Bitki Hücre Duvarları kapsamlı Kompozisyonel Analizi (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm I: Lignin

Bitki hücre duvarlarının lignin içeriğinin ve bileşiminin belirlenmesi, çeşitli ekstraksiyonlara tabi tutulan kurutulmuş bitki materyali ile başlar. Elde edilen materyal sadece hücre duvarlarından oluşur ve daha sonra lignin içeriğini belirlemek için bölünür. Duvar malzemesi, asetil bromür ile hidrolize tabi tutulur ve çözündürülmüş monoaller, lignin bileşiminin belirlenmesi için UV spektrometresi ile ölçülür.

Duvar malzemesi sitoliz ile hidrolize edilir. Çözündürülmüş lignin bileşenleri daha sonra, kütle spektrometresi ile birlikte gaz kromatografisi kullanılarak ayrılabilen ve miktarı belirlenebilen uçucu trimetil salin türevlerine türetilir. Matris polisakkarit bileşiminin ve selüloz içeriğinin belirlenmesi, Bitki Hücre Duvarlarının Kapsamlı Bileşimsel Analizi, İkinci Bölüm Karbonhidratlar başlıklı başka bir videoda gösterilmiştir.

Merhaba, ben Marcus Pauley, Michigan Eyalet Üniversitesi'ndeki Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi'ndeki Duvar Analitik tesisinin başkanıyım. Ben Cliff Foster, analitik hücre duvarı tesisinin müdürüyüm. Bitki biyokütle numunelerinin içeriğinin ve bileşiminin nasıl belirleneceğine ilişkin prosedürü size göstereceğiz.

Bitkiler güneşten gelen ışık enerjisini biyokütle gibi kimyasal enerjiye dönüştürür. Bitki biyokütlesi, esas olarak, tüm bitki hücrelerini kaplayan çeşitli polimerlerden oluşan karmaşık bir ağ olan hücre duvarlarından oluşur. Burada, oldukça bol miktarda yenilenebilir bir kaynak olan bu lignin Cellose X'i biyoyakıtlara dönüştürme potansiyelini değerlendirmek için bitki hücre duvarı malzemelerinin bileşimini belirliyoruz.

Bugün, ikinci bölüm olan Bitki Hücre Duvarlarının Kapsamlı Bileşimsel Analizi başlıklı başka bir videoda polifenol lignine odaklanacağız. Polisakkarit analizine odaklanacağız. Bu prosedüre başlamak için, iki mililitrelik sarılmış vidalı kapaklı tüpe üç adet 5,5 milimetre paslanmaz çelik bilye ve kabaca 60 ila 70 miligram hava veya dondurularak kurutulmuş bitki materyali ekleyin.

Malzeme, bir öğütme ve dağıtma robotu olan eyewall kullanılarak ince bir toz haline getirilebilir. Göz duvarı tüpü alır ve 30 saniye boyunca sallar, burada metal bilyeler nedeniyle malzeme ince bir toza öğütülür, daha sonra öğütülür, ancak kompakt bitki tozu alternatif bir robotik olmayan düşük verimli prosedür gevşetilir. Bir retronun kolaylaştırılması ikinci bölümde sunulmuştur, öğütülmüş malzeme girdabına 1,5 M %70 sulu etanol ekleyin, iyice girdap yapın ve oda sıcaklığında santrifüjleyin.

Bu işlem çoğu proteini ve hücre organelini çözündürür, süpernatanı aspire eder ve hacme bire bir hacim ekler. Alkolde çözünmeyen pelete kloroform metanol çözeltisi, pelet ve santrifüjü yeniden döndürmek için iyice çalkalayın. Kloroform metanol, santrifüjlemeden sonra lipitler gibi hidrofobik bileşikleri çıkarır, süpernatanı aspire eder ve peleti ve 500 mikrolitre asetonu yeniden süspanse eder.

