Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Bu prosedürde, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun dinamikleri robotik kullanılarak zaman içinde görüntülenir, önce lima fasulyesi tohumları sterilize edilir ve çimlenme için bir doku kültürü kabında nemlendirilmiş kağıt havluların arasına yerleştirilir. Dört gün sonra, koan çıkarılır ve GFP'ye kaynaşmış bir promotör içeren bir DNA yapısı ile bombardımana tutulur Petri kaplarına yerleştirilen Coan, iki boyutlu özel olarak tasarlanmış bir robotik görüntü toplama sistemine monte edilir. Robot, 100 saat boyunca her saat başı her doku parçasının görüntüsünü yakalayacak şekilde programlanmıştır.

Görüntüler, zaman içinde GFP ifadesinin yoğunluğuna ilişkin nicel veriler olan görüntü analizine tabi tutulur. Merhaba, ben John Finer, Ohio Eyalet Üniversitesi Bahçe Bitkileri ve Mahsul Bilimi Bölümü'ndeki Bitki Dönüşüm Laboratuvarı'nın direktörüyüm. Ben Carlos Herandez Garcia, Ohio Eyalet Üniversitesi'nde final laboratuvarında doktora öğrencisiyim.

Carlos bugün size yeşil floresan proteini kullanarak gen ekspresyonu ve bitki dokularının analizi için geliştirdiğimiz protokolü gösterecek. Laboratuvarda geliştirdiğimiz bu prosedürü OD aktivitesinin gerinimini ölçmek için kullanıyoruz. Bunu yapmak için, raportör genlerimiz olan GFP geninin ilk tacını yukarı akışta teşvik edin.

Size promotör kontrolünü Lima vein Cataly'ye nasıl tanıttığımızı ve özel tasarım robotik görüntü yakalama sistemimizde bir uygulama gönderdiğimizi göstereceğim. Görüntü analizi için protokolümüzü gözden geçirerek bitireceğim. Öyleyse gidelim: Bu işleme başlamak için, standart prosedürleri kullanarak yüzey sterilize edilmiş lima fasulyesi tohumları.

Sterilize edilmiş tohumları nemli ve kağıt havlu katmanları arasına eflatun GA yedi kaplarına yerleştirin ve 25 santigrat derecede dört gün boyunca inkübe edin. Burada, promotör ve promotör eleman analizleri için yararlı olan yüksek kopya sayılı bir ifade vektörü kullanıyoruz. Bu vektör, bombardımandan yaklaşık bir ila iki saat önce transforme edilmiş dokularda promotör veya promotör eleman fonksiyonunu görselleştirmek için kullanılan GFP genini içerir.

Tüketim vergisi lima fasulyesi CU kurşunu tohum kabuklarından elde edilir. Bombardıman için uygun CU leadin sarı ila açık yeşil renkte olmalı, düz olmalı ve eksizyondan hemen sonra daha fazla görüntü analizine müdahale edebilecek herhangi bir hasar içermemelidir, MS tuzları, B, beş vitamin, %3 sükroz ve pH 5.7'de %0.2 jel oranı içeren OMS kültür ortamına 12 cu lead yerleştirilmelidir. Daha sonra, DNA yapısını M 10 tungsten parçacıkları üzerine çökeltin İlk olarak, kullanımdan hemen önce parçacıkları steril suda mililitre başına 100 miligram konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin.

Daha sonra 0.6 mililitrelik bir füge tüpüne 25 mikrolitre parçacık, mikrolitre başına bir mikrogramda beş mikrolitre DNA, 25 mikrolitre 2.5 molar kalsiyum klorür ve 10 mikrolitre 100 milimolar sperm aine ekleyin. DNA preparatını buz üzerinde beş dakika inkübe edin, ardından 50 mikrolitre çözeltiyi çıkarın ve parçacıkların üzerine atın. Vorteksleme ile tüpün dibinde kalan DNA kaplı parçacıkları yeniden askıya alın.

Ve girdaplamadan hemen sonra, iki mikrolitrelik bir Eloqua'yı çıkarın. Bu girdap adımını tekrarlayın. Bir Eloqua her çıkarıldığında, kaplanmış parçacıklar buz üzerinde tutulmalı ve 15 dakika içinde kullanılmalıdır.

Artık DNA parçacıkların üzerine kaplandığına göre, bir filtre süzgecinin ortasındaki bir şırınga filtresinin üstünden iki mikrolitre parçacık yerleştirin. Ardından şırınga filtresini partikül giriş tabancasının veya PIG odasının içindeki filtre tutma ünitesine yerleştirin. Bir lima fasulyesi co lead'ini, bir beherin dibine eritilmiş bir elekten oluşan bir bölme üzerine eksenel bir tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin.

