Name: Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Öğrenin E13 sıçan embriyolarından komissüral nöronların diseksiyon ve kültür yöntemini. Bu teknik, akson büyümesi ve yönlendirmesinin hücresel mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR), Peter Lougheed Tıbbi Araştırma Vakfı, Neuroengineering McGill Programının hibeleri ile desteklenen, Viyana de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) ve Yenilik Kanada Vakfı (CFI .) Viyana Master Eğitim Ödülü Sébastien D. Langlois tarafından desteklenen de la Recherche en santé du Québec (FRSQ) ve Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüleri Frederick Banting ve Charles tarafından En İyi Kanada Lisansüstü Bursları Master Ödülü. Biz rakamları ile yardım için Jessica MT Pham müteşekkiriz.

1. Embriyonik sıçan dorsal spinal kord diseksiyonu Genel öneriler L-15 orta boy buz üzerinde tutun ve sık sık diseksiyonu çanak orta embriyoların serin tutmak için. Bu doku bütünlüğünü korumaya yardımcı olur. Belirtilmediği sürece tüm adımları Dumont # 5 forseps iki çift ile yapılır. Kontaminasyonu engellemek için,% 70 etanol ile tüm araçlar ve çalışma yüzeylerinde sprey ve diseksiyon orta şişe kapalı tutmak. Yemekler arasında embriyolar transfer etmek için, bir kesim plastik pipet veya delikli bir kaşık kullanın. Diseksiyonu başarıyla tamamlamak için omurilik (germe, nick) zarar görmemesi için kritik öneme sahiptir. Hazırlık <ul><li> Soğuk L-15 orta </li><li> L-15 50 ml +% 10 ısı ile inaktive edilmiş at serumu (HiHS). Buz üzerinde tutun. </li></ul> Omurilik diseksiyonu <ol><li> Euthanize E13 gebelik aşamalı sıçan (E0 = çiftleşme gün sonra ilk gün) kurumsal kurallarına göre CO 2 odalı. </li><li> Karın% 70 etanol Sprey. Cerrahi makas ile forseps ve kesme alt karın bölgesi, cilt sıkın ve yukarı çekin. Karın boşluğuna ulaşmak için kas ve peritoneal katmanları üzerinden kesmek için tekrarlayın. Toraks, karın kenarlarında doku kesme bir V şeklinde kesi oluşturun. Asansör ve karın boşluğuna maruz doku geri çekin. </li><li> Rahim üç yerde bağlı olduğu alt merkezi karın ve her iki üst lateral köşelerinde. Embriyonik keseler arasındaki doku üzerinde kapma rahim kaldırın. Bağ dokusu, rahim ve buz üzerinde L-15 ile dolu bir Petri kabındaki kaldırmak için kesin. </li><li> Sonraki adımları bir diseksiyon mikroskop altında yapılır. Extraembryonic doku ve embriyonik membranlar bir embriyo ayırmak için, bir çift forseps ile rahim keseler arasındaki doku kapmak. Diğer çifti ile, yüzeysel membranlar (karanlık tarafı plasenta) yoluyla kesmek için kesenin daha şeffaf yan tutam. Embriyo kesesinin plasenta tarafında hafifçe basarak sıkın. Buz üzerinde L-15 ile doldurulmuş bir Petri kabındaki bütün embriyolar ve yer çıkarın. </li><li> Buz gibi L-15 ile doldurulmuş 10 cm Petri kabı yerleştirin, tek bir embriyo. Microscissors kullanarak, şekil 1a gösterilen açıda baş ve arka parçalar kesip. Bu açıda kesme pozisyonu embriyo "aşağı ventral yüzü" yerleştirilmesini yardımcı olacaktır. </li><li> Pozisyon embriyo "ventral yüzü aşağı" (anterior