Name: Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Keşfedin, C57BL/6 farelerinden elde edilen splenositlerden CD40 aktivasyonu ile murin B hücrelerinin genişletilmesini. Bu yöntem, immünoterapi araştırmaları için antijen sunan hücre modelleri oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz lütfen Dr. Clemens Wendtner tmuCD40 Ligandla HeLa hücre hattı sağlamak için teşekkür ederiz.

Splenositlerin fare CD40 aktive B hücreleri (mCD40B) üretimi için protokol iki bölüme ayrılmıştır: Kısım A olarak kullanılacak plaka HeLa hücreleri (tmuCD40L HeLa), ifade fare CD40 ligand (CD40L) hazırlanmasında gösteriyor. besleyici hücreler bağlı. Bölüm B, gerçek bir fare CD40-B kültür açıklar. A. besleyici hücreler Hazırlama (tmuCD40L HeLa) TmuCD40L HeLa tamamen konfluent haline asla yapışık bir insan epitel hücre hattı,. Hücreler bu nedenle haftada iki kez parçalı. Daha fazla 6 hafta içinde Kültürleme tavsiye edilmez. <ol><li> Steril bir pipet ile primer kültür eski orta çıkarın ve 10 ml 1x PBS ile yıkayın hücreleri. PBS ile yıkandıktan sonra aspire. </li><li> 37, 10-15 dakika için 75 cm 2 balon 4 ml 1x tripsin / EDTA ekleyin ° C. Hücreleri ayırmak için hafif dokunarak kullanın. </li><li> Vahşi tip orta 10 ml ekleyin ve tripsin ile sindirim durdurmak için yavaşça dönebilen. </li><li> Hücre süspansiyonu steril bir pipet yardımıyla 50 ml tüp içine aktarın ve 7 dakika boyunca 265 xg'de hücreleri aşağı döndürün. </li><li> Süpernatantı ve vahşi tip orta 10 ml hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısı sayın ve uygun sayıda hücre ile üç 50 ml tüpler hazırlamak: <ol><li> Altkültürün 2.5 x 10 6 hücre </li><li> Fare CD40 B hücre kültürü için kullanılan / iyi ışınlanması için 0.4 x 10 6 hücre </li><li> dondurmak için geri kalan (gerekirse). </li></ol></li><li> 7 dakika boyunca 265 xg'de hücreleri aşağı spin. </li><li> Süpernatantı. <ol><li> Alt kültüre için tekrar süspansiyon 2.5 ° C ile% 5 CO 2 75 cm 2 hücre kültürü şişesi 10 ml seçim ortamda (hücre yoğunluğu 2.5 x 10 5 hücre / ml) ve 37 hücreler inkübasyon x 10 6 hücre. Haftada iki kez hücreleri bölün. </li><li> Fare CD40 B hücre kültürü için bir adet 6-plaka için 2,4 x 10 6 hücre gerekir. 0.2 x 10 6 hücre / mL yoğunluğu vahşi tip orta tmuCD40L HeLa hücreleri yeniden süspanse edin ve 78 Gy ışın tedavisi. Yanı sıra, her 37 ° inkübe ° C ile% 5 CO 2 hücre süspansiyonu Plaka 2 mL. TmuCD40L HeLa hücrelerinde yapışık B-hücre uyarılması için hazırlanmış tabak kullanın (en az 4 saat: mikroskop kullanarak bağlılık kontrol edin; B-hücre stimülasyon başlatmak için 24 saat daha beklemek gerekmez). (B. devam) </li></ol></li></ol> B. murin CD40 B hücre kültürü CD40 stimülasyon (gün 0) splenositlerin I. Hazırlık: Lütfen dikkat: besleyici hücreler yapışık olduğu tespit devam etmeden önce. Her zaman fare interlökin-4, β-mercaptoethanol ve büyüme ortamına siklosporin, kullanımdan hemen önce taze çözümler ekleyin. <ol><li> C57BL / 6 farelerinde (H-2b haplotip), dalak inceleyin ve 10-20 ml DMEM iki kez yıkayın, başka bir tüp 10ml pipet ile transfer Gentamisin [15μg/mL] ile desteklenmiş. Fare transfer kirleticiler (örneğin saç) kaçının. (100μm) bir hücre süzgecinden geçirilerek dalak Kıyma ve orta başka bir 10 mL süzgeç durulayın. Oda sıcaklığında 7 dakika süreyle 265 xg'de splenositlerin Spin, 7ml muCD40-B hücre, orta ve Ficoll yoğunluğu santrifüj ayrı lenfositlerin tekrar süspansiyon haline getirin. 