Name: RNA İzolasyonu Loblolly Çam Daha İyi Bir Yöntem ( S. taeda L.) ve Diğer Conifer Türler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Öğrenin Pinus taeda ve diğer iğne yapraklılardan yüksek kaliteli RNA izolasyonu için etkili hasat tekniklerini. Bu yöntem, fenolikler ve polisakkaritlerle mücadele ederek genomik araştırmalar için güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Joe Naim, Matt Bryman Michael Bordo Ujwal Bagal, Huizhe Jin, ve Amanda Bouffier: Biz, yardım toplama çam dokuların mümkün olmazdı olmadan aşağıdaki kişilere teşekkür etmek istiyorum.

Bölüm 1: Ağaç Hasat Ağaç ve yıkılan sonra, dikkatli ve mümkün olduğunca hızlı çalışması için önemlidir. Her biri farklı bir doku tipi hasat edilir örnek malzemenin herhangi bir çapraz kontaminasyonu engellemek için, onlar hemen kendi sıvı azot kaplar içine yerleştirilmiş olmalıdır. Bu RNA izolasyonu protokol ölçeklenebilir. <ol><li> Yaklaşık 0.5-0.75 m uzunluğa ve testereli bir skor ile iki veya üç yerlerde kabuğu cıvata uzunlamasına eksen cıvata Kes. </li><li> Kabuğu, kök tamamen ayrılıncaya kadar ahşap ayrı ve kabuğu bölümü geri çekerken keski çalışmaya devam başlayana kadar bir ahşap keski kullanarak, gol bölgenin kenarında çalışır. </li><li> İkincil ksilem kabuğu soyulmuş cıvata uzunlamasına ekseni boyunca kazıma straight edge, tek taraflı jilet ile hasat edilir. Doku kontaminasyonu en aza indirmek için lateks eldiven giyin. </li><li> Phleom kabuğu bölümlerin iç tarafında bulunan, kolayca soyma elle hasat edilir. </li><li> Reaksiyon ahşap zemin saygı ile kendi orijinal yönünü göstermek için sprey boya ile işaretleme sonra alt uzuvlarda toplanıyor. </li><li> Uzuvlar cıvata içine 1-2 metre kesilmiş ve boylamasına ekseni boyunca yaklaşık iki tür reaksiyon ahşap yerlere göre ters taraftan gol: ters ahşap (bacak üst tarafındaki) ve sıkıştırma ahşap (alt ekstremite tarafı). Kabuğu, sadece her tür reaksiyon ahşap kaplama kabuğu bir anda kaldırılmış olması dışında, yukarıda açıklandığı gibi uzuv ayrılır. İkincil ksilem ve floem, yukarıda açıklanan ve sıvı azot yerleştirilmiş olarak tahsil edilir. </li><li> Iğneler, sürgün ipuçları ve genç koniler gibi diğer örnekleri, elle hasat ya da gerektiği gibi budama makasları kullanarak olabilir. </li><li> Toplanan numuneler, sıvı nitrojen içinde dondurulmuş işaretli torbaları veya uygun kaplara yerleştirilir ve laboratuvara gönderilmek Geri dönmek için kuru buz içinde paketlenmiş olmalıdır. </li></ol> Bölüm 2: Numune Dondurucu Mill İşleme <ol><li> Spex 6850 dondurucu değirmen rezervuar sıvı nitrojen ile doldurun ve taşlama şişeleri birine etkisi çubuğunu yerleştirin ve önceden soğuk sıvı azot ile doldurun. Sıvı nitrojen dökün ve flakon örnek eklemek. </li><li> Aşırı sıvı nitrojen Tambur kalır ve sonunda kapağı Odanın mühür oturan önce bu aşırı azot gazı tamamen Bacalı emin olun. </li><li> Taşlama flakon taşıyıcı ve yakın içine yerleştirin. </li><li> 14 bir oran ayarda iki kür için 1 dakika / devir Mill odunsu örnekleri. </li><li> Önceden soğutulmuş ve küçük bir miktar sıvı azot içeren bir behere öğütülmüş numune (odun unu) kaldırmak için bir sıvı azot soğutulmuş spatula kullanın. </li><li> Gerekli -80 ° C kadar bir saklama kabı ve yerine sıvı azot / numune şerbeti dökün. </li></ol> Bölüm 3: RNA izolasyonu, 1. Gün <ol><li> RNA İzolasyon Tampon 20ml 50ml kapaklı Falcon tüp içine yerleştirin ve sonra 400 mcL β-mercaptoethanol, girdap, kısaca ısı 60 ° C su banyosunda ekleyin. </li><li> Her tüpe 4 gr dondurulmuş doku. Cap ve 10 saniye boyunca vorteks tarafından takip elle kuvvetlice çalkalanır. </li><li> Tüpüne eşit miktarda kloroform ekleyin ve karıştırın hafifçe ters. Dönen bir tekerlek üzerinde tüp yerleştirin ve 5 dakika boyunca karıştırma sonu aşırı uç izin. </li><li> 12.000 (17.200 xg'de), 5 dakika boyunca SS34 sabit açılı rotor devir az 50 ml Oak Ridge tüp ve santrifüj karışımı süzün. </li><li> Taze Oak Ridge tüp sulu faz transfer ve kloroform yarım hacmi ekleyin. </li><li> 1 dakika ve 5 dakika boyunca dönen bir tekerlek karıştırmaya devam Vortex. 