Christopher Hughes: Bir Anjiyogenez Çalışma in vitro model (Röportaj)

Merhaba, benim adım Dr.Christopher Hughes. California Irvine Üniversitesi'nde profesörüm ve laboratuvarım anjiyogenez üzerinde çalışıyor. Ve özellikle anjiogenez sürecini düzenleyen genlerle ilgileniyoruz.

Nelson'un çalışmalarına dayanarak bir in vitro tahlilleri optimize ettik ve bu tahlilde anjiyogenez sırasında devam eden tüm farklı süreçlere bakabiliyoruz, tedex boncukları, küçük boncukları endotel hücreleri ile kaplıyoruz. Sonra bunları fibrin jellerine gömüyoruz. Büyüme faktörleri sağlıyoruz.

Ve birkaç gün boyunca, endotel hücreleri boncuklardan filizlenir. Göç ederler, hizalanırlar, çoğalırlar, tüpler yaparlar, dallanırlar ve anastomoz oluştururlar. Böylece yaklaşık 10 gün içinde kültürde Ağ gibi tam bir kılcal damarımız olur.

Envivo ve anjiyogenez Testleri ile ilgili bazı problemler, örneğin, farelerde yapılanlar, sistemi manipüle etmenin çok kolay olmamasıdır. Bir hayvanın içinde böyle bir şey olduğunu hayal etmek zor, siz, anjiogenezin gerçekleştiğini gerçekten göremezsiniz. Ve eğer in vitro kültürlerimizde sistemi manipüle etmek isterseniz, endotel hücrelerini genetik olarak manipüle etmek, genleri açıp kapatmak ve bunun filizlenme anjiogenezi üzerindeki etkilerine bakmak çok kolaydır.

Ve bunu tüm hayvanda yapmak çok daha zordur. Nakavtlar veya nakavtlar yapmak zorundasın. İşte bunlar iki büyük avantaj.

Bu, manipüle etmek kolaydır ve görselleştirmek kolaydır. Bu nedenle, yıllar boyunca, bir dizi farklı in vitro agenezi testi geliştirilmiştir ve bunların hepsinin avantajları ve dezavantajları vardır. Ve özellikle, iyi bilineni, endotel hücrelerinin matrigel adı verilen bu hücre dışı matrisin üzerine yerleştirildiği matris jel testidir.

Ve buradaki sorun şu ki, endotel hücreleri kordon benzeri yapılar oluştururlar, ama asla düzgün alüminize damarlar yapmazlar. Filizlenmeyi görmüyorsunuz, anastomozu görmüyorsunuz. İyi olabilecek kolajen jel modelleri var.

Bunlardan çok var Endotel hücrelerinin çoğalmasını görmüyorsunuz. Anastomoz görme eğiliminde değilsiniz. Geliştirdiğimiz fibrin jel testi, Nelson Kar'ın doksanlı yılların ortalarında yayınlanan bir modeline dayanmaktadır.

Ve şimdi bunu öyle bir geliştirdik ki, anjiogenezin tüm aşamalarını görebiliyoruz. İlk filizlenmeyi, göçü izleyebiliriz. Hücrelerin çoğaldığını görüyoruz, lümen oluşumunu görüyoruz, dallanıyoruz ve sonunda in vitro olarak tam bir vasküler ağ oluşturmak için anastomoz alıyoruz.

Yani bu tahlil gerçekten, inanıyoruz ki, anjiyogenezin tüm bu farklı aşamalarına bakmak isterseniz, etrafındaki en iyi in vitro sistemdir. Bu in vitro tahlil ile sahip olduğumuz bir diğer avantaj, lazer yakalama, mikro diseksiyon yapabilmemiz, kültürü çok düz hale getirecek şekilde döndürebilmemiz ve daha sonra lazer yakalama mikro diseksiyon mikroskobunu kullanabilmemizdir. Aslında tek tek hücreleri çıkarabiliyoruz ve özellikle uç hücrelerle ilgileniyoruz.

Ve böylece bunları kesiyoruz ve gen ifadesine bakabiliyoruz, özellikle uç hücrelerde ve gövde hücrelerinde, aslında lümeni yapan hücrelerde. Ve bizim hipotezimiz, bu iki hücre popülasyonu arasında diferansiyel gen ifadesi olacağıdır. Buna bakabiliriz, bunu in vivo bir sistemde yapmak neredeyse imkansız olurdu.

Bu nedenle, bu in vitro Testi kullanmanın bir başka önemli avantajı olduğunu düşünüyoruz. Bu konuda yapılan ilk çalışmalar, Nelson Recon'un da belirttiği gibi, mikrovasküler endotel hücreleri kullandılar. Ve mikrovasküler endotel hücrelerinin, böyle bir tahlil için kullanmak isteyeceğiniz hücreler olduğuna dair çok fazla düşünce var çünkü in vivo, gerçekten yeni damarları oluşturan mikrovasküler EC'dir.

Bunu ve ile denemeye ve yapmaya karar verdik. Bunlar, birkaç nedenden dolayı insan göbek damarı endotel hücreleridir. Bunlardan biri de bu hücrelerin elde edilmesinin çok kolay olmasıdır.

Hastaneye gidebilir, doğum odalarından göbek kordonu alabilir ve hücreleri çok kolay bir şekilde izole edebilirsiniz. Ayrıca bu hücreler kültürde uzun yıllardır kullanılmaktadır. Çok iyi karakterize edilmişler.

