eksitasyon portuna bağlayın.Işık kaynağı ve phos perimeter yüksek güçlü bir LED'dir ve çıkışı 333 kilohertz'lik bir dijital-analog dönüştürücü kart ile kontrol edilir. Emisyon fiberi, kızılötesine duyarlı bir avalanche foto diyoda bağlı olan phos perimeter'ın başka bir optik portuna bağlanmıştır. Diyodun çıkışı yükseltilerek aynı kontrol kartının ad kanalına iletilir ve böylece eksitasyon ile emisyon kanalları arasında senkronizasyon sağlanır.Kendi yazılımımız olan kontrol yazılımı, istenilen herhangi bir uzunlukta uyarım darbeleri oluşturur ve ardından fosforeşans sönümlemesi toplama işlemini gerçekleştirir. Oksijen elektrodunun çıktısı yükseltilir ve aynı bilgisayar üzerindeki başka bir analog dijital karta yönlendirilir. Bu, seçilen zaman noktalarında, tipik olarak saniyede 10 kez, elektrot akımını kaydetmek için kullanılan, maksimum bir kilohertz hızında düşük frekanslı bir karttır.Çözelti sıcaklığı dengelendiğinde, hem phos perimeter hem de elektrot programları aynı anda başlatılır. Her 10 saniyede bir ölçüm yapmak için, çıktıları iki ayrı dosyaya senkronize şekilde kaydedilir. Ardından, Argonne vet tıkacındaki giriş portuna bağlanır.Argonne, karıştırılan çözeltinin yüzeyinden akarken oksijeni kademeli olarak yer değiştirir. Bu durum, elektrot akımında bir azalmaya ve fosforimetre ile ölçülen fosfor ömründe bir artışa neden olur. Genellikle oksijen çözeltiden tamamen uzaklaştırılır.Titrasyon çalışmasından yaklaşık iki saat sonra, elektrot verileri ve fosfor ömürleri standart bir analiz programına aktarılır ve bu program, ters fosfor ömür ile oksijen kısmi basıncı arasındaki ilişkiyi gösteren bir grafik oluşturur. Bu grafik, eğimi oksijen sönümleme sabitini verecek şekilde en küçük kareler yöntemi kullanılarak düz bir çizgi ile fit edilir. Fosforesans ömrü ise ya aynı fit işleminden ya da doğrudan sıfır oksijen düzeyindeki ölçümden elde edilir.Sonda çözeltisi, in vivo hayvan kanındaki koşulları taklit etmek amacıyla, kan plazmasında bulunan bir protein olan albumin varlığında kullanılarak titrasyon tekrarlanabilir. Eğer ER sondayı koruyorsa, elde edilen Stern-Volmer grafikleri özdeş olmalıdır; zira PEG grupları sondayı albumin ile temastan izole eder.Buradaki öneri, oksijen sentezinin seçilmiş basamakları, ardından işlenmiş problar ve bunların kalibrasyonudur. Kalibrasyon yapılırken, koşulların incelenen biyolojik sisteminkine mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olmak önemlidir.Prob molekülünün albumin gibi biyomoleküllerden etkilenmediğinden emin olmak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

synthesis-calibration-phosphorescent-nanoprobes-for-oxygen-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz fosforesans oksijen bağımlı ısıl işlem dayalı serebral vasküler yapılarda kısmi oksijen basıncı (pO2) ölçmek için deneysel bir prosedür mevcut. Hayvan hazırlama ve görüntüleme yöntemleri pO2 görüntüle CCD tabanlı görüntüleme büyük alan sıçanlarda ve farelerde pO2 2-foton uyarma bazlı görüntüleme için özetlenen.

Fosforesans Oksijen bağımlı Quenching dayanarak Serebral Kan oksijenasyon Ölçüm

Bu protokol, elektron spin rezonans mikroskobu ile canlı hücreler hemen ortamda oksijen konsantrasyonu mikron ölçekli üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanır.

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

Laboratuarda üretilen Floresan nanopartiküller fizyolojik homeostazı sırasında sinyalizasyon ve interstisyel sıvı sırasında hücre gibi biyolojik sistemler görüntüleme iyon konsantrasyonları ve iyon akıları için kullanılır.

Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

NADPH oksidaz fagositler reaktif oksijen türlerinin ana kaynağı (ROS) 'dir. Çünkü ROS geçici doğası nedeniyle, canlı hayvanlarda ROS seviyelerini ölçmek ve izlemek zordur. Yaşayan farelerde ROS seri ölçümü için bir minimal invaziv bir yöntem tarif edilmiştir.

