Christopher Hughes: Bir Anjiyogenez Çalışma in vitro model (Röportaj)

Merhaba, ben Dr. Christopher Hughes. University of California Irvine'de profesörüm ve laboratuvarım anjiyogenez üzerine çalışıyor. Özellikle anjiyogenez sürecini düzenleyen genlerle ilgileniyoruz.

Nelson ve arkadaşlarının çalışmasına dayanarak in vitro bir deneyi optimize ettik ve bu deney sayesinde anjiyogenez sırasında meydana gelen tüm farklı süreçleri inceleyebiliyoruz; tedex boncuklarını, yani küçük boncukları endotel hücreleri ile kaplıyoruz. Ardından bunları fibrin jellerine gömüyoruz. Büyüme faktörleri sağlıyoruz.

Ve birkaç gün boyunca, endotel hücreler boncuklardan filizlenir. Göç ederler, hizalanırlar, prolifere olurlar, tüpler oluştururlar, dallanırlar ve anastomoz oluştururlar. Böylece yaklaşık 10 gün sonra kültürde tam bir kapiler benzeri ağ yapısına sahip oluruz.

Örneğin, farelerde gerçekleştirilen in vivo ve anjiyogenez analizleriyle ilgili bazı sorunlar, sistemin manipüle edilmesinin pek kolay olmamasıdır. Bu süreçler bir hayvanın içinde gerçekleştiğinde bunu görselleştirmek zordur; anjiyogenezin meydana gelişini gerçekten göremezsiniz. Ancak in vitro kültürlerimizde sistemi manipüle etmek isterseniz, endotel hücrelerini genetik olarak modifiye etmek, genleri açıp kapatmak ve bunun tomurcuklanan anjiyogenez üzerindeki etkilerini incelemek oldukça kolaydır.

Ve bunu bütün bir canlı organizmada yapmak çok daha zordur. Knockout veya knockin modeller oluşturmanız gerekir. Dolayısıyla, bunlar iki temel avantajdır.

Manipüle etmesi ve görselleştirmesi kolaydır. Bu nedenle yıllar içinde, her birinin kendine özgü avantajları ve dezavantajları olan bir dizi farklı in vitro anjiyogenez deneyi geliştirilmiştir. Bunlar arasında özellikle bilinenlerden biri, endotel hücrelerinin matrigel adı verilen bu hücre dışı matrisin üzerine yerleştirildiği matris jel deneyidir.

Buradaki sorun, endotel hücrelerinin kordon benzeri yapılar oluşturması ancak hiçbir zaman gerçek anlamda lümenize damarlar oluşturmamasıdır. Filizlenme veya anastomoz görülmez. Bu noktada, faydalı olabilen kolajen jel modelleri bulunmaktadır.

Bunlardan birçok örneği vardır; endotel hücrelerinin proliferasyonunu görmezsiniz. Anastomoz görme eğiliminde olmazsınız. Geliştirdiğimz fibrin jel analizi, doksanlı yılların ortalarında Nelson Kar tarafından yayınlanan bir modele dayanmaktadır.

Ve artık bunu, anjiyogenezin tüm aşamalarını görebileceğimiz şekilde önemli ölçüde geliştirdik. İlk filizlenmeyi ve migrasyonu izleyebiliyoruz. Hücre proliferasyonunu ve lümen oluşumunu görüyoruz, dallanma gerçekleşiyor ve nihayetinde in vitro ortamda eksiksiz bir vasküler ağ oluşturmak için anastomoz elde ediyoruz.

Bu nedenle, anjiyogenezin tüm bu farklı aşamalarını incelemek istiyorsanız, bu assay'in mevcut en iyi in vitro sistem olduğuna inanıyoruz. Bu in vitro assay ile sahip olduğumuz bir diğer avantaj ise lazer yakalama mikrodissection yapabilmemizdir; kültürü oldukça düz hale getirene kadar santrifüjleyebilir ve ardından lazer yakalama mikrodissection mikroskobunu kullanabiliriz. Gerçekten de tekil hücreleri çıkarabiliriz ve özellikle uç hücrelerle (tip cells) ilgileniyoruz.

Böylece bunları kesip çıkarıyoruz ve özellikle uç hücreleri ile lümeni oluşturan gövde hücreleri arasındaki gen ekspresyonuna bakabiliyoruz. Hipotezimiz, bu iki hücre popülasyonu arasında farklı gen ekspresyonlarının olacağı yönündedir. Bunu inceleyebiliriz; bunu in vivo bir sistemde yapmak neredeyse imkansız olurdu.

Böylece, bu in vitro assay'in kullanılmasının bir başka temel avantajı olduğunu düşünüyoruz. Nelson ve arkadaşları tarafından yapıldığı belirttiğim erken dönem çalışmalarda, mikro vasküler endotelyal hücreler kullanılmıştır. In vivo ortamda yeni damarları asıl oluşturan mikro vasküler EC'ler olduğu için, bu tür bir assay için kullanılması istenen hücrelerin mikro vasküler endotelyal hücreler olduğu yönünde yaygın bir görüş vardır.

Bunu ve ile yapmayı denemeye karar verdik. Bunlar, birkaç nedenden dolayı insan göbek kordonu ven endotel hücreleridir. Bunlardan biri, bu hücrelerin elde edilmesinin çok kolay olmasıdır.

Hastaneye giderek doğumhanelerden göbek bağları temin edebilir ve hücreleri çok kolay bir şekilde izole edebilirsiniz. Ayrıca bu hücreler uzun yıllardır kültürde kullanılmaktadır ve özellikleri çok iyi tanımlanmıştır.