12.000 rpm (17.200 xg), 5 dakika boyunca SS34 sabit açılı rotor santrifüjleyin. </li><li> Sulu faz taze Oak Ridge tüpüne aktarın ve kloroform yarım hacmi ekleyin. 1 dakika karıştırın. SS34 10 dakika boyunca sabit açılı rotor 12.000 rpm (17.200 xg) santrifüjleyin. </li><li> Sulu faz 50 ml yüksek hızda polipropilen tüpe aktarın. SS34 20 dakika boyunca sabit açılı rotor 10.000 rpm (11,900 xg) santrifüjleyin. </li><li> Durusu 50 ml Falcon tüp içine süpernatant ve süpernatant çeyrek hacmi 10 M LiCl çözüm ekleyin. 4 Kısaca vorteks ve yeri ° C, gece yağış için. </li></ol> Bölüm 4: RNA izolasyonu, 2. Gün <ol><li> Isı SSTE başlamadan önce 65 ° C su banyosunda tampon. </li><li> 4 SS34 sabit açılı rotor 11.000 rpm (14.450 xg) 30 dakika süreyle santrifüj bir polipropilen boru ve pelet RNA LiCl çöktürülmüş örnek dökün ° C. </li><li> Santrifüj sonra,dökün ve sıvı atmak ve yaklaşık 1 dakika boyunca Kimwipes tüpler ters. Herhangi bir kalan süpernatant Pipet. </li><li> Isıtmalı SSTE örnekleri iyice karıştırmak için bir pipet kullanarak 800 mcL her pelletini tekrar. 2 mL Ambion RNAse ücretsiz mikrofuge'de tüpler yeniden süspanse örnek aktarın. </li><li> Isı örnekleri 65 ° C,, tam olarak yeniden süspanse sağlamak için kuvvetli bir vorteks takip 2 dakika boyunca. </li><li> Her numune tüpü, fenol-kloroform, pH8 bir eşit miktarda ekleyin. 14.000 rpm'de 3 dakika 30 saniye sonra Vorteks her bir örnek ve bir mikrofuge'ye Spin </li><li> Yeni bir 2mL Ambion RNAse ücretsiz mikrofuge'de borular, sulu faz transfer ve kloroform eşit miktarda ekleyin. Vorteks her 30 saniye ve 3 dakika 14.000 rpm'de mikrofuge'ye spin örnek. </li><li> Faz-Lock Jeli tüpler daha önce 2 dakika 11.000 rpm'de microfuging tarafından hazırlanan sulu faz aktarın. Kloroform yarım hacmi ekleyin ve hafifçe karıştırın pipetle. </li><li> 5 dakika 11.000 rpm'de santrifüj ve taze 2mL Ambion RNAse ücretsiz mikrofuge'de borular, sulu faz transfer. </li></ol> Bölüm 5: RNA Yağış ve Etanol Yıkama <ol><li> 50 mcL 3.0 M sodyum asetat, pH 4.8 ve sulu faz 1 ml% 100 etanol ekleyin. Girdap ve çökelti -80 ° C de 30 dakika veya gece -20 ° C </li><li> Mikrofuge'de örnekleri 30 dakika boyunca 14.000 4 dak ° C, ve dikkatle süpernatantı aspire. Pelet rahatsız etmeyin. </li><li> 1 ml -20 ° C% 70 (v / v) etanol ile RNA pelet yıkayın. 1 dakika 14.000 rpm'de mikrofuge'de ve etanol aspirat. </li><li> 5.3 adımı tekrarlayın. </li><li> 3-5 dakika bankta tüpler ve hava-kuru granül şapkasını çıkarmak. </li></ol> Bölüm 6: Tekrar Süspansiyonu ve Miktar <ol><li> 100 mcL DEPC arıtılmış su her pelletini tekrar. Vorteks Mix ve tüpler buz üzerine yerleştirmeden önce 2 dakika 65 ° C'de inkübe edin. Örnek tabanda sağlamak için gerekirse tekrarlayın. </li><li> Istenen ve spektrofotometrik kantitatif, 10mM Tris, pH 7.5 1:10 seyreltme 50 mcL örnekleri gibi Havuzu. 260/280 ve 260/230 Absorbans oranları genellikle sırasıyla 2.1 ve 2.2 'den daha fazladır. 