Name: Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Öğrenin, Drosophila melanogaster politen kromozomlarını antikor etiketleme için hazırlama yöntemini. Tükürük bezlerinin diseksiyonu ve squash tekniği ile gen ifadesi çalışmalarında kullanılan bu protokol, genetik araştırmalarda yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bayan V. Lephart Biz Bu çalışma, Sağlık hibe (GM62916) ve Ulusal Bilim Vakfı hibe (MCB0817107) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen sinek stokları bakım için teşekkür ederim.

Politen kromozomu squash hazırlanması için aşağıdaki protokol Johansen ve ark açıklanan prosedür uyarlanmıştır. (2009). 1. Üçüncü instar Drosophila larvaları Kültür Yüksek kaliteli squash hazırlıkları için optimal politen kromozom elde etmek için, bulursunuz kültür koşullarında (yani, yer yaklaşık 20 yumurta döşeme standart bir 4 "sinek şişe ve değişim her geçen gün yeni bir şişe içinde erkek sineklerin) seçin şişman bireylerin temel hala dolaşıp ama pupa devresi hemen önce ise 3. instar larvaları tırmanma ilk ürün. rutin kültür 21 ° C, ancak 18 ° C gibi bazı amaçlar için, örneğin daha uygun olabilir şişmandır kromozom verecektir grup / bantlar bölgelerde yüksek çözünürlükte görüntülenir gerekir. 2. Politen kabak malzemeleri <ul><li> Drummond diseksiyonu forseps (2) </li><li> Petri kapları (60 x 15 mm) </li><li> Buzlu mikroskop lamı (Fisher No 12-544-3) (poli-lizin kaplı) </li><li> 22 x 22 mm No: 15 kapak fişleri (Fisher No 12-520B) (Sigmacote ile kaplı; Sigma # SL2) </li><li> 22 x 40 mm No 15 kapak fişleri (Fisher No 12-530B) </li><li> Kim-mendil </li><li> 20X hedefi ile faz kontrast mikroskobu </li><li> Küçük Dewar (örneğin, vakum şişesi veya termos şişesi) </li><li> Uzun forseps </li><li> Tıraş bıçağı </li><li> Coplin Kavanoz </li><li> Lastik-Maid veya Tupperware tepsi (veya eşdeğeri yapışmalı, tepsi) </li><li> Parafilm (22 mm kareler halinde kesilmiş) </li><li> 175 g ağırlıkları </li></ul> 3. Fiksatifler ve çözümler <ol><li> 5X formaldehit stok. 0,74 g taze bir çözüm hazırlayın dH 2 O 4.0 ml ve 28 ul 1N KOH paraformaldehid. Sıcak - 65 ° C paraformaldehid çözülür ve ardından buz üzerinde saklayın. </li><li> Sabitleme 1. 5X formaldehit stoku 0.5 ml 10X PBS, 50μl Triton X-100, 3.45 ml dH 2 O ve 1.0 ml taze bir çözüm hazırlayın. Triton X-100 1 saat içinde dağıtmak ve kullanmak için ısıtın. </li><li> Sabitleme 2. 1.5 ml dH 2 O, 2.5 ml Asetik Asit, 1.0 ml ve 1 saat içinde 5X formaldehit stok ve kullanımı yeni bir çözüm hazırlayın. </li><li> Lactoacetic asit solüsyonu. 1 ml laktik asit, 2 ml dH 2 O, 3 ml asetik asit çözeltisi hazırlayın. </li></ol> 4. Politen kromozomu squash hazırlığı: <ol><li> Larvaları su ile durulayın ve diseksiyon için bir doku kültürü çanak PBS transfer. </li><li> Ağız forseps bir çift kanca ucu tutun, diğer çifti ile yol aşağı yaklaşık 2 / 3 vücudu tutun, ve ağız çekin tükürük bezleri maruz kalan kanca. Beyin tükürük bezleri ve göz antennal diskler ayırın ve yağ bezlerinin vücut ve herhangi bir diğer ilgili dokuların uzak teşrih. </li><li> De ilk iki sıra depresyon slayt ve 200-300 mikrolitre Sabitleme 2 sıra iki Sabitleme 1 200 mikrolitre ekleyin. Bir anda tükürük bezlerinin bir çift iyi bir Sabitleme 1 Transferi ve hedef epitop için gerekli süreyi, genellikle 1-2 dakika inkübe edin. (Not: histon modifikasyonları çoğu gibi bazı epitoplar, 5 dakika veya daha uzun fiksasyon gerekebilir.) </li><li> Kullanarak forseps Sabitleme 2 tükürük bezlerinde iyi 2 transfer ve iki dakika boyunca inkübe. </li><li> Bezleri, temiz bir Sigmacoted lamel Lactoacetic asit çözeltisi 10-30 ul aktarın. Lamel üzerine hafifçe polylysine kaplı bir mikroskop lamı alt ve bezleri slayt ve lamel arasındaki böylece dikey basınç