Numuneyi kurutmak için, çözücüyü kuruyana kadar 35 santigrat derecede bir hava akımı ile buharlaştırın, kurutulmuş numuneler daha sonraki işlemlere kadar oda sıcaklığında saklanabilir. Numune reusundan nişastanın uzaklaştırılmasını başlatmak için, peleti ve 1,5 mil 0,1 molar sodyum asetat pH beşini tüpleri askıya alın ve nişastayı jelatinleştirmek için bir ısıtma bloğunda ısıtın. Süspansiyonu buz üzerinde soğuttuktan sonra, nişasta parçalayıcı enzimi ekleyin, tüpü karıştırın, kapatın ve süspansiyonu gece boyunca iyice inkübe edin.

37 santigrat derecedeki çalkalayıcıda, döner bir çalkalayıcı uygun karıştırma sağlar. Gece boyunca inkübasyondan sonra, 10 dakika boyunca 100 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda ısıtarak sindirimi sonlandırın. Daha sonra çözünmüş bir nişasta içeren süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Kalan peleti üç kez yıkayın 1.5 her seferinde mil su girdaplama, santrifüjleme, ve daha önce gösterildiği gibi boşaltarak. Son olarak, peleti 500 mikrolitre aseton içinde yeniden süspanse edin ve çözücüyü kuruyana kadar 35 santigrat derecede bir hava akımı ile buharlaştırın. İzole edilmiş hücre duvarı veya bacağı içeren, selüloz içermeyen kurutulmuş numuneler daha fazla analiz için hazırdır ve oda sıcaklığında saklanabilir.

Hazırlanmış hücre duvarı malzemesinin bir ila 1,5 miligramını tartarak başlayın. Malzeme, ikinci bölümde gösterildiği gibi elle veya göz duvarı ile otomatik bir şekilde tartılabilir. Tüpün altındaki hücre duvarı malzemesini toplamak için tüp duvarlarını 250 mikrolitre asetonla durulayın ve asetonu hava akışı altında çok nazikçe buharlaştırın.

Aseton yavaşça buharlaştıktan sonra, iki duvar boyunca buzlu asetik asit içinde hacme 100 mikrolitre taze yapılmış% 25 hacimce asetil bromür ekleyin. Sıçramayı önlemek için, ince bir bromür, lignin polimerini asetillenmiş monoslarına ayırır. Ardından hacimsel şişeyi kapatın ve iki saat boyunca 50 santigrat derecede ısıtın.

Her 15 dakikada bir dört manifatura ile bir saat daha ısıtın ve son olarak buz üzerinde soğutun Şişeyi soğuttuktan sonra oda sıcaklığında 400 mikrolitre iki molar sodyum hidroksit ve 70 mikrolitre taze hazırlanmış 0.5 molar hidroksil lamine hidroklorür girdabı, hacimsel şişeler ekleyin. Daha sonra, hacimsel şişeyi buzlu asetik asit kapağı ile tam olarak iki mililitre işaretine kadar doldurarak çözeltiyi nötralize edin ve hidrolize edilmiş ve çözündürülmüş mono lalleri içeren çözeltinin 200 mikrolitresini UV'ye özgü 96 oyuklu bir plakaya pipetlemek için birkaç kez ters çevirin ve plakayı 280 nanometrede bir kuyu plakası okuyucusunda okuyun. Plakayı en az üç kez okuyun ve partiküller absorbans değerlerinde hafif bir değişikliğe neden olabileceğinden absorbansın ortalamasını alın.

Yazılı protokolde sunulan formülle uygun bitki katsayısını kullanarak ince bromür çözünür lignin veya A BSL'nin yüzdesini belirleyin. Lignin, bitki materyalindeki lignin bileşimini belirlemek için esas olarak P hidroksi fenol, gua ACell ve Spring Roll birimleri olmak üzere üç alt birimden oluşan bir polifenol ağıdır. Sitoliz için yaklaşık iki miligram hücre duvarı malzemesini vidalı kapaklı bir cam tüpe aktararak başlayın.