60-120μg / g dondurulmuş doku, RNA izolasyonu getirileri aralığı. </li><li> TAE tampon 1.5-2.5 mg RNA% 1 agaroz jel üzerinde çalışıyor örnekleri analiz edin. Daha kritik örnekleri için, üreticinin talimatlarına göre bir Agilent 2100 Bioanalyzer kullanarak RNA analiz edin. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Odunsu örnekleri ile farklı kozalaklı dokuların aralığı RNA izolasyonu verim 60-120 mikrogram / g dondurulmuş doku genellikle 70-80g / g dondurulmuş doku çevresindeki verimli. 260/280 ve 260/230 tanı oranları genellikle 2.1 'den daha fazladır ve RNA örneği ise, önemli bir fenolik veya karbonhidrat kirlenme ücretsiz olduğunu iyi göstergeleridir. EtBr boyama agaroz jel elektroforezi ile analiz Örnekleri 25S, 18S ve 5S RNA (Şekil 1) için üç ayrı grup göstermelidir. Agaroz jel üzerinde 18S 28S stokiyometri tespiti biraz öznel ve jel, boyama, ve örnek yük koşulları çalışan gibi faktörlerin hepsi bir etkisi olabilir. Genel olarak, 28S 18S oranı&gt; 1.5 olarak görünecektir. Ancak, bazı kozalaklı örnekleri daha düşük oranları var. Örneğin, Agilent 2100 analizi aşağıdaki stokiyometri 1.2:1 için yakın farklı doku tiplerinin kozalaklı örnekleri çeşitli örneklerini gördük. Böylece, belirgin bir düşük 28S 18S agaroz jel elektroforezi ile stokiyometri mutlaka düşük kaliteli örnek göstermek değildir. Yaprak, ateş ve koni örnekleri genellikle ek farklı bantları chloroplastic ribozomal RNA'lar nedeniyle mevcut olacak. Iyi örnek veya yüksek molekül kütlesi bantları (8-10 kb) göç etmeyen EtBr lekeli malzemeleri genellikle genomik DNA kontaminasyonu (Şekil 2) gösterir. 5S bant ve azaltılmış ribozomal bant boyama ya da belirgin bir 18S&gt; 28S stokiyometri RNA bozulması meydana gelmiştir (Şekil 3) iyi bir gösterge ya da aşağıda çevresinde Düşük moleküler kütlesi bulaşıyor. Agilent 2100 Elektroferogram analiz, taban çizgisi 18S ve 28S sahip 28S ribozomal RNA'lar ilgili önemli zirveleri ile düşük ve nispeten pürüzsüz olmalıdır: 1.2 'den 2.0' a her yerde değişen 18S oranları. Agilent RNA Bütünlük sayısı (RIN) değeri RNA kalitesini daha iyi bir belirleyicisi olabilir ve RNA mikroarray hedeflerinin hazırlanması için kullanılacak en az 7 veya daha büyük olmalıdır. 1.4 eşit 18S 18S: Şekil 5 RNA hazırlık 28S ortaya koyduğu gibi çok yüksek bir bazal ve fark bozulması olan fakir bir ksilem gösterirken oranı ve bir RIN değeri 8.6: Şekil 4, bir 28S ile ksilem RNA tipik bir Agilent 2100 Elektroferogram gösterir ra0.65 ve 3.4 RIN değeri eşit tio. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, yüksek kaliteli çam RNA agaroz jel analizi . Lane 1, NEB 1 kb standart, Lane 2 Loblolly çam ikincil ksilem karakteristik ribozomal 28S, 18S ve 5S bantları ve belirgin 28S ile tipik bir toplam RNA izolasyonu gösterir: 18S oranı&gt; 1. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 çam RNA örnek agaroz jel analizi genomik DNA ile kontamine olmuş . Lane 1 NEB 1 kb standart 2, Lane, genomik DNA kontaminasyonu gösteren ksilem RNA örnek. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 genomik DNA ile RNA bozulma ve kirlenme gösteren çam örnek agaroz jel analizi. Lane 1, NEB 1 kb standart, Lane2, genomik DNA kontaminasyonu ve şiddetli RNA bozulma gösteren ksilem RNA örnek. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 ksilem total RNA Agilent 2100 Elektroferogram Loblolly çam ksilem açıklanan yöntemi kullanılarak izole edilmiştir. 28S: 18S oranı 1.4 eşittir, RIN değeri 8.6 eşittir <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 Agilent 2100, ciddi bozulma ve genomik kirlenme gösteren apikal uç total RNA Elektroferogram . 28S 18S oranı 0.65 eşittir, RIN değeri 3.4 eşittir