yere dönük, deneyci doğru işaret posterior) (Şekil 1b). </li><li> (Şekil 1c) embriyo "aşağı pin" forsepsi kullanarak, bir taraftan embriyo sıkıca tutun. Doku gözyaşı gibi, forseps hareket ettirmeyin. Forseps diğer çifti, deri soyulabilir "tutma" forseps (Şekil 1d-e) arasındaki bölgede başlayan embriyonun arkasına kapsayan. Bu, bu noktada, membranlar (meninksler) tarafından sarılmış, omurilik gösterecektir. Taraftan deri omurilik üzerinde değil, omurilik nicklemek önlemek için tut. </li><li> Kısmen omurilik (Şekil 1f) sağ tarafında doku ayırın. Holding forseps düzeyinde başlayarak, omurilik mümkün olduğu kadar yakın, kapalı forseps ile doku karıştırmak. Sonra yavaş yavaş, doku gözyaşı forseps açık. Bu, omurilik dorsal kök gangliyon (DRG) ayırmak gerekir ve ventral organları engel olmamalıdır. Böylece sonraki adım sırasında yukarı doğru çekilerek önlenmesi, bağlı bırakmak doku, embriyo ağırlık katan ön ve arka ucunda bağlı bazı doku bırakın. Buna ek olarak, bu doku, sonraki adımlarda embriyo üzerinde tutmak için kullanılır . </li><li> Ön ucundan başlayarak, meninksler kesme ve roofplate (Şekil 1g) boyunca omurilik açmak için kanca şeklinde tungsten iğne kullanın. </li><li> Embriyo 180 derece (posterior anterior deneyci dönük uzakta, işaret) (Şekil 1s) döndürün. Bu deneyci embriyonun diğer taraftan doku ayırmak için aynı eli kullanmanıza olanak sağlar. </li><li> Daha önce müstakil yüzüne kapma embriyo tutun ve (bakınız 1.8.) Aynı yöntemi kullanarak diğer taraftan doku bozabilir. Bittiğinde, omuriliğin her iki tarafta doku tamamen ayırın. Alternatif: Tamamen sol tarafında kalan doku ayırmak, ancak sağ taraftaki ön ve arka sonunda eklenen bazı doku bırakın. Bu bazen adım 1.12 pozisyonda spinal kord korumaya yardımcı olabilir. </li><li> Yan omurilik yerleştirin ve kalan mezenkimal doku ve DRG'ler çoğu (Şekil 1i) kaldırmak. </li><li> Bu aşamada, beyincik ve omurilik birbiri üzerine apposed doku iki "levha". Spinal kor menenjlerin kısa bir bölümü kapalı, büyük, en ön-omurilik kısmı ve kabuğu aşağı pind (Şekil 1j, sol). Şimdi, forseps ile arasında kapma ayrılmış iki segmentleri tutun ve bir düz, sabit bir hareketi (Şekil 1j) ile meninksler soyulabilir. Eşitsiz omurilik ve / veya meninksler katmanı kırılmaya yol açacaktır "soyma". Hala meninksler bağlı omurilik kısmını kurtarmak için genellikle mümkün değildir. </li><li> Plastik bir pipet kullanarak, L-15 +% 10 HiHS içeren Petri izole spinal kord transferi ve buz üzerinde bırakın. Tipik olarak, tüm embriyoların omurilik dorsal kısımlarını diseksiyon önce toplanır. </li></ol> Dorsal omurilik diseksiyonu <ol start="15"><li> L-15 +10% HiHS içeren bir "açık-kitap" yapılandırma düz yalan bir Petri kabındaki bir omurilik. Kesip daha geniş, ön kısmı (Beyin parçası içerir) (Şekil 1k). </li><li> Dorsal dokusunun omurilik (incir 1l, sol) en lateral kısımlarında yer almaktadır. , Genişliği yarım omurilik 1/5th bir şerit, düz bir tungsten iğne ile kablosu bağlantılarını kesmek için L-şekilli tungsten iğne kullanın. (Şekil 1l, sağ). 