uygulamadan, lamel alıp hemen bir kenarına özenle forseps ile lamel tutarak yayılan hücre lizis ve kromozomal kolaylaştırmak ve yavaşça dokusu üzerinde herhangi bir dikey basınç en aza indirmek için çalışıyor, biraz ileri ve geri hareket. Alternatif lamel yavaşça ileri ve geri hareket ettirmek için bile bir kalem silgi tarafı ya da bir parmak ucu kullanın. Lamel ileri ve geri hareket eden herhangi bir gecikme Lactoacetic asit çözeltisi maruz kalma üzerine daha sert hale eğiliminde olacaktır kromozomal silahların yayılmasını azaltmak için muhtemel olduğunu unutmayın. Çözüm bulanıklığı genellikle hücre ayrılması iyi bir göstergedir. Birkaç kez hafifçe kromozomal yayılmasını yardımcı bir kalem silgi tarafı da (dikey basınç önlemek için) oblik lamel dokunarak. </li><li> Hemen kromozom iyi yayılmış olup olmadığını belirlemek için 20 veya 40X amacı ile bir faz kontrast mikroskop altında dokuyu inceler. </li><li> Yayılmasını kromozomal yeterli olduğundan, temiz Kim-mendil bir yığın aşağı lamel yan slayt. Yerleştirin ikinci bir üst Kim silin ve kayma olur lamel herhangi bir yatay hareket kaçınarak, lamel konumlandırılmış ve sıkıca basarak üzerinde baş parmağınızı koyarak kromozom düzleştirmekKromozomlar. </li><li> Hazırlık amacı için uygun olup olmadığını belirlemek için mikroskop altında tekrar slayt inceleyin. Kromozom Ezici üzerine anlamlı hareket varsa, sonraki hazırlıkları Lactoacetic asit çözeltisi daha az hacimli kullanın. Yeterli sayıda uygun slaytlar elde edilene kadar tekrarlayın 4,1-4,8 adımları. Slaytların lamel üzerine 175 g ağırlık yerleştirin. </li><li> Küçük bir Dewar (örneğin, termos şişe) sıvı nitrojen ile doldurun. Uzun bir pens kullanarak, kaynama duruncaya kadar sıvı N 2 içine daldırma slayt, slayt kaldırmak ve lamel hemen çevirmek için bir köşesinde temiz bir jilet kenarı kullanabilirsiniz. 4 PBS ile Coplin kavanoza slayt hemen kullanılacaksa, yer ° C Aksi takdirde,% 95 etanol ile dolu bir Coplin kavanoza slayt toplamak. Don doku slayt yapıştırılır ve lamel kalır olmadığını teyit etmek için uzakta süblime sonra lamel inceleyin. Slaytlar geri kalan tüm slaytlara PBS (birkaç saat içinde kullanılmak için) veya etanol (uzun süreli depolama için) saklanır kadar tekrarlayın. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar , Yüksek kalite politen squash hazırlık elde etmek için ilk kritik adım, büyük tükürük bezi çekirdeklerinin yağ larvaları büyümektir. Ikinci yayma işlemi ile iyi bir tekniği, biraz pratik gerektirebilir. Bir ucu geliştirilmiş yayma başarısı için Ezici adım sırasında lactoacetic asit çözeltisi minimal volüm bulmak için. Bu kromozom yayılmasını yeterli uzaklıkta kromozom kolları yıkamak aşırı akışı güçleri oluşturmadan teşvik edecektir. Ayrıca Lactoacetic asit çözeltisi maruz kaldığında daha sert hale lamel ileri ve geri hareket eden herhangi bir gecikme, kromozom silahların yayılmasını azaltacaktır fazlalaştı. Her şey yolunda giderse, çok sayıda iyi yayılır politen kromozom olması gerekir. Şekil 1 çift yeşil bantlar bölgeler için bir marker ve bir boya ile etiketlenmiş, böyle bir hazırlık bir örnek gösterir lekeleri mavi bantlı bölgelerde. Yetersiz yayılan elde edilirse, kromozom, Şekil 2'de gösterildiği gibi küçük toplar gibi görünecektir. Öte yandan, çok fazla yayılmasını oluştu, chomosomes çok ince ve uzun veya Şekil 3'te görüldüğü gibi küçük parçalar halinde parçalanmış bazı durumlarda olacaktır. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 politen squash hazırlık JIL-1 histon H3S10 kinaz (kırmızı) Hoechst (mavi) iki antikor ile etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 yetersiz yayılıyor. Politen squash. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 çok fazla yayılmasını ile politen squash.

