RNA İzolasyonu Loblolly Çam Daha İyi Bir Yöntem ( S. taeda L.) ve Diğer Conifer Türler

Aşağıdaki içerik, Georgia Üniversitesi ve Warnell Ormancılık ve Doğal Kaynaklar Okulu'ndaki araştırmacılar tarafından hazırlanmıştır. Bu demonstrasyon videosu, Amerika Birleşik Devletleri'nde orman ürünleri üretimi için en önemli konifer türü olan ve yaygın olarak loblolly çamı olarak bilinen Pinus Teta'dan ksilem ve floem dokusunun hasat edilmesini ve ardından RNA izolasyonunu açıklamaktadır. Ağaç devrildikten sonra (bu vakada 40 yaşında bir ağaç), ana gövde yaklaşık 50 santimetre uzunluğunda parçalara bölünür.

Ardından, kabuğun sökülmesini kolaylaştırmak için motorlu testere ile cıvata boyunca birkaç yerde boylamsal çizikler oluşturulur. Çekiç ve ağaç iskarpelası kullanılarak, kabuk bölümler halinde soyulabilecek hale gelene kadar kaldırılır. Sonrasında, akım dokusu el yardımıyla çıkarılıp kabuk bölümlerinin iç kısmından soyulur ve derhal sıvı azota daldırılır.

Kabuk soyulduktan sonra, tek taraflı bir jiletle bolt yüzeyi kazınarak ince sekonder ksilem tabakası toplanabilir. Sulu ksilem dokusu derhal sıvı azota yerleştirilir. Bu hasatta, ana gövdeden dallar kesilmeden önce genellikle basınç ve karşıt odun olarak adlandırılan reaksiyon odunu örnekleri de toplanmıştır.

İki doku tipini içeren alanların (dalın üst kısmındaki karşıt odun ve alt kısmındaki sıkışma odunu) belirlenebilmesi için öncelikle dal yönü sprey boya ile işaretlenir. Kabuk soyma işlemi sırasında, dallar önce sıkışma ve karşıt odun bölgelerini belirleyen çizgiler boyunca motorlu testere ile çizilir ve kabuk soyma işlemi, ana gövde boltlarında olduğu gibi gerçekleştirilir; ancak yalnızca ilgili reaksiyon tipine karşılık gelen bölgedeki kabuklar soyulur.

Hasat edilen odun herhangi bir zamanda çıkarılır. Bu daha küçük dallardan geniş kabuk bölümlerini çıkarmak genellikle daha zordur. Sekonder ksilem reaksiyon odunu örnekleri, normal sekonder ksilemde olduğu gibi, jiletle kazıma ve hemen sıvı azota daldırma yöntemiyle toplanır.

Sıkışma odununa özgü kırmızımsı kahverengi renge dikkat edin. Büyük bir ağaçtan birden fazla örnek toplamanın ve işlemenin, RNA degradasyonunu azaltmaya yardımcı olmak amacıyla tüm doku türlerinin eş zamanlı olarak toplandığı, her bir kişinin belirlenmiş bir görevi yerine getirdiği çok sayıda kişi gerektirdiği belirtilmelidir; dondurulmuş örnekler sıvı azottan çıkarılarak etiketli saklama torbalarına aktarılır ve laboratuvara geri taşınmak üzere kuru buz üzerine yerleştirilir. İlk adımımız, dokuyu specs model 68 50 dondurucu değirmen kullanarak toz haline getirmektir; havan ve havan eli ile öğütmeye kıyasla bu adım, örnekler sıvı azotla soğuk tutularak odunsu doku örnekleri için RNA ekstraksiyon verimini önemli ölçüde artırır.

Doku önce elle daha küçük parçalara ayrılır ve örnek haznesine yerleştirilir. Hazne, yerine kilitlenmiş olan taşıyıcıya yerleştirilir ve örnek iki dakika boyunca öğütülür. Nihai ürün, kaba bir toz kıvamındadır.

RNA ekstraksiyon protokolü iki günlük bir işlemdir. İlk gün, 65 °C'ye ısıtılmış RNA ekstraksiyon tamponuna 2,5 gram dondurulmuş doku eklenir. Örnek, karıştırmak için kuvvetlice çalkalanır; ardından eşit hacimde kloroform eklenir ve örnek nazikçe tersyüz edilerek tekrar karıştırılır.

Numune daha sonra beş dakika boyunca döner bir tekerlek üzerine yerleştirilir. Ardından numune, yüksek hızlı Teflon Oakridge tüplerine aktarılır ve SS 34 rotorunda 12,000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj edilir. Üstteki sulu fraksiyon yeni bir tüpe alınır ve yarım hacim kloroform eklenir.