Ardından, dioksan içinde %2.5 bor tri florür etil at ve %10 etan tiyol çözeltisini hazırlamaya hazır olun. Dioksan çok tehlikeli olduğundan, davlumbazdan herhangi bir numune veya ekipman çıkarmayın. Çok dikkatli çalışmayı ve dioksan şişesindeki kayıp hacmi nitrojen ile değiştirmek için nitrojen gazı ile dolu bir balon kullanmayı unutmayın.

Aşağıdaki hacimleri karıştırarak çözeltiyi hazırlayın: numune başına: 175 mikrolitre, dioksan 20 mikrolitre, ETSH beş mikrolitre, BF üç. Karıştırdıktan sonra, her numuneye 200 mikrolitre çözelti ekleyin. Flakon üst boşluğunu nitrojen gazı ve kapakla temizleyin.

Numuneleri hemen 100 santigrat derecede dört saat boyunca ısıtmaya devam edin, her saat sonunda hafifçe karıştırın. Theo, beş dakika boyunca buz üzerinde lizis reaksiyonu yapar. Daha sonra nötralize etmek ve girdap yapmak için 150 mikrolitre 0.4 molar sodyum bikarbonat ekleyin.

Lignin parçalanma ürünlerinin temizlenmesi için bir mil su ve 0,5 mil asetat girdabı ekleyin ve fazların ayrılmasına izin verin. Etil asetat tabakası üstte ve su altta olacaktır. Lignin bileşenlerini içeren üst Ethel asetat tabakasının 150 mikrolitresini iki millik bir tüpe aktarın ve su aktarılmadığından emin olun.

Üst Ethel asetat tabakasından transferin ardından, çözücüyü hava ile bir yoğunlaştırıcı kullanarak buharlaştırın. 200 mikrolitre aseton ekleyin ve buharlaştırın. Fazla suyu çıkarmak için tedaviyi aseton ile iki kez tekrarlayın.

Lignin bileşenlerini uçucu trimetil Cy Lane türevlerine türetmenin yanında. Her tüpe 500 mikrolitre etil asetat, 20 mikrolitre pürin ve 100 mikrolitre NO biss trimetil silindir asetamid ekleyin. 25 santigrat derecede iki saat inkübe edin.

İki saatin sonunda, reaksiyonun 100 mikrolitresini bir GC MS şişesine aktarın ve 100 mikrolitre aseton ekleyin. Numuneleri dörtlü kütle spektrometresi veya alev iyonizasyon dedektörü ile donatılmış GC ile analiz edin. Koşunun sütunu ve ayrıntıları için lütfen ekteki yazılı protokole bakın.

İşte bitki materyali olarak kavak ağacı kullanılarak yapılan lignin analizinin bazı temsili sonuçları. Bu analize göre kavak materyalinin %22'si polifenol ligninden oluşmaktadır. Lignin bileşenlerinin bileşimi GCMS ile analiz edildi.

Tepe noktaları, tetra koan iç standardı kullanılarak nispi tutma süreleri veya sg ve h monomerleri için sırasıyla 2 99 CZ, 2 69 MZ ve 2 39 MZ'lik karakteristik kütle spektrumu simgeleri ile tanımlanır. Lignin bileşenlerinin bileşimi, toplam tepe alanının %100'e ayarlanmasıyla ölçülür Bileşim analizi, bu özel numunenin esas olarak sicim veya S birimleri içerdiğini gösterir. Bununla birlikte, Goya, aol veya G birimleri de bol miktarda bulunur.

Açıkçası, miktar ve monolial birim bileşimi bitki dokusuna ve türüne bağlı olarak değişebilir. Polisakkaritlerin analizi için bitki materyalinin lignin içeriğinin ve bileşiminin nasıl belirleneceğini size az önce gösterdik. İkinci bölüme dönün.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.