5 ml, 30 dakika için 450 xg'de 15 mL tüp ve santrifüj Fare-Pancoll (oda sıcaklığında önceden ısıtılmış) tabakası hücreleri oda sıcaklığında frensiz yapmak için. </li><li> Arayüzü rahatsız lenfosit tabakası bırakarak, en üst katmanı çizin. Taze bir 50 ml tüp lenfosit katmanı Transferi, diğer hücreleri çıkarmak için 7 dakika süreyle 265 xg'de aşağı iplik Gentamisin [15μg/mL] ile 30ml DMEM ile bir kez yıkayın. Süpernatantı atın ve mCD40-B yıkama orta 10 ml hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısını belirler. Hücre süspansiyonu bir kısım sayarak hücre sayısını belirler. </li><li> 7 dakika boyunca 265 xg'de gerekli miktarda hücre aşağı spin. 6-iyi bir plaka için 5 x 10 6 hücre / kuyu, böylece plaka başına 30 x 10 6 hücre ihtiyaç vardır. </li><li> Süpernatantı ve büyüme faktörü olarak, siklosporin 100 mcM β-mercaptoethanol ve 0.63 mcg / ml önlemek için 1.25 x 10 6 hücre / ml taze interlökin-4 1 U / ml ile desteklenmiş mCD40-B kültür ortamı lenfositlerin tekrar süspansiyon T-hücrelerinin akıbet (Verilen konsantrasyonları bir ml kültür ortamı bakın!). </li><li> 6 plaka tmuCD40L HeLa hücreleri ile ön inkübasyona süpernatantı. </li><li> 6 plaka her bir kuyu için 4 ml (1.25 x 10 6 hücre / ml) lenfosit süspansiyonu yavaşça ekleyin. </li><li> 37 ° ° C,% 5 CO 2 plaka inkübe . </li> 3. günde hücreleri (II.1 ile devam edin.) Reculture. </ol> II. MCD40B hücreleri (3. gün ve daha sonra haftada iki kez) altkültürünün: <ol><li> 50 ml tüp içine 10 ml pipet ve havuz onları şiddetle yukarı ve aşağı pipetleme Hasat mCD40B hücre kümesi. </li><li> 7 dakika boyunca 265 xg'de Spin ve süpernatant tamamen mCD40-B yıkama orta yerine. Bir kısım hücre miktarını sayma, 7 dakika boyunca 265 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. 0.75 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon mCD40-B kültür ortamında süspanse edin mCD40B hücreleri. </li><li> 1 U / ml, 100 mcM β-mercaptoethanol ve orta siklosporin 0.63 mcg / ml 'lik bir konsantrasyon interlökin-4 fare taze çözümler ekleyin. </li><li> 6 plaka ışınlanmış tmuCD40L HeLa hücreleri önceden inkübe süpernatantı. </li><li> 6 plaka her iyi mCD40B hücre süspansiyonu (0.75 x 10 6 hücre / ml) 4 mL yavaşça ekleyin. </li><li> 37 ° plakaları inkübe ° C,% 5 CO 2 . </li><li> Yine her 3-4 günde bir toplam 14 gün sonra yüksek saflıkta fare CD40 aktive B hücreleri ile sonuna kadar hücreleri altkültürü. </li></ol> C. Sorun Giderme: CD40-B hücreleri büyümek ne olur değil mi? <ol><li> Besleyici hücreler CD40 ligand ifade için kontrol ettiniz? </li><li> 24 saat daha eski uyarılması için kullanılan plaka bağlı besleyici hücreler musunuz? </li><li> Mycoplasma ile bir kirlenme var mı? </li><li> Takviyesi için kullanılan interlökin-4 çözüm taze çözülmüş ve uygun biyolojik aktivite var mı? </li><li> Β-mercaptoethanol ve siklosporin A doğru konsantrasyon eklendi? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="Şekil 1 a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1a. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="Şekil 1 b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1 b"> Şekil 1b. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="Şekil 1 d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1 d"> Şekil 1d. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li>
<li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li>
<li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Ligand-activated%2C+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. S. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li>
</ol>