<ol><li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li>
<li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li>
</ol>

Kozalaklı ağaç türlerinin yüksek kaliteli bir RNA Alınması odunsu dokularında bulunan fenolik ve polisakkarit bileşiklerin yüksek düzeyde verilen zor bir görev olabilir. Chang ve arkadaşları tarafından geliştirilen protokol ile başlayarak. (1), biz daha titiz çıkarma bulundu ve tutarlı kozalaklı türlerin geniş bir yelpazede örneklenmiş çeşitli odunsu ve odunsu olmayan dokular çok yüksek kalitede toplam RNA izolasyonu yol adımları temizlemek gerekir. Bu video modifiye RNA izolasyon protokol, aynı zamanda Loblolly çam önc...

<table><tbody><tr><td>RNA İzolasyon Tamponu</td><td></td><td></td><td>%2 CTAB (heksadesiltrimetilamonyum bromür), %2 PVP (polivinil pirolidon; Mw 30-40.000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidin</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-4</td><td></td></tr><tr><td>Fenol, Ultra Saf</td><td>Invitrogen</td><td>15509-037</td><td></td></tr><tr><td>10M LiCl</td><td></td><td></td><td>DEPC ile işlem görmüş su ile hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>SSTE Tamponu</td><td></td><td></td><td>1M NaCl, %0.5 SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td></tr><tr><td>Sodyum asetat (NaOAc) 3M pH4.8</td><td></td><td></td><td>DEPC ile işlem görmüş su ile hazırlanmıştır</td></tr><tr><td>Fenol-kloroform (pH8.0)</td><td></td><td></td><td>0.5M Tris-Cl pH 8.0 ile defalarca titrasyon yapılmış 120mL fenol, 160mL kloroform</td></tr><tr><td>Oak Ridge Yüksek Hızlı Teflon Tüpler</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-16B</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen 50mL Yüksek Hızlı Tüpler</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-10K</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon, steril, kapaklı 50mL konik tek kullanımlık tüpler</td><td>VWR international</td><td>#21008-939</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#2302830</td><td></td></tr><tr><td>Ambion RNazden Arındırılmış Mikrofüj Tüpleri, 2mL</td><td>Ambion</td><td>#AM12425</td><td></td></tr></tbody></table>

rna İzolasyonu loblolly Çam daha İyi bir yöntem ( s. taeda l.) ve diğer conifer türler