Ve böylece bu testi kurduk ve bu hücreleri bu nedenlerle kullanabilmemiz için optimize ettik. Ve ilginç bir şekilde, bu büyük damar endotel hücrelerinin mikrovasküler endotel hücreleri ve kültür şeklini aldığı ortaya çıktı. Normalde büyük damar EC tarafından eksprese edilen birçok geni kaybederler ve normalde mikrovasküler endotel hücreleri ile ilişkili genleri eksprese etmeye başlarlar.

Ve mükemmel bir şekilde kılcal damarlar oluşturabilirler, filizler gibi, lümen yapabilirler ve tüm dünyanın kültürde gerçek kılcal damarlar gibi görünmesini sağlarlar. Yani kullanımları kolay, ve kullanımı kolaylar ve bizim yapmalarını istediğimiz şeyi yapıyorlar. Filizlenirler ve uygun alüminize kaplar yaparlar.

Bu testi ölçmek istediğimizde, gerçekten gidebileceğimiz birkaç yol var. Filiz sayısı, filiz uzunluğu, filiz çapı, dal noktası sayısı, anastomoz sayısı gibi gerçekten nicel kriterlere bakabiliriz ama aynı zamanda nitel kriterlere de bakıyoruz. Ve böylece lümen oluşturup oluşturmadıklarına bakabiliriz.

Ve muhtemelen en çok ilgilendiğimiz şey bu. Yaptığımız tahlillerin çoğunda uygun lümen oluşumu var. Ve bu gerçekten daha çok, niteliksel bir değerlendirmedir, ancak damarlar büyüdükçe, bu lümenlerin çapı da ölçülebilir.

Bu yüzden bu kültürlerde fibroblastlar kullanıyoruz. Boncukları fibrin jelin içine gömüyoruz ve jelin üzerine fibroblastları kaplıyoruz. Fibroblastlar, uygun filizlenme ve lümen oluşumu için kesinlikle gereklidir.

Fibroblastların yokluğunda, bir miktar filizlenme elde ederiz. Bununla birlikte, endotel hücreleri birbirine bağlı kalma eğiliminde değildir. Olan şu ki, birbirlerinden uzaklaşıyorlar.

Ve bu filiz üzerinde geliştirdiğiniz herhangi bir yapı dağılma eğilimindedir. Ve birkaç gün sonra, endotel hücreleri apoptoza uğrar. Görünüşe göre fibroblastlar, en azından bu in vitro sistemde, anjiyogenez için gerekli olan bir faktör oluşturuyor.

Ve bu faktörlerin ne olduğunu bilmekle çok ilgilendik. Bulduğumuz şey, fibroblastların ortama bir şey salgıladığıdır, böylece fibroblastlardan koşul ortamı alabiliriz ve bu da uygun filizlenme ve lümen oluşumunu destekleyecektir. Yani kesinlikle çözülebilir bir faktörle uğraşıyoruz.

Açıkçası, fibroblastların bu sistemdeki anjiogenez için çok önemli olan şeyin ne yaptığını bilmekle çok ilgileniyoruz. Tüm olağan şüphelileri denedik, VEGF, temel fg F var, kültürde var, daha fazlasını eklemek fibroblastların yerini tutmaz. Ayrıca anjiyopoietin bir, TGF beta, H, GF, vb.

Şimdiye kadar hayati faktörü bulamadık. Şu anda yaptığımız şey, fibroblastlardan durum ortamındaki faktörleri arındırmak. Bu yüzden koşul ortamını çeşitli sütunların, katyonun, değişimin, boyut dışlamanın üzerine koyuyoruz ve bunun aktivitesi olan kesirlerini elde ediyoruz.

Ve şimdi bu aktiviteyi takip ediyoruz ve bu fraksiyonları alıyoruz, hangilerinin aktif olduğunu buluyoruz ve oradan bunları jeller üzerinde çalıştırabiliriz, jel üzerinde sadece bir, nispeten az sayıda bant olduğundan emin olabiliriz ve sonra bunları kesebilir ve kütle özelliklerine göre sıralayabiliriz. Ve bu bize çok ilginç günler yaşatıyor. Şu anda epeyce aday genimiz var ve aradığımız faktörün gerçekten olup olmadığını görmek için tek tek test ediyoruz.

Bu nedenle, bilinen birçok anjiyojenik faktörü test ettik ve bu tahlilde uygun filizlenme için sebze GF ve bazik FGF'nin aslında gerekli olduğunu biliyoruz. Ama hikayenin tamamı bunlar değil. Daha önce de belirttiğim gibi, önemli olan türetilmiş faktörler var ve buna bakmanın bir yolu, in vivo olarak oldukça anjiyojenik olan tümör hücrelerini aldık, farelerde büyük tümörler oluşturuyorlar ve oldukça vaskülarize oluyorlar.

Ve bu tümör hücrelerine baktık ve çok yüksek seviyelerde vegf ifade ediyorlar ve bunları kültürlerimize koyduk. Bu yüzden fibroblastları bu tümör hücreleriyle değiştirdik ve bu testte sağlam anjiyogenezi desteklemiyorlar. Ve bu, bu çok ilginç.

Bunun önerdiği şey, ve bu diğer insanlar tarafından da önerildi, tümör, S stroma, dokudaki fibroblastlar ve diğer destek hücreleri ile endotel hücreleri arasında bir karışma olduğudur. Ve tümör hücrelerinin doğrudan endotel hücreleri üzerinde çalışan bazı faktörler üretmesi iyi olabilir, ancak aynı zamanda fibroblastları ve diğer stromal hücreleri uyaran ve daha sonra sağlam Anjiyogenezi destekleyen faktörler üreten başkalarını da üretirler.