Deneylerde laboratuar hayvanları tutmak için ulusal ve Avrupa kurallarına uygun olarak yapıldı. Alman hayvan refahı hukuk değinen hayvanların uygun yetkililer tarafından düzenli olarak kontrol altına alındı.

Bu protokolün, özellikle de verimli nesil fare CD40-aktive B hücreleri verimli CD40-uyarıcı ve kullanılan fare gerginlik türü, kökeni ile ilgili Değişiklikler mümkündür. Ahmedi et al. CD40 ligand fare ile transfekte fare fibroblastlar için benzer sonuçlar vermiştir. Xeno-antijen Bu bağlamda sunumda kesin olarak hariç, ama güvenlik ve in vivo toksisite ile ilgili yoğun çalışmalar insan transfekte HeLa hücreleri kullanarak bu ayarı inflamasyon veya oto-bağışıklık reaksiyonu için hiçbir belirti verdi olabilir . An...

A. Medya Hazırlanışı: <table border="1"><tbody><tr><td> Besleyici hücre vahşi tip orta </td><td> Besleyici hücre seçimi orta </td><td></td></tr><tr><td> Reaktif </td><td> Konsantrasyon </td><td> Reaktif </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 300 mcg / mL </td><td> L-Glutamine </td><td> 300 mcg / mL </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 10 </td><td> FBS </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 10 mM </td><td> Hepes </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> 15 mcg / mL </td><td> Gentamisin </td><td> 15 mcg / mL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycin B </td><td> 0.2 mg / ml </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B yıkama orta </td><td> mCD40-B kültür ortamı </td></tr><tr><td> Reaktif </td><td> Konsantrasyon </td><td> Reaktif </td><td> Konsantrasyon </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 580 mg / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 580 mg / ml </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 4,5 mg / ml </td><td> Glikoz </td><td> 4,5 mg / ml </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 10 mM </td><td> Hepes </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> 15 mcg / mL </td><td> Gentamisin </td><td> 15 mcg / mL </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0.1mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> % 10 </td></tr></tbody></table> B. Çeşitli Reaktifler: <table border="1"><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Hiçbir sipariş </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21.875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41.965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Kedi No H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Delta seçin </td><td> Art No 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Lonza </td><td> Kedi yok DE14-802C </td></tr><tr><td> Hepes Tampon </td><td> PAA </td><td> Kedi yok S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> PAA </td><td> Kedi No P02-015 </td></tr><tr><td> Rekombinant murin İnterlökin-4 </td><td> Immunotools </td><td> Kedi yok 12340045 </td></tr><tr><td> Bir Siklosporin </td><td> Novartis </td><td> Kedi yok NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> Tripsin / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. Çeşitli Sarf Malzemeleri: <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif </td><td> Şirket </td><td> Hiçbir sipariş </td></tr><tr><td> Steril pipet uçları </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-plaka </td><td> Nunc </td><td> Kedi yok 140.675 </td></tr><tr><td> 50ml konik tüp </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Kedi yok 352.070 </td></tr><tr><td> Doku kültürü şişesi </td><td> Sarstedt </td><td> Kedi yok 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murin model b hücreleri cd40 aktivasyonu