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Dokular özellikle Loblolly çam gibi kozalaklı türler, Pinaceae ailesine mensup olanlar, (den izole<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), yüksek konsantrasyonlarda RNA arıtma ile müdahale fenolik bileşikler ve polisakkaritler içerir. Bu türlerin yüksek kaliteli RNA izolasyonu mikroarray ve diğer genomik analizler için yeterli kalitede RNA izole etmek için birden fazla organik çıkarma adımları oluşan bir RNA izolasyonu protokolü ve istihdam alanında titiz doku toplama yöntemleri gerektirir. Alan toplanan Loblolly çam örnekleri zor olabilir, ama büyük ölçüde standart doku ve RNA izolasyonu işlemleri için çeşitli değişiklikler sonuçlarını iyileştirmek yüksek kaliteli RNA izolasyonu. Örnekleri, özellikle büyük ölçekli hasat sırasında, düzgün toplanan ve alandan taşınan eğer genel RNA bozulması ölçüde artırır. Toplam RNA verim örnekleri odunsu dokulara gelen özellikle, izolasyon RNA önce sıvı azot dondurucu değirmen ezerek örnekleri ile önemli ölçüde artış olabilir. Bu öncelikle, fenolik bileşikler, ve her ikisi de, en kozalaklı türlerin odunsu dokular alıntılar yüksek düzeyde mevcut polisakkaritler gibi oksitleyici ajanların varlığı nedeniyle. Kaldırılmaz, bu kirleticiler, RNA bozulması, bu sonucu düşük verim ve düşük kaliteli bir RNA örnek olarak sorunları, önde gelen üzerinde taşıyabilir. Bulaşma, fenolik bileşikler, polisakkaritler, yanı sıra da azaltmak veya cDNA sentezi için yaygın olarak kullanılan ters transkriptaz veya diğer polimerazları aktivite hatta tamamen ortadan kaldırabilir. Araştırmacılar bekliyoruz eğer Özellikle, RNA, cDNA kütüphaneleri nesil çift iplikli cDNA sentezi PCR veya qPCR Kullanıcı için tek iplikli cDNA sentezi, veya mikroarray hedef malzeme sentezi için Şablonu olarak kullanılmak üzere kaderinde en yüksek kalitede olması gerekir optimum sonuçlar elde etmek için. Diğer birçok bitki türünün yaygın istihdam RNA izolasyon teknikleri kozalaklı örneklerinden bu kirleri çıkarmak ve böylece aşağı manipülasyonlar için uygun toplam RNA örnekleri verim yok yeteneklerini genellikle yetersizdir. Bu videoda, floem hasadı, ikincil ksilem ve reaksiyon ahşap ksilem, kırk yaşındaki ağacın kesilmesi ile başlayan kozalaklı dokuların alan koleksiyon için yöntemler göstermektedir. Ayrıca, tutarlı bir sonraki enzimatik manipülasyonlar için yüksek kaliteli bir RNA vermiştir RNA izolasyonu protokol göstermektedir.

Loblolly çam ksilem ve floem de dahil olmak üzere birçok bitki dokularında, (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), fenolik ve RNA arıtma müdahale polisakkaritler yüksek düzeyde içerir. Bu sunum alanında yetişen doku ve mikroarray&#39;ler ve diğer genomik analizler için yeterli kalitede RNA izolasyonu hasat teknikleri tartışır.

RNA İzolasyonu Loblolly Çam Daha İyi Bir Yöntem ( S. taeda L.) ve Diğer Conifer Türler

Özellikle loblolly çamı (*Pinus taeda* L.) gibi Pinaceae familyasına ait olan konifer türlerinden izole edilen dokular, yüksek miktarda ... içerir.