<ol><li>Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-mediated+transcription+at+active+loci+does+not+require+histone+H3S10+phosphorylation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila.</a> Development. 135, 2917-2925 (2008).</li>
<li>DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+GFP-fusion+proteins+on+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dros.+Inf.+Serv%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes.</a> Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).</li>
<li>Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+transcription+and+epigenetic+chromatin+modification+in+Drosophila+polytene+chromosome+squash+preparations+using+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies.</a> Methods. 48, 387-397 (2009).</li>
</ol>

Geleneksel kabak tespit protokollerinde asetik ve laktik asitler dahil, yayılmasını bantlar çözünürlük ve kromozomal kol kolaylaştırır ama ne yazık ki, bazı epitoplar bu tedavi hayatta yok. Böyle bir epitopu bir örnek H3S10ph (Cai ve ark, 2008). Asit tedavisi de GFP etiketli proteinler, DiMario ve ark doğasında floresan doyurur dezavantajı vardır. (2006) son zamanlarda aside duyarlı epitoplar antikor tespiti için GFP-antikor etiketleme gibi politen kromozom GFP-füzyon proteinine doğrudan görünüm için i...

antikor etiketleme drosophila politen kromozom kabak hazırlanması

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila uzun, kromatin yapısı ve üçüncü instar larvaların dev tükürük bezi politen kromozom tarafından sağlanan sitolojik avantajları nedeniyle gen regülasyonu arasındaki ilişkiyi çalışmak için favori bir model sistem olmuştur. Bu doku kromozomların yaklaşık 1000 kopya yol açan hücre bölünmesi yokluğunda çoğaltma çok sayıda mermi uğrarlar. DNA spesifik protein lokalizasyonu ile kromatin morfolojisi ilişkilendirmek için eşsiz bir fırsat sunan büyük ölçüde genişlemiş kromozom sonuçlanan her replikatif döngüsü sonra dizilen kalır. Sonuç olarak, farklı genlerin epigenetik değişiklikleri tanımlamada ve transkripsiyon sürecinin farklı aşamalarında yüksek düzeyde ilgi olmamıştır. Bu tür çalışmalar için önemli bir araç politen kromozom enzim antikorları ile etiketleme, transkripsiyon faktörü, ya da ilgi histon modifikasyonu. Bu video protokolü antikor etiketlenmesi için Drosophila politen kromozom hazırlamak için Johansen laboratuvarında kullanılan kabak tekniği göstermektedir.

Bu video protokol hazırlamak için Johansen laboratuvarında kullanılan kabak tekniği göstermektedir.<em&gt; Drosophila</em&gt; Antikor etiketleme politen kromozom.

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

Drosophila, sitolojik... nedeniyle kromatin yapısı ile gen düzenlemesi arasındaki ilişkiyi incelemek için uzun süredir gözde bir model sistem olmuştur.

Bu prosedür, bir sinek şişesinde yağlı sürünen drosophila üçüncü evre larvalarının kültüre edilmesiyle başlar. İki çift pens kullanılarak, tükürük bezleri larvalardan diseke edilir. Ardından tükürük bezleri, iki kuyucuklu çökme lamı içerisinde iki farklı tespit edici çözelti ile başarıyla fikse edilir.Son olarak, bezler bir lamine cam ve mikroskop lamı arasında lakto asetik asit çözeltisi içinde ezilir. Merhaba, ben Iowa State Üniversitesi Biyokimya, Biyofizik ve Moleküler Biyoloji Bölümü'nden Dr. Kristen Johansen. Merhaba, ben Johansen laboratuvarında yüksek lisans yapan araştırma görevlisiyim.Bugün size, antikor etiketlemesine uygun drosophila politen kromozom ezme preparatlarının hazırlanması prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, epigenetik histo modifikasyonlarını ve bunların kromatin yapısı ve gen ekspresyonu ile olan ilişkisini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Yüksek kaliteli ezme preparatları için optimal politan kromozomlar elde etmek amacıyla, seyrek kültürleme koşulları esastır. Standart dört inçlik bir sinek şişesine yaklaşık 20 yumurta bırakan dişi sinek yerleştirin ve şişeyi her gün yenisiyle değiştirin. Çoğu amaç için 21 °C'de kültür

