Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Bu video, embriyonik spinal korddan komişoral nöronların diseksiyonu ve kültürü için bir yöntemi göstermektedir. Prosedür, E 13 sıçan embriyolarının toplanması ve ardından spinal kordların diseksiyonla çıkarılmasıyla başlar. Diseksiyon sırasında, spinal kordlar roof plate boyunca açılır ve "açık kitap" konfigürasyonunda hazırlanır.

Dorsal doku şeritleri diseke edilir ve bir tüpe toplanır. Dorsal doku, tripsin ve mekanik parçalama yoluyla tek hücreli bir süspansiyona dönüştürülür. Ardından komissüral nöronlar, polilizin kaplı cam lameller veya doku kültürü kapları üzerinde kültüre edilir.

Ardından bunlar, akson büyümesinin ve yönlendirmesinin hücresel ve moleküler mekanizmalarını incelemek için kullanılabilirler. Merhaba, ben Montreal Klinik Araştırma Enstitüsü'ndeki Sinirsel Gelişimin Moleküler Biyolojisi Laboratuvarı'ndan Sebastian. Merhaba, ben de Sinirsel Gelişimin Moleküler Biyolojisi Laboratuvarı'ndan Steve Moen.

Bugün sizlere, embriyonik omurilikten komissural nöronların diseksiyonu ve kültüre edilmesi prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, akson yöneliminin hücresel ve moleküler mekanizmalarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bugün, diseksiyon boyunca L 15 ortamı içeren bir kapta tutulan, yeni toplanmış E 13 sıçan embriyolarından spinal kordlar diseke edilecektir. Embriyoların ve solüsyonların buz üzerinde tutulması önemlidir. Tüm diseksiyon adımlarında, spinal kordun tamamen sağlam bir şekilde izole edilmesini engelleyebileceği için onun gereğinden fazla gerilmemesinin kritik olduğunu unutmayın.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, embriyoyu tüm ekstra embriyonik dokulardan ve embriyonik membranlardan ayırın. Ardından bir embriyoyu diseksiyon kabına yerleştirin. Burada gösterilen açılardan baş ve posterior kısımları kesip çıkarmak için mikro makas kullanın.

Bu işlem, omuriliğe kolayca erişebilmek için embriyonun konumlandırılmasına yardımcı olacak düz bir yüzey oluşturacaktır. Embriyoyu, anterior kısmı karşıya bakacak şekilde ventral tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Embriyoyu bir taraftan sıkıca sabitlemek için pens kullanın.

Forcepsleri sıkıştırmayın veya bırakmayın, aksi takdirde ikinci forseps çiftiyle doku yırtılacaktır. Omuriliğin yanındaki deriyi kavrayın. Tutucu forsepslerin uçlarını hafifçe oynatın.

Omuriliği saran meningesleri ortaya çıkarmak için embriyonun sırtını kaplayan deriyi soyun ve omuriliğin sağındaki dokuyu kısmen ayırın. Tutucu pensin bulunduğu seviyeden başlayarak dokuyu dürtmek için kapalı pens kullanın. Omuriliğe temas etmeden ona mümkün olduğunca yakınlaşın.

Omurilik boyunca birkaç kez tekrarlayın. Bu işlem bazı dorsal kök ganglionlarını ekleyecek ve ventral organları bozacaktır. Anterior uçtan başlayarak, anterior ve posterior uçlarda bir miktar doku bırakın.

Meningesleri kesmek ve spinal kordu roof plate boyunca açmak için kanca şeklinde bir tungsten iğne kullanın. Embriyoyu 180 derece döndürün ve aynı yöntemi kullanarak dokuyu kalan taraftan ayırın.

Ardından, spinal kordun sol tarafındaki, başlangıçta sağda olan ve daha önce bozulmuş olan taraftaki dokuyu tamamen ayırın, spinal kordu yan yatırın ve kalan mezenkimal dokunun ve dorsal kök ganglionlarının çoğunu uzaklaştırmak için pens kullanın. Meningeslerden kısa bir flebi soyarak açmak için pens kullanın. Bu aşamada, meningesler ve spinal kord, sandviç şeklinde iki doku tabakası halindedir.

Omuriliğin anterior uçtaki daha büyük kısmını sabitlemek için pens kullanın. İki ayrılmış segmenti pensle tutun ve meningesleri soyun. Pürüzsüz ve sabit bir hareketle ilerleyin; düzensiz soyma işlemi meninges tabakasının ve/veya omuriliğin kopmasına neden olabilir.

Çekme işlemi sırasında meninges tabakası yırtılırsa, meningeslere yapışık kalan omurilik kısmı genellikle kurtarılamaz; ancak bu durum bazen mümkün olabilir. Daha fazla embriyo ile işlem yapmadan önce, izole edilen omuriliği plastik bir pipet kullanarak buz üzerinde, %10 ısı ile inaktive edilmiş at serumu içeren L 15 ortamı bulunan bir kaba nazikçe aktarın.

Embriyoyu soğuk tutmak ve doku bütünlüğünü korumaya yardımcı olmak için diseksiyon kabındaki besiyerini soğutulmuş L 15 ile değiştirmeyi unutmayın. Dorsal omurilik diseksiyonlarına geçmeden önce tüm embriyolardan omurilikleri hasat edin. Dorsal kord diseksiyonuna başlamak için, taze izole edilmiş bir omuriliği, %10 ısı ile aktive edilmiş at serumu içeren L 15 bulunan bir Petri kabına yerleştirin.