Böylece, bu hücreleri söz konusu nedenlerle kullanabilmek için bu testi kurduk ve optimize ettik. İlginç olan şu ki, büyük damar endotel hücrelerinin kültürde mikrovasküler endotel hücrelerinin formunu aldığı görülmektedir. Normalde büyük damar endotel hücreleri tarafından eksprese edilen birçok geni kaybeder ve normalde mikrovasküler endotel hücreleri ile ilişkili olan genleri eksprese etmeye başlarlar.

Ve bunlar, kültürde gerçek kılcal damarlara benzeyen lümenler oluşturarak kılcal damar benzeri filizlenmeler oluşturma konusunda tamamen yeteneklidirler. Bu nedenle kullanımları kolaydır ve bizden beklenen işlemi gerçekleştirirler. Filizlenirler ve uygun lümenli damarlar oluştururlar.

Bu analizi nicelleştirmek istediğimizde, izleyebileceğimiz birkaç farklı yol vardır. Filiz sayısı, filiz uzunluğu, filiz çapı, dallanma noktalarının sayısı veya anastomoz sayısı gibi gerçekten kantitatif kriterlere bakabiliriz; ancak aynı zamanda kalitatif kriterleri de değerlendiririz. Örneğin, lümen oluşturup oluşturmadıklarına bakabiliriz.

Ve muhtemelen en çok ilgilendiğimiz konu da budur. Yaptığımız birçok analizde, düzgün lümen oluşumuna bakıyoruz. Bu aslında daha çok kalitatif bir değerlendirmedir, ancak damarlar büyüdükçe bu lümenlerin çapı da ölçülebilir.

Bu kültürlerde fibroblastlar kullanıyoruz. Boncukları fibrin jelinin içine gömüyoruz ve fibroblastları jelin üzerine ekiyoruz. Fibroblastlar, uygun filizlenme ve lümen oluşumu için kesinlikle gereklidir.

Fibroblastların yokluğunda bir miktar tomurcuklanma gerçekleşir. Ancak, endotel hücreler birbirine tutunma eğilimi göstermezler. Yaşanan durum, bu hücrelerin birbirinden uzaklaşarak göç etmesidir.

Bu nedenle, bu filiz üzerinde geliştirdiğiniz herhangi bir yapı parçalanma eğilimi gösterir. Birkaç gün sonra, endotel hücreler apoptoza uğrar. Dolayısıyla, en azından bu in vitro sistemde, fibroblastların anjiyogenez için temel olan faktörleri ürettiği görülmektedir.

Bu faktörlerin neler olduğunu öğrenmekle oldukça ilgilendik. Tespit ettiğimiz şey, fibroblastların ortama bir şey salgıladığıdır; bu nedenle fibroblastlardan kondisyonlu ortam alabiliyoruz ve bu, uygun tomurcuklanmayı ve lümen oluşumunu destekliyor. Dolayısıyla kesinlikle çözünür bir faktörle karşı karşıyayız.

Bu nedenle, fibroblastların bu sistemde anjiyogenez için bu kadar önemli olan ne ürettiğini öğrenmeyi çok istiyoruz. VEGF, temel FGF gibi tüm olağan şüphelileri denedik; bunlar kültürde mevcut, ancak daha fazlasını eklemek fibroblastların yerini tutmuyor. Ayrıca angiopoietin 1, TGF beta, HGF ve benzerlerini de denedik.

Şu ana kadar hayati faktörü bulamadık. Bu nedenle şu an yaptığımız işlem, fibroblastlardan elde edilen kondisyon ortamındaki faktörleri saflaştırmaktır. Kondisyon ortamını katyon değişimi ve boyut dışlama gibi çeşitli kolonlardan geçirerek, aktivite gösteren fraksiyonlar elde ediyoruz.

Şimdi bu aktiviteyi takip ediyoruz ve bu fraksiyonları alarak hangilerinin aktif olduğunu belirliyoruz; ardından bunları jellerde çalıştırıp jel üzerinde nispeten az sayıda bant olduğundan emin olabiliyoruz, daha sonra ise bunları kesip kütle spektrometrisi ile dizileme işlemini yaptırabiliyoruz. Bu süreç bize oldukça ilginiz veriler sağlıyor. Şu an, gerçekten aradığımız faktör olup olmadıklarını görmek için tek tek test ettiğimiz birçok aday genimiz var.

Böylece çok sayıda bilinen anjiyojenik faktörü test ettik ve veg GF ile temel FGF'nin bu analizde uygun filizlenme için aslında temel olduğunu biliyoruz. Ancak hikayenin tamamı bu değil. Bahsettiğim gibi, önemli olan türetilmiş faktörler de bulunmaktadır ve biz bunu, in vivo ortamda yüksek anjiyojenik kapasiteye sahip olan, farelerde büyük tümörler oluşturan ve yüksek düzeyde vaskülarize olan tümör hücrelerini kullanarak inceledik.

Bu tümör hücrelerini inceledik ve çok yüksek seviyelerde vegf eksprese ettiklerini gördük; bunları kültürlerimize ekledik. Böylece fibroblastların yerine bu tümör hücrelerini koyduk ve bu hücrelerin bu deneyde güçlü bir anjiyogenezi desteklemediklerini gördük. Ve bu oldukça ilgi çekici.

Bu durumun gösterdiği ve başka araştırmacılar tarafından da öne sürülen nokta, tümör, dokudaki fibroblastlar ve diğer destek hücrelerinden oluşan stroma ile endotel hücreler arasında bir çapraz etkileşim olduğudur. Tümör hücrelerinin doğrudan endotel hücreler üzerinde etkili olan bazı faktörler üretiyor olması muhtemeldir; ancak aynı zamanda, fibroblastları ve diğer stromal hücreleri, güçlü anjiyogenezi destekleyecek faktörler üretmeleri için stimüle eden diğer faktörler de üretmektedirler.