15 ml plastik tüp buz üzerinde L-15 +% 10 HiHS içeren bir sırt şeritleri yerleştirin. ~ 12 E13 embriyoların dorsal nöral tüp bölümlerini disosiasyon sonra kaplama için ~ 3.5-4 milyon hücre verecektir. Dorsal spinal kord (geniş dorsal şeritler kesme) bir kaba diseksiyonu yaparak daha fazla hücre elde edilebilir, ancak commissural nöron saflık azalacaktır. </li></ol> 2. Commissural nöron kültürü Genel öneriler Tüm adımları, aksi belirtilmedikçe, doku kültürü kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır . Taze orta ve taze çözülmüş takviyeleri ve reaktifler kullanın. Bölünmeler ve ezerek toz haline getirme adımları Ca 2 + / Mg 2 + Ca 2 en aza indirmek için ücretsiz HBSS + / Mg 2 + bağımlı adezyon yapılmaktadır. Hazırlık <ul><li> kaplamalı lamelleri (Alman Desag cam kullanmak) veya doku kültürü levhalar (aşağıda kaplama yordama bakın). </li><li> sıcak Neurobasal Kaplama Medya (aşağıya bakın), doku kültürü yemekleri ve kaplama önce en az 1.5 saat süreyle doku kültürü inkübatörde 2 dengelenmiş CO. </li><li> 37 ° C su banyosunda% 2.5 tripsin </li><li> 2 şişe HBSS Ca 2 + Mg / 2 + ücretsiz, 4 ° C, az bir 37 ° C. </li><li> iki yangın parlatılmış cam Pasteur çapı yarım olağan boyutta ve yarısından biraz daha küçük bir çapa ile bir pipetler. Sterilize Pasteur pipetler kullanın. Pipetler ateş-lehçe için, çapı biraz azaltmak için ucu eritmek için (açık mavi alev üst) Bunsen beki kullanın. Bu adımı doku kültürü kaputu dışında olduğundan, doku kültürü kaputun altında yerleştirmeden önce% 70 etanol ile pipetler spreyi. Nöronlar, mont, başlamadan önce sadece öğütme adım önce ayrışma veya (pipetler medya ile doldurun ve 30 saniye boyunca tutun) içeren serum medya ile Pasteur pipetler daha verimli geri almak için Bu hücreleri öğütme sırasında Pasteur pipeti içine yapışmasını önleyecektir. </li><li> PLL kaplı yemekleri veya lamelleri yıkamak için steril milliQ su </li><li> HBSS% 12.5 MgSO 4 çözüm </li></ul> Poli-L-lisin kaplama Cam lamelleri, 24 saat boyunca asit yıkama ve kaplama (bkz. Kaech ve Banker, 2006) önce sterilize kullanıyorsanız. Alman Desag cam lamelleri kullanın. Kat, cam lamelleri ya da plastik doku kültürü yemekleri poli-L-lizin: <ul><li> bir doku kültürü kaputu altında, 1,75-2 saat için 100 ug / ml PLL çözüm küçük bir kubbe ile yüzeyleri kapsar. </li><li> milliQ su, yıkama başına en az 5 dakika (aşağıda hücre disosiasyon adım sırasında yapılabilir) ile iki kez yıkayın. </li><li> kullanımı kadar su saklayın. PLL kaplı yüzeyi kuru izin vermeyin. Lamelleri kaplama için PLL israfını azaltmak için, bakteri steril Petri yemekler lamelleri yerleştirin. Coat ve lamelleri üzerinde sıvı bir kubbe yerleştirerek lamelleri yıkayın. Bakteriyel Petri yemekler hidrofobik, bu nedenle sıvı cam lamelleri kalmalıdır. Hücrelerin sadece kaplama önce doku kültürü yemekleri lamelleri aktarın. Plastik doku kültürü yemekleri kaplama nöronlar için, yapışma, normalde daha yüksek, dolayısıyla neurite uzama azalmış olabilir. </li></ul> Bölünmeler ve kaplama <ol><li> Dorsal şeritler tüpün dibine yerleşmiş olduğunu