Aşağıdaki içerik, Georgia Üniversitesi ve Warnell Ormancılık ve Doğal Kaynaklar Okulu'ndaki araştırmacılar tarafından hazırlanmıştır. Bu demonstrasyon videosu, Amerika Birleşik Devletleri'nde orman ürünleri üretimi için en önemli konifer türü olan ve yaygın olarak loblolly çamı olarak bilinen Pinus Teta'dan ksilem ve floem dokusunun hasat edilmesini ve ardından RNA izolasyonunu açıklamaktadır. Ağaç devrildikten sonra (bu vakada 40 yaşında bir ağaç), ana gövde yaklaşık 50 santimetre uzunluğunda parçalara bölünür.Ardından, kabuğun sökülmesini kolaylaştırmak için motorlu testere ile cıvata boyunca birkaç yerde boylamsal çizikler oluşturulur. Çekiç ve ağaç iskarpelası kullanılarak, kabuk bölümler halinde soyulabilecek hale gelene kadar kaldırılır. Sonrasında, akım dokusu el yardımıyla çıkarılıp kabuk bölümlerinin iç kısmından soyulur ve derhal sıvı azota daldırılır.Kabuk soyulduktan sonra, tek taraflı bir jiletle bolt yüzeyi kazınarak ince sekonder ksilem tabakası toplanabilir. Sulu ksilem dokusu derhal sıvı azota yerleştirilir. Bu hasatta, ana gövdeden dallar kesilmeden önce genellikle basınç ve karşıt odun olarak adlandırılan reaksiyon odunu örnekleri de toplanmıştır.İki doku tipini içeren alanların (dalın üst kısmındaki karşıt odun ve alt kısmındaki sıkışma odunu) belirlenebilmesi için öncelikle dal yönü sprey boya ile işaretlenir. Kabuk soyma işlemi sırasında, dallar önce sıkışma ve karşıt odun bölgelerini belirleyen çizgiler boyunca motorlu testere ile çizilir ve kabuk soyma işlemi, ana gövde boltlarında olduğu gibi gerçekleştirilir; ancak yalnızca ilgili reaksiyon tipine karşılık gelen bölgedeki kabuklar soyulur.Hasat edilen odun herhangi bir zamanda çıkarılır. Bu daha küçük dallardan geniş kabuk bölümlerini çıkarmak genellikle daha zordur. Sekonder ksilem reaksiyon odunu örnekleri, normal sekonder ksilemde olduğu gibi, jiletle kazıma ve hemen sıvı azota daldırma yöntemiyle toplanır.Sıkışma odununa özgü kırmızımsı kahverengi renge dikkat edin. Büyük bir ağaçtan birden fazla örnek toplamanın ve işlemenin, RNA degradasyonunu azaltmaya yardımcı olmak amacıyla tüm doku türlerinin eş zamanlı olarak toplandığı, her bir kişinin belirlenmiş bir görevi yerine getirdiği çok sayıda kişi gerektirdiği belirtilmelidir; dondurulmuş örnekler sıvı azottan çıkarılarak etiketli saklama torbalarına aktarılır ve laboratuvara geri taşınmak üzere kuru buz üzerine yerleştirilir. İlk adımımız, dokuyu specs model 68 50 dondurucu değirmen kullanarak toz haline getirmektir; havan ve havan eli ile öğütmeye kıyasla bu adım, örnekler sıvı azotla soğuk tutularak odunsu doku örnekleri için RNA ekstraksiyon verimini önemli ölçüde artırır.Doku önce elle daha küçük parçalara ayrılır ve örnek haznesine yerleştirilir. Hazne, yerine kilitlenmiş olan taşıyıcıya yerleştirilir ve örnek iki dakika boyunca öğütülür. Nihai ürün, kaba bir toz kıvamındadır.RNA ekstraksiyon protokolü iki günlük bir işlemdir. İlk gün, 65 °C'ye ısıtılmış RNA ekstraksiyon tamponuna 2,5 gram dondurulmuş doku eklenir. Örnek, karıştırmak için kuvvetlice çalkalanır; ardından eşit hacimde kloroform eklenir ve örnek nazikçe tersyüz edilerek tekrar karıştırılır.Numune daha sonra beş dakika boyunca döner bir tekerlek üzerine yerleştirilir. Ardından numune, yüksek hızlı Teflon Oakridge tüplerine aktarılır ve SS 34 rotorunda 12,000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj edilir. Üstteki sulu fraksiyon yeni bir tüpe alınır ve yarım hacim kloroform eklenir.Numune bir dakika boyunca vorteksle karıştırılır ve tekrar beş dakika boyunca