Farklı Hayvan Modelleri NADPH Oksidaz Aktivitesinin Biyoparlaklık Görüntüleme

Bu el yazması, floresan mikroskobu kullanarak tek hücreli NO• dalgalanmalarını gerçek zamanlı olarak izlemek için genetik olarak kodlanmış yeni nitrik oksit (NO•) problarının (geNOps) uygulanması için protokoller sunar. Bireysel endotel hücreleri düzeyinde Ca2+ ile tetiklenen NO• oluşumu, geNOps'un kimyasal bir Ca2 + sensörü ile birleştirilmesiyle görselleştirildi.

Genetik Kodlanmış Floresan Nitrik Oksit Uygulama (• NO) Tek Hücrelerde YOK • Sinyallerin Gerçek zamanlı Görüntüleme için sondalar, geNOps,

Burada, oksijensiz ortamlarda nano saniye milisaniye zaman ölçeğini zaman çözüldü photoluminescence spektroskopisi ile organik moleküllerin spektroskopik karakterizasyonu bir yöntem mevcut. Verimli bir şekilde oksijen örnekleri kaldırmak ve böylece, ışıma Şoklama sınırlamak için yöntem ayrıca açıklanmıştır.

Zaman karar vermek Photophysical karakterizasyonu üçlüsü-hasat organik bileşikler bir oksijensiz ortamı kullanarak bir ICCD kamera

Optik sensör folyoları ile 2D O2 dağıtımlarının haritalama için yeni, frekans etki alanı parlaklık ömür boyu kamera kullanımını anlatıyoruz. Kamera sistemi ve görüntü analizi prosedürleri, su bitkilerinin rizosferinde O2 mikro ortamının görselleştirilmesi için sensör folyolarının hazırlanması, kalibrasyonu ve uygulanması ile birlikte açıklanmıştır.

Frekans-Etki Alanı Tabanlı Kamera Sistemi ile O2'nin Lüminesans Yaşam Boyu Görüntülemesi

Protokol, standart bir floresan mikroskobunda oksijenasyonlarının ve hücre ölümlerinin çok parametrik analizini kullanarak biyobaskı için yüksek verimli sferoid üretimini tanımlar. Bu yaklaşım, sferoidlerin yaşayabilirliğini kontrol etmek ve 3D doku, tümör mikroçevresi ve başarılı (mikro) doku biyofabrikasyonunun modellenmesinde önemli olan standardizasyonu gerçekleştirmek için uygulanabilir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Bu yazıda, uzun bozunma yayan numunelerin makroskopik fotolüminesans ömür boyu görüntülenmesi için yeni, hızlı bir optik görüntüleyicinin kullanımı açıklanmaktadır. Entegrasyon, görüntü toplama ve analiz prosedürleri, görüntüleme için sensör malzemelerinin hazırlanması ve karakterizasyonu ve görüntüleyicinin biyolojik numunelerin incelenmesinde uygulanması ile birlikte açıklanmaktadır.

Biyomedikal Uygulamalar için Floresan Ömür Boyu Makro Görüntüleyici

İki foton uyarma floresan mikroskobu (2PEF) ile entegre olan döteryum-oksit (ağır suD2O) problu uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) mikroskobu kullanılarak amino asitler tarafından düzenlenen hücrelerdeki metabolik aktiviteleri doğrudan görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Aromatik Amino Asitler Tarafından Düzenlenen Hücre Metabolizmasının Biyoortogonal Kimyasal Görüntülenmesi

Bu protokol, çift katmanlı bir mikroakışkan çip üretmek ve hızlı oksijen salınımları altında mikrobiyal büyümeyi analiz etmek için bir yöntem sunar. Cihazın performansı, sıvı kanallarında oksijen algılama ve mikrobiyal yetiştirme yoluyla doğrulandı.

Mikroakışkan Çift Katmanlı Cihaz Kullanarak Mikrobiyal Tek Hücreli Büyüme Analizinde Hızlı Oksijen Salınımları Oluşturma

Öğrenin biyolojik sistemlerde oksijen ölçümü için fosforlu nanoprobların sentezi ve kalibrasyonunu. Platin ve paladyum porfirin dendritik nanosensörler kullanılarak geliştirilen bu yöntem, oksijen görüntüleme uygulamalarında yüksek hassasiyet sağlar.

Biyolojik Sistemleri Oksijen Görüntüleme Fosforlu Nanoprobes sentezi ve Kalibrasyon

Daha fazla video keşfet