Arka beynin bir kısmını içeren daha geniş ön bölümü kesin. Ardından omuriliği düz bir şekilde yatırın ve açık bir kitap gibi yayın. Omuriliğin açık kitap şeklindeki yapısının en lateral kısımlarında yer alan dorsal dokuyu, düz bir tungsten iğne ile sabitleyerek L şeklinde bir tungsten iğne yardımıyla omuriliğin bir yarısının genişliğinin yaklaşık beşte biri kadar bir şerit halinde kesin; daha geniş şeritler kesmek verimi artıracak ancak kültürün saflığını azaltacaktır.

Birden fazla dorsal şeridi, %10 at serumu içeren L 15 medyumlu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü buz üzerine yerleştirin. Prosedürün geri kalanı doku kültürü kabininin yakınında veya içinde gerçekleştirilecektir. Bu kültürler için, çözeltilerin ve ekipmanların önceden, genellikle diseksiyondan önce hazırlanması önemlidir.

Tasyon adımı, biri orijinal boyutun yarısı çapında ve diğeri biraz daha küçük olan iki farklı boyutta ateşle cilalanmış pasta pipetleri kullanır. Başlamadan önce, pipetlerin içine medium aspire ederek ve 30 saniye bekleterek iki ateşle cilalanmış pipeti serum içeren medium ile kaplayın. Bu işlem, tasyon sırasında cama yapışan hücre sayısını azaltacaktır.

Sırt şeritlerinin tüpün dibine çöktüğünü doğrulayarak başlayın. Laminer akışlı kabin altında, SUP yüzen kısmının çoğunu düz bir pipetle uzaklaştırın. Üç mililitre soğuk, magnezyum ve kalsiyum içermeyen HBSS ile hızlıca yıkayın.

Dorsal nöral tüp şeridinin iki dakika boyunca çökmesini bekleyin. Ardından, HBSS'yi pipetle uzaklaştırın. Hacmi 4,7 mililitreye tamamlayın.

Sıcak HBSS ile, nihai konsantrasyon %0,15 Trypsin olacak şekilde 0,3 mililitre %2,5 trypsin ekleyin ve nazikçe karıştırıp 37 °C su banyosunda yedi dakika inkübe edin. İnkübasyonun ortasında bir kez nazikçe karıştırın. İnkübasyon süresi dolduğunda, nihai konsantrasyonu mililitre başına 150 ünite olacak şekilde DNAs ve nihai konsantrasyonu %0,15 olacak şekilde magnezyum sülfat ekleyip kısa süreli karıştırın.

Dorsal nöral tüp kesitleri artık parçalanmış olmalıdır. Doku parçalarını 200 G'de dört dakika boyunca santrifüjleyin. Tüpün dibinde yaklaşık 50 ila 100 µL sıvı bırakacak şekilde SUP süpernatantını bir pipet yardımıyla uzaklaştırın.

Pelleti gevşetmek için tüpü hafifçe sallayın. Ardından, beş mililitre ılık HBSS ekleyerek hücreleri yıkayın. Hücrelerin oda sıcaklığında iki dakika boyunca çökmesini bekleyin.

Hücreleri tekrar çöktürün ve yıkayın. Bu kez, iki mililitre sıcak HBSS içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri yavaşça dört ila altı kez pipetleyerek tritüre etmek için yarım çaplı alevle cilalanmış bir pipet kullanın; hücre ölümünü azaltmak için daha büyük kümeleri parçalamak amacıyla sıvıyı tüpün kenarına doğru pipetleyin.

Kabarcık oluşumundan kaçının ve aşırı pipetleme yapmayın. Hücreleri daha fazla ayrıştırmak için en küçük alevle cilalanmış cam pastör pipeti kullanarak, aynı şekilde yavaşça üç veya dört kez yukarı aşağı pipetleme yapın. Ölü hücreler ve döküntülerden agregatlar oluşma eğiliminde olduğundan, tüm hücre kümelerini ayrıştırmaya gerek yoktur.

Herhangi bir doku fragmanının çökmesi için bir dakika bekleyin. Ardından, hemo soter cihazında sayım için süspansiyon halindeki hücreleri içermesi gereken SUP üst fazından 20 µL alın; nöronlar, tripan mavisi boyama plakası ile en az %95 canlı olmalıdır. Nöronları, uygulamanız için uygun bir konsantrasyonda nörobazal ekim medyasına aktarın.

16 ila 18 saat sonra, nöronların yerinden çıkmasını önlemek için besiyerini nöral bazal büyüme besiyeri ile değiştirin. Besiyerini, vakum pompasıyla aspire etmek yerine bir pipet yardımıyla nazikçe uzaklaştırın. İşte PLL kaplı cam lameller üzerine ekilen izole komissural nöronların temsilci sonuçları; nöronlar, ekimden 4 saat sonra yüzeye yapışmış durumdadır ve ekimden sonra 30 saat geçmiştir.

Çoğu nöron, görünür bir büyüme konisine sahip uzatılmış aksonlara sahiptir. Bu nöronlar, immünofloresan deneylerinde kolaylıkla kullanılabilir. Bu örnekte, mikrotübüller yeşil, aktin kırmızı ve NA mavi renkle işaretlenmiştir.

Embriyonik omuriliklerden komissural nöronların nasıl diseke edileceğini ve kültüre edileceğini gösterdik. Bu prosedürü uygularken, komissural nöronların saflığının, diseke edilen dorsal şeridin kalınlığına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.