döner tekerlek üzerine yerleştirilir. İkinci bir santrifüj işleminden sonra, sulu fraksiyon tekrar 50 ml'lik yüksek hızlı bir polipropilen tüpe aktarılır ve 10,000 RPM'de 20 dakika boyunca santrifüj edilir. Kalan partikülleri uzaklaştırmak için numune 50 ml'lik bir Falcon tüpüne dekante edilir ve numuneye hacminin dörtte biri kadar 10 molar lityum klorür eklenir.Numune çalkalanarak karıştırılır ve gece boyunca 4 °C'de bekletilir. İkinci günde, lityum klorür ile çöktürülmüş numune önce 4 °C'de 30 dakika boyunca 11.000 RPM'de santrifüj edilir.Sıvı dökülerek atılır ve tüpler bir dakika boyunca kimyasal temizleme mendillerinin üzerine ters çevrilir. Fazla sıvıyı uzaklaştırmak için, görünür olması gereken RNA peleti, 65 °C'ye önceden ısıtılmış 800 µL sıcak SSTE tamponu içinde yeniden süspande edilir. Peletin tamamının çözeltiye girdiğinden emin olmak için pipetle birkaç kez yukarı aşağı ve pelet kenarlarının tamamında çekme işlemi yapıldığından emin olun.Ardından, yeniden süspanse edilen RNA'yı iki mil ve ötesi RNA içermeyen bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Örneği 65 °C'lik bir su banyosunda bir ila iki dakika ısıtın ve ardından örneğin tamamen yeniden süspanse olduğundan emin olmak için vorteksleyin. Gerektiğinde bu işlem tekrarlanabilir.Şimdi, eşit hacimde tamponlanmış fenol kloroform ekleyin. Numuneyi 15 ila 20 saniye boyunca vorteksleyin ve 14.000 RPM'de üç dakika boyunca mikro santrifüjden geçirin. Sulu faz yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır ve eşit hacimde eklenir.Numune, önceki ekstraksiyonda olduğu gibi vorteksle karıştırılır ve mikro santrifüjlenir. Son organik ekstraksiyon aşaması için, jel bariyerli tüpler önce iki dakika boyunca 11.000 RPM'de mikro santrifüjlenir.Ardından, önceki ekstraksiyondan elde edilen RNA örneği faz kilitleme jeline eklenir, ardından yarım hacim kloroform eklenir ve her ikisi pipetleme yoluyla nazikçe karıştırılır. Daha sonra örnek, 11.000 RPM'de beş dakika boyunca mikro santrifüjlenir ve sulu RNA örneği yeni bir Ambion RNA'dan arındırılmış mikro santrifüj tüpüne aktarılır. Bir sonraki adım, örneğe on kat düşük hacimde 3 molar sodyum asetat pH 4.8 ve iki hacim %100 etanol eklenerek gerçekleştirilen basit bir RNA çöktürme işlemidir.Numune vortekslenir, kısa bir süre -80 °C dondurucuda 30 dakika bekletilir ve ardından 4 °C'de 30 dakika boyunca mikrosantrifüjlenir. Süpernatan dikkatlice aspire edilir ve küçük beyaz pelet, 1 mL buz gibi soğuk %70 etanol ile yıkanıp aspire edilir; son aspirasyondan sonra etanol yıkama işlemi tekrarlanır. Tüpler beş dakika boyunca tezgah üzerinde açık bırakılarak kalıntı etanolün buharlaşması sağlanır.RNA peletleri 100 µL DEPC'li su içinde süspanse edilir ve vorteksleme ile 65 °C'de ısıtılarak yeniden çözündürülür. Gerektiğinde bu işlem tekrarlanabilir. Örnek konsantrasyonu belirlenir.Örnekteki protein ve karbonhidrat kontaminasyonunun düzeyini tahmin etmek için spektrofotometrik olarak 260/280 ve 260/230 oranları hesaplanır. Örnek kalitesini, genomik DNA kontaminasyonunu ve RNA degradasyonunu kalitatif olarak tahmin etmek için %1'lik AGROZ jel elektroforezi kullanılır. Kritik örneklerin örnek bütünlüğü, ribozomal 28S/18S oranlarını ve bir RNA bütünlük numarasını (RIN) belirlemek amacıyla Agilent 2100 biyoanalizör kullanılarak daha ayrıntılı şekilde değerlendirilir. LOB lolly pine'dan doku örneklerinin toplanması ve toplam RNA izolasyonu hakkındaki videomuzu izlediğiniz için teşekkür ederiz.Aşağıdaki kişiler, bu eğitim videosunun çekiminden ve prodüksiyonundan sorumludur.