Murine Model of CD40-activation of B cells

B hücreleri üzerinde araştırma CD40 aktivasyonu ve antijen sunumu kapasitesi iyileştirdiğini göstermiştir. Interlökin-4 ve CD40 ligand (CD40L) ile uyarıldığında, insan B hücreleri, 14 gün içinde son derece saf CD40-B hücreleri (çok büyük miktarda küçük miktarlarda periferik kan zorluklar olmadan açılabilir&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Hasta başına kanser hastalarının yanı sıra sağlıklı donörlerin hücrelerinin)<sup&gt; 1-4</sup&gt;. CD40-B hücreleri önemli lenf nodu homing molekülleri ifade ve T hücreleri çekebilecek<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Ayrıca verimli T hücrelerine, süreç ve mevcut antijenlere kadar sürebilir<sup&gt; 6,7</sup&gt;. CD40-B hücreleri sadece başbakan naif değil gösterilen, aynı zamanda bellek T hücreleri genişletmek<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Bu nedenle, CD40-aktive B hücreleri (CD40-B hücreleri) bir alternatif kaynak olarak çalışılmıştır immüno-uyarıcı hücre tabanlı immunotherapy1, 5,10 antijen sunan hücreler (APC). CD40-B hücreleri in vivo etkili T hücre yanıtları uyardığı ve fare CD40 aktive B hücreleri üretimi için bir hücre kültürü sistemi kurdu yatan mekanizma çalışma konusunda daha fazla çalışma için. Splenositlerin kullanılması veya CD40 aktivasyonu için C57BL / 6 fareler B hücreleri saflaştırılmış, optimal koşullar aşağıdaki gibi tespit edilmiştir: C57BL / 6 farelerinde (H-2b haplotip) lenfositler dalak itibaren yoğunluk gradiyenti santrifüj ve HeLa ile birlikte kültürlü arıtılmış rekombinant fare CD40 ligand (tmuCD40L HeLa) ifade hücreleri<sup&gt; 11</sup&gt;. Hücreler, 3-4 günde bir recultured ve CD40L, interlökin-4 gibi temel bileşenleri, mercaptoethanol ve siklosporin A takviye edilir. Bu protokolde insan CD40-B hücreleri (Şekil 1a, b) APC-fenotip benzer tam aktif fare CD40-B hücreleri (mCD40B) nasıl elde göstermektedir. CD40 stimülasyon hücre kültürü 14 gün içinde hızlı bir sonucudur ve yüksek saflıkta (&gt;% 90) CD19 + B hücreleri genişleme (Şekil 1c, d) yol açar. -Transfekte olmayan hücreleri ile kirlenmesini önlemek için, transfektanları fare CD40 ligand ekspresyonu (Şekil 2) düzenli olarak kontrol edilmesi. Murin CD40 aktive B hücreleri in vitro ve in vivo olarak APC olarak çalışması için kendi potansiyelini araştırmak için B-hücre aktivasyonu ve farklılaşması yanı sıra çalışma kullanılabilir. Ayrıca, tümörlere karşı tedavi veya önleyici aşı oluşturulması için umut verici bir aracı temsil eder ve bu yaklaşımın immünojenite ve güvenlik ile ilgili sorulara cevap vermeye yardımcı olacak<sup&gt; 12</sup&gt;.

Bu video, CD40 aktivasyonu ve dokunulmazlık indüksiyonu eğitim için bir model antijen sunan hücre (APC) olarak da kullanılabilir C57BL / 6 farelerin dalak, fare B hücreleri genişleme prosedürü göstermektedir.

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

B hücreleri üzerine yapılan araştırmalar, CD40 aktivasyonunun bu hücrelerin antijen sunum kapasitesini artırdığını göstermiştir. İnterlökin-4 ve CD40 ligandı ile stimüle edildiklerinde...