Bombardıman sırasında dokuları desteklemek için bir platform olarak kullanılan bölmeyi parçacık tabancası odasına yerleştirin. Dokuyu bombardıman etmek için, önce odayı boşaltmak için vakuma giden valfi açın. Vakum 760 milimetre cıvaya ulaştığında, solenoidi etkinleştirin ve parçacıkları itmek için helyumu serbest bırakın.

Parçacıkları hızlandırmak için kullanılan helyum basıncı 50 ila 60 PSI'dir. Parçacık bombardımanından sonra, vakum hattı valfini kapatın ve egzoz valfini kullanarak vakumu serbest bırakın. Vakum serbest bırakıldığında, bombardımana tutulan co leadin'i almak için hazne kapısını açın ve co leadin'i bir dal tarafına geri koyun.

Kantifikasyon ve ekspresyon profili oluşturma için OMS kültür ortamına kadar. Her DNA yapısı için en az üç ortak kurşun bombardımanı yapın. İyi çalışılmış bir gen ekspresyon profili veren pozitif bir kontrol de dahil edilmiştir.

Yardımcı lider artık görüntüleme için hazırdır. Cıva lambasını açın ve lambanın ısınması için 30 dakika bekleyin. SPOT R-T-C-C-D kamera ve sekiz plaka tutan özel olarak tasarlanmış robotik platformun hareketini sağlayan motor kontrol cihazı için güç kaynaklarını açın.

Bir MZ L üç diseksiyon mikroskobunda 480 nanometre uyarma ve 510 nanometre emisyonda GFP iki filtre setini seçerek GFP tespiti için filtre setini ayarlayın. Ardından, kalınlaştırılmış polikarbonat petri kabı kapaklarını% 70 etanol püskürterek sterilize edin. Petri kabı tabanını kaplamak için kullanılan özel kapaklar, görüntü toplama sırasında yoğuşmayı önler.

Bombardımana tutulmuş cuan içeren plakaları robotik platforma yerleştirin ve yerlerine sabitlemek için yanal ayar vidasını sıkın. Şimdi hem robotik platformu hem de görüntü alımını kontrol eden özel yazılım uygulamasını açın. Ayrıca yazılımı kullanarak yazılım beyaz ışık kontrol anahtarını açın, platformu ana konuma yönlendirin.

Bu, pozisyonlara girmeden önce yapılır. Motor sekmesindeki her küçük kablo girişi için ilk plakayı seçin. Platform, Petri kabının merkezini mikroskobun hedefi altında konumlandıracaktır.

Hareket mesafesi düğmelerini kullanarak, görüntü toplama için ilk CU LEADIN'i hassas bir şekilde konumlandırın. Canlı mod özelliğini kullanarak, kucaklama kurşununu uygun viewalanına taşıyın İlk kucaklama kurşunu için, odağı ayarlamak ve büyütmeyi 1.6 x'e ayarlamak için diseksiyon mikroskobu üzerindeki manuel düğmeleri kullanın. İlgilenilen bölge ayarlandıktan sonra, bu konumu ekle düğmesine tıklayın.

Yazılım, bu bölgenin koordinatlarını bir konum planlama dosyasına ekleyecek ve platform, plakalar üzerinde kalan tüm kaplamalar için plaka ayar konumlarının merkezine geri dönecektir. Hareket mesafesi düğmelerini kullanarak, aynı plaka üzerinde kalan koanın odağını ayarlamak için robotik platformdaki her bir plakanın altında bulunan üç manuel tesviye vidasını kullanın. Tüm coan'ın tüm koordinatları girildikten sonra, konum programı koordinatlarını kaydedin.

GFP için mavi olan ışık türü ve pozlama ayarı gibi görüntü toplama parametrelerini girin ve beraberindeki yazılı protokolde açıklandığı gibi görüntülerin nerede saklanacağını belirtin. Yakalama süresi kontrol sekmesine gidin ve görüntü alma zaman aralığını ve görüntü toplamanın toplam döngü sayısını ayarlayın. Görüntüler genellikle 100 saat boyunca her saat toplanır.

İyi tanımlanmış gen ekspresyon profillerinin oluşturulması. Pozisyon programı sekmesini açarak ve ardından çalıştırma programı düğmesine tıklayarak görüntü alımını başlatın. 100 saatlik görüntü toplama işleminin sonunda görüntü toplama sistemini yabancı ışıktan izole edin.