Numune bir dakika boyunca vorteksle karıştırılır ve tekrar beş dakika boyunca döner tekerlek üzerine yerleştirilir. İkinci bir santrifüj işleminden sonra, sulu fraksiyon tekrar 50 ml'lik yüksek hızlı bir polipropilen tüpe aktarılır ve 10,000 RPM'de 20 dakika boyunca santrifüj edilir. Kalan partikülleri uzaklaştırmak için numune 50 ml'lik bir Falcon tüpüne dekante edilir ve numuneye hacminin dörtte biri kadar 10 molar lityum klorür eklenir.

Numune çalkalanarak karıştırılır ve gece boyunca 4 °C'de bekletilir. İkinci günde, lityum klorür ile çöktürülmüş numune önce 4 °C'de 30 dakika boyunca 11.000 RPM'de santrifüj edilir.

Sıvı dökülerek atılır ve tüpler bir dakika boyunca kimyasal temizleme mendillerinin üzerine ters çevrilir. Fazla sıvıyı uzaklaştırmak için, görünür olması gereken RNA peleti, 65 °C'ye önceden ısıtılmış 800 µL sıcak SSTE tamponu içinde yeniden süspande edilir. Peletin tamamının çözeltiye girdiğinden emin olmak için pipetle birkaç kez yukarı aşağı ve pelet kenarlarının tamamında çekme işlemi yapıldığından emin olun.

Ardından, yeniden süspanse edilen RNA'yı iki mil ve ötesi RNA içermeyen bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Örneği 65 °C'lik bir su banyosunda bir ila iki dakika ısıtın ve ardından örneğin tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olmak için vorteksleyin. Gerektiğinde bu işlem tekrarlanabilir.

Şimdi, eşit hacimde tamponlanmış fenol kloroform ekleyin. Numuneyi 15 ila 20 saniye boyunca vorteksleyin ve 14.000 RPM'de üç dakika boyunca mikro santrifüjden geçirin. Sulu faz yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır ve eşit hacimde eklenir.

Numune, önceki ekstraksiyonda olduğu gibi vorteksle karıştırılır ve mikro santrifüjlenir. Son organik ekstraksiyon aşaması için, jel bariyerli tüpler önce iki dakika boyunca 11.000 RPM'de mikro santrifüjlenir.

Ardından, önceki ekstraksiyondan elde edilen RNA örneği faz kilitleme jeline eklenir, ardından yarım hacim kloroform eklenir ve her ikisi pipetleme yoluyla nazikçe karıştırılır. Daha sonra örnek, 11.000 RPM'de beş dakika boyunca mikro santrifüjlenir ve sulu RNA örneği yeni bir Ambion RNA'dan arındırılmış mikro santrifüj tüpüne aktarılır. Bir sonraki adım, örneğe on kat düşük hacimde 3 molar sodyum asetat pH 4.8 ve iki hacim %100 etanol eklenerek gerçekleştirilen basit bir RNA çöktürme işlemidir.

Numune vortekslenir, kısa bir süre -80 °C dondurucuda 30 dakika bekletilir ve ardından 4 °C'de 30 dakika boyunca mikrosantrifüjlenir. Süpernatan dikkatlice aspire edilir ve küçük beyaz pelet, 1 mL buz gibi soğuk %70 etanol ile yıkanıp aspire edilir; son aspirasyondan sonra etanol yıkama işlemi tekrarlanır. Tüpler beş dakika boyunca tezgah üzerinde açık bırakılarak kalıntı etanolün buharlaşması sağlanır.

RNA peletleri 100 µL DEPC'li su içinde süspanse edilir ve vorteksleme ile 65 °C'de ısıtılarak yeniden çözündürülür. Gerektiğinde bu işlem tekrarlanabilir. Örnek konsantrasyonu belirlenir.

Örnekteki protein ve karbonhidrat kontaminasyonunun düzeyini tahmin etmek için spektrofotometrik olarak 260/280 ve 260/230 oranları hesaplanır. Örnek kalitesini, genomik DNA kontaminasyonunu ve RNA degradasyonunu kalitatif olarak tahmin etmek için %1'lik AGROZ jel elektroforezi kullanılır. Kritik örneklerin örnek bütünlüğü, ribozomal 28S/18S oranlarını ve bir RNA bütünlük numarasını (RIN) belirlemek amacıyla Agilent 2100 biyoanalizör kullanılarak daha ayrıntılı şekilde değerlendirilir. LOB lolly pine'dan doku örneklerinin toplanması ve toplam RNA izolasyonu hakkındaki videomuzu izlediğiniz için teşekkür ederiz.

Aşağıdaki kişiler, bu eğitim videosunun çekiminden ve prodüksiyonundan sorumludur.