Merhaba, benim adım Tanya Wig; Köln Üniversite Hastanesi'ndeki tümör immünolojisi ve transplantasyon immünolojisi laboratuvarında çalışan bir doktora öğrencisiyim. Çalışmalarım temel olarak denizel CD 40 aktive edilmiş B hücrelerine ve bunların in vivo ortamda immün yanıtları indükleme yeteneklerine odaklanmaktadır. Başlangıçta, insan CD 40 B hücreleri, dendritik hücrelere alternatif antijen sunan hücreler olarak üretilmiştir.Bu hücrelerin immünterapötik amaçlarla kullanılması hedeflenmektedir. Klinik ortamlarda, CD 40 B hücreleri, CD 40 sinyali ve IL 4 stimülasyonu altında üretilir. Bu sisteme göre, hücreler birkaç hafta boyunca genişletilebilir. Laboratuvarımızda PBMC'den insan CD 40 B hücrelerinin üretimini optimize ettikten sonra, bu prensibi farelere başarıyla aktardık ve bugün size göstermek istediğim konu da budur.Dalaktan başlayarak, 14 günlük hücre kültürü içerisinde denizel CD 40 aktive edilmiş B hücreleri üretiyoruz. Ana adımlar besleyici hücrelerin hazırlanmasıdır; bu nedenle, adheran özellik gösteren, 78 gray ile ışınlanan ve altı kuyucuklu plakalara ekilen denizel CD 40 ligandı transfekte edilmiş feeder hücre hattını kullanıyoruz. İkinci olarak, black six farelerden t

murine-model-of-cd40-activation-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

Bu videoda, bakteriyel lipopolisakkarit ve intravenöz immünoglobuline yanıt olarak kemik iliği kaynaklı makrofajların aktivasyonunu gösteriyoruz.

Antikorlara Yanıt Olarak Fare Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Aktivasyonu

Burada, sinjeneik CD4 + CD45RByüksek T hücrelerinin T ve B hücresi eksikliği olan alıcılara evlat edinici transferi yoluyla farelerde kolon iltihabını indüklemek için bir protokol sunuyoruz. Klinik ve histopatolojik özellikleri insan inflamatuar barsak hastalıklarını taklit eder. Bu yöntem, kolon iltihabının başlaması ve hastalığın ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

BM12 lenfositlerinin bir C57BL/6 alıcısına transferi, sistemik lupus eritematozusun yerleşik bir modelidir. Burada, bu modeli kullanarak hastalığın nasıl başlatılacağını ve T foliküler yardımcı hücrelerin, germinal merkez B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini açıklıyoruz.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Burada, bir protokol saf CD4 T hücre (T hücre) etkinleştirme, yayılması ve GM-CSF kemik iliği (BM) tarafından indüklenen Th1 farklılaşma vivo içinde belirlenmesi için mevcut-dendritik hücreler (DC) türetilmiş. Ayrıca, bu iletişim kuralını BM ve T-hücre izolasyon, DC üretimi ve DC ve T hücreli evlat edinen transfer açıklar.

Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma

Protokol, genetik olmayan kusurlu transkripsiyon uzaması için in vitro murine karsinom modelini ayrıntılarıyla anlatır. Burada, CDK9 kronik inhibisyonu taklit etmek ve klinik olarak aşırı TEkesinlikle fenomen çalışma pro-inflamatuar yanıt genleri boyunca RNA Pol II üretken uzama bastırmak için kullanılır, tüm kanser türlerinin yaklaşık% 20 mevcut.

Kanserlerde Yaygın Genetik Olmayan TranskripsiyonEl Uzaması Defektlerini (TEkesinlikle)Incelemek için Kronik CDK9 İnhibisyonu Bir Murine Hücre Hattı Tabanlı Modeli

Burada in vivo B-1a hücre göçve lokalizasyonu incelemek için retroviral aşırı ekspresyon ve murine B-1a hücrelerinin benimsenen transferi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, donör B-1a hücre lokalizasyonunun niceliği veya donör hücre kaynaklı salgılanan faktörlerin benimsenme sonrası salgılanan faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli downstream fonksiyonel tahliller için uzatılabilir.

Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer

Burada periton, dalak ve kemik iliği dokularındaki murin immün B hücre bölmesinin akış sitometrisine göre heterojenliğinin basit bir analizinde açıklanmaktadır. Protokol diğer fare dokularına uyarlanabilir ve genişletilebilir.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Keşfedin, C57BL/6 farelerinden elde edilen splenositlerden CD40 aktivasyonu ile murin B hücrelerinin genişletilmesini. Bu yöntem, immünoterapi araştırmaları için antijen sunan hücre modelleri oluşturur.

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

Daha fazla video keşfet