preparation-drosophila-polytene-chromosome-squashes-for-antibody

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Kromozom boyama, hücre çekirdeğinin organizasyonunu ve karyotipin evrimini incelemek için yararlı bir yöntemdir. Burada, daha sonra iki ve üç boyutlu floresan in situ hibridizasyon (FISH) için kullanılan tek politen kromozomlarından belirli ilgi alanlarını izole etmek ve güçlendirmek için bir yaklaşım sergiliyoruz.

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Burada, slayta monte kromozomlar üzerinde tekrarlayan heterokromatik dizileri görselleştirmek için floresan DNA in situ hibridizasyon (DNA ISH) gerçekleştirmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Yöntem minimal reaktifler gerektirir ve kısa veya uzun problarla, farklı dokularla kullanım ve floresan veya floresan bazlı olmayan sinyallerle algılama için çok yönlüdür.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

Bu protokol, kinesin-5'in küçük moleküllü inhibitörlerine duyarlı bir Drosophila S2 hücre hattının nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu hücrelerin hücre tabanlı bir hata düzeltme testinde kullanımı da ana hatlarıyla belirtilmiştir.

Bir &quot;humanize&quot; oluşturuluyor<em&gt; Drosophila</emKinesin-5 Farmakolojik inhibisyonu için&gt; S2 Hücre Hattı Duyarlı

Olgun Drosophila oositlerinin toplanması, hazırlanması ve görüntülenmesi için protokoller sunuyoruz. Bu yöntemler, mayoz bölünme sırasında kromozom davranışının ve iğ montajının ve işlevinin görselleştirilmesine izin verir.

Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Oositler

Nükleer yüzey spreadleri, kekozis sırasında kromozom olaylarını incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Burada zebrabalığı spermatositlerinden profaz I sırasında meyotik kromozomları hazırlamak ve görselleştirmek için bir yöntem göstermek.

Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması

Bu protokol, Drosophila politen hücrelerindeki heterokromatin agregalarını görselleştirmeyi amaçlamaktadır.

Drosophila Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Bu çalışma, dekapitasyon, fiksasyon, kriyoseksiyon, floresan boyama, immün boyama ve görüntülemeyi içeren, konfokal ve multifoton görüntülemeye genişletilebilen basitleştirilmiş bir doku işleme protokolü sunmaktadır. Yöntem, gelişmiş motor becerilere olan ihtiyacı atlayarak karmaşık diseksiyonlarla karşılaştırılabilir etkinliği korur. Kantitatif görüntü analizi, kapsamlı bir araştırma potansiyeli sağlar.

Gelişmiş beyin floresan boyaması ve immün boyama için Drosophila kafalarının doğrudan kriyoseksiyonu

Bu çalışmada, D. melanogaster yumurtalıkta TurboID tabanlı yakınlık etiketlemesi (PL) için, biyotin takviyesi ve yumurtalık diseksiyonundan transgen ekspresyonunun doğrulanmasına ve kütle spektrometresi için biyotinile peptitlerin zenginleştirilmesine kadar olan adımları kapsayan ayrıntılı bir protokol oluşturuyoruz.

In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketleme Uygulaması

Bu makale, reaktiflerle ekonomik olan ve az sayıda hayali disklerin işlenmesini kolaylaştıran verimli bir imaginal disk diseksiyon ve antikor boyama protokolünü tanımlar.

Drosophila melanogaster'den Göz-Antenli ve Kanat Hayali Disklerinin Küçük Ölçekli Diseksiyonu ve Antikor Boyama

Öğrenin, Drosophila melanogaster politen kromozomlarını antikor etiketleme için hazırlama yöntemini. Tükürük bezlerinin diseksiyonu ve squash tekniği ile gen ifadesi çalışmalarında kullanılan bu protokol, genetik araştırmalarda yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

Daha fazla video keşfet