Her biri yaklaşık beş megabayt olan yüksek çözünürlüklü görüntüler, görüntü analizi için hazırdır. Her klasörden 100 ardışık görüntüyü bir araya getirmek için görüntü hazır'ı kullanın. Görüntü işlemeyi hızlandırmak için tüm sıralı görüntüleri çerçeveler olarak içe aktarın ve 800 x 600 piksel olarak yeniden boyutlandırın.

Ardından, tüm çerçevelerde görünen ve görüntü referansında seçilen GFP noktalarını kullanan yeni tanıtılan bir katmandaki işaretleri kullanın. Hizalama tamamlandığında her görüntüyü manuel olarak hizalayın, referans olarak kullanılan katmanı silin ve dosyayı tek bir PSD dosyası olarak kaydedin. Ayrıca, en yüksek çözünürlüğü kullanarak tüm kareleri tek bir MOV dosyası olarak dışa aktarın.

Dosyalar artık GFP ölçümünü başlatmaya hazırdır. MOV dosyasını açmak ve 400 x 300 piksellik bir alanı kırpmak için J görüntüsünü kullanın. Ardından, kırmızı ve yeşil kanallar için RGB bölme aracını kullanarak sıralı görüntüleri kırmızı, mavi ve yeşil kanallara ayırın.

Her dilim eklentisi aracı için ölçülen ROI'yi çıkararak arka plan floresansını çıkarın. Eşik seviyelerini ayarlayarak ve piksel başına ortalama gri tonlama değerini ve GFP ifade eden piksellerin toplam sayısını ölçmek için tasarlanmış bir eklenti kullanarak GFP ifadesini hesaplayın. Resimdeki çıktı değerlerini kopyalayın J.Son olarak yeşil ve kırmızı kanalların çıktı değerlerini Microsoft Office'e yapıştırın.

Görüntü hizalamanın sonuçları hakkında size bir fikir vermek için daha fazla veri manipülasyonu için Excel. Bu ilk animasyon, 100 saatlik deney sırasında robotik platformun yeniden konumlandırılmasının yanlışlığını gösteriyor. Nokta hareketi, manuel görüntü hizalamasından sonra robotik platformun her zaman noktasında tam olarak aynı konuma geri dönememesinden kaynaklanan bir artefakttır, GFP ifade eden hücreler kolayca gözlemlenebilir ve bu izleme sisteminin benzersiz özellikleri kolayca görselleştirilebilir.

Bu animasyonun notayı tekrarladığı gibi, daire içine alınmış GFP ifade eden hücreler, kırmızı daire içine alınmış hücre, bombardımandan 18 ila 20 saat sonra ifadede çok hızlı bir düşüş gösterirken, beyaz daire içine alınmış hücre, GFP ifadesinin gecikmeli bir başlangıcını gösterir. Animasyonların yanı sıra, bu prosedür, lima fasulyesi hedef dokusunda zaman içinde GFP ekspresyonunun hızlı bir şekilde ölçülmesine izin verir. Bu temsili sonuçlar, CAMV 35 S promotörü ve dört farklı soya fasulyesi promotörü kullanılarak promotör yoğunluğunun karşılaştırmalı nicelleştirilmesini göstermektedir.

Size az önce DNA'yı çimlenme katalinine nasıl ekleyeceğinizi gösterdik. Lima damar tohumları, katalini robotun üzerine yerleştirir, görüntü analizi için görüntüleri toplar ve bu görüntüleri analiz eder. Bu prosedürü, klon bitki destekleyicilerini doğrulamak için laboratuvarımızda rutin olarak kullanıyoruz.

Farklı bitki destekleyicilerinin tanıtılmasından büyük miktarda veri üretilebilir. Bununla birlikte, bu prosedür, bu prosedürü yaparken yanlış gidebilecek birçok adımla karmaşıktır, taze hat fasulyesi tohumu ile başlamak veya en azından uygun şekilde depolanmış yüksek kaliteli tohum kullanmak önemlidir. Bombard kesim kapağını almak ve robota hızlı bir şekilde kurmak ve yoğuşma sorunlarını en aza indirmek için kalın evcil hayvan kabı kapağını kullanmak da önemlidir.

Ve son olarak, kullandığımız GFP'nin Harvard Üniversitesi'ndeki Gen HIN Laboratuvarı olan SGFP adlı başka bir sürüm olduğunu lütfen unutmayın. Bu GFP çok kararlı değildir ve gen ifadesindeki hızlı değişiklikleri izlemek için daha iyi olabilir. Ve bu bizi izlediğiniz için itra biziz.

Ve deneylerinizde iyi şanslar.