an-improved-method-rna-isolation-from-loblolly-pine-p-taeda-l-other

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

CDNA mikroarray PtGen2 Loblolly çam gen ekspresyon çalışmaları için...

İşleme Loblolly Çam PtGen2 cDNA Mikroarray

Radyoaktif olmayan In situ Hibridizasyon Norveç Ladin Uygulanacak Protokol ve Bitki Türlerinin Aralığı

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Yüksek saflıkta RNA izolasyonu üzerinde inhibitör etkileri olan büyük miktarlarda yağ, protein ve polifenol içeren bitki tohumlarından RNA izolasyonu için bir yöntem oluşturmayı başardık. Yöntemimiz, tohumlarda düşük seviyeli transkriptlere sahip genlerin ekspresyonunu izlemek için uygundur.

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Burada, RNA örneklerinde genomik DNA (gDNA) kirlilik izleme için bir iletişim kuralı mevcut. Sunulan yöntem astar özel ribozomal DNA (rDNA) gen iç kopya etmek spacer bölge (ITS) için kullanır. Yöntem güvenilir ve hassas algılama DNA kirlenme çoğu Ökaryotlar ve prokaryotlar için uygundur.

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

Bu iletişim kuralı kimliği ve lenf düğümlerinden hayvancılık ve yaban hayatının yaklaşımlar örnekleme, eksizyon adımlar dahil olmak üzere büyük hayvanlar dokulardan lenf nodu transcriptomic profilleme için RNA izolasyonu için yordamlar genel bakış sağlar sonrası koleksiyonu saklama ve işleme için RNA analizi için birden fazla hayvan ve dikkat edilmesi gereken noktalar artı temsilcisi sonuçları arasında tutarlılığı sağlamak için.

Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Burada, hat-1 ifadesini Locus özel seviyesinde belirlemek için Biyoinformatik bir yaklaşım ve analizler sunuyoruz.

RNA yeni nesil sıralamayı ve Biyoinformatik boru hattını Locus 'a özgü düzeyde Ifade eden SATıRı-1s tanımlamak için

Standart yöntemlere göre daha az önyargılı ve 2'-O-metil RNA'lar için artan hassasiyetiçeren ayrıntılı bir küçük RNA kütüphane telafi protokolü saiyoruz. Bu protokol maliyet tasarrufu veya kolaylık sağlamak için kitleri kullanarak ev yapımı reaktifler kullanılarak izlenebilir.

Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti

Bu protokol, NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü çeviri ribozomal mRNA'ları izole etmeyi amaçlamaktadır.

Hücre Tipine Özgü RNA'ları, Hücre Sıralama Olmadan Dondurulmuş Heterojen Doku Örneklerinden İzole Edin

Arabidopsis bitkilerinin yaprak yüzeyinden ve apoplastından hücre dışı RNA'yı izole etmek için basit ama oldukça tekrarlanabilir bir yöntem tarif ediyoruz.

Arabidopsis rozetleri kullanılarak yaprak yüzeyi ve apoplastik RNA'nın izolasyonu ve analizi için aşamalı bir kılavuz

Öğrenin Pinus taeda ve diğer iğne yapraklılardan yüksek kaliteli RNA izolasyonu için etkili hasat tekniklerini. Bu yöntem, fenolikler ve polisakkaritlerle mücadele ederek genomik araştırmalar için güvenilir sonuçlar sağlar.

RNA İzolasyonu Loblolly Çam Daha İyi Bir Yöntem ( S. taeda L.) ve Diğer Conifer Türler

Daha fazla video keşfet