kontrol edin. Pasteur pipeti ile L-15 +10% HiHS en çıkarın. Hızlı soğuk (4 ° C) HBSS 3 ml ekleyerek, bir kez dorsal nöral tüp şeritler yıkayın. </li><li> Dorsal nöral tüp şeritleri 2 dakika dinlendiriniz, daha sonra Pasteur pipeti ile HBSS çıkarın. </li><li> 4.7 ml bir birime sıcak (37 ° C) HBSS ekleyin. Then% 0.15 tripsin son bir konsantrasyon elde etmek için 0.3 ml% 2.5 tripsin ekleyin. </li><li> 37 ° C'de 7 dakika süreyle su banyosunda inkübe edin. Kuluçka yoluyla kez yarı yolda hafifçe karıştırın. </li><li> 150 U / mL son konsantrasyon için 30 ul DNAz (25 000 U / ml) ekleyin. 60 ul MgSO 4 ekleyin ve son bir konsantrasyon için% 0,15, kısaca karıştırın. Için 37 ekstra 1 dakika boyunca inkübe kaba diseksiyonları doku ° C su banyosunda. Bu aşamada, dorsal nöral tüp bölümleri parçalanmış olmalıdır. Dorsal nöral tüp bölümler parçalanmaya başlamış yoksa, genellikle% 2.5 tripsin stok eski olduğu anlamına gelir ve yeni hisse senedi çözülmüş olmalıdır, ya da soğuk HBSS yıkama etkili örnek HiHS kaldırmak vermedi . </li><li> 4 dakika için 200 g doku parçaları santrifüjleyin. </li><li> Tüpün alt kısmında yaklaşık 50-100 ul sıvı bırakarak, Pasteur pipeti ile süpernatantı. </li><li> Pelet gevşetmek için tüp hafifçe Flick, sonra 5 ml sıcak HBSS ekleyerek hücrelerin yıkayın. Oda sıcaklığında 2 dakika dinlendiriniz. </li><li> 5 dakika için 200 gr santrifüjleyin. </li><li> Tüpün alt kısmında yaklaşık 50-100 ul sıvı bırakarak, Pasteur pipeti ile süpernatantı. </li><li> Tüp yavaşça pelet gevşetin ve kısmen hücreleri tekrar süspansiyon Flick. Daha sonra 2 ml sıcak HBSS ekleyin. </li><li> Küçük (yarı çap) yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti hücreleri yavaş yavaş 4-6 kez ve aşağı yukarı pipetleme ayırmak. Kabarcıkları yapmaktan kaçının ve tüpün kenarına sıvı pipetle. Aşırı çiğnemek etmeyin. </li><li> Yavaş yavaş 3-4 kez ve aşağı yukarı pipetleme hücreleri ayırmak küçük yangın parlatılmış cam Pasteur pipet kullanın. Kabarcıkları yapmaktan kaçının ve tüpün kenarına sıvı pipetle. Aşırı çiğnemek etmeyin. Kaba diseksiyonları doku için, ayrışma sonunda tüpe 1 ml sıcak HBSS ekstra bir ekleyin. Hücrelerin dissociating, tüm hücre kümeleri ve agrega ayırmak gerekli değildir. Yukarı ve aşağı pipetleme durdurun ya da daha fazla pipetleme hücre agrega boyutu daha fazla azalma görürseniz küçük çaplı bir Pasteur pipeti . </li><li> Kalan herhangi bir doku parçaları tüp içinde 1 dakika dinlendiriniz. Bu hücreler yeni bir tüpe transfer için gerekli değildir. </li><li> 20 ul hücre süspansiyonu ve tripan mavi 5 ul ekleyin. Bir haemocytometer hücreleri saymak. Nöronlar tripan mavisi dışlama ≥% 95 uygulanabilir olmalıdır. </li><li> Neurobasal Kaplama Medya nöronların (aşağıya bakınız Tarifler) Levha. <ul><li> Izole nöronların (düşük yoğunluklu kültürler birbiriyle örtüşen veya topaklanma nöronlar önlemek için) elde etmek için önerilen kaplama yoğunlukları: </li><li> 120 000 - 180 000 hücre / 6 plaka </li><li> 60 000 - 75 000 hücre / 12 plaka </li></ul></li><li> 16-18 saat sonra, (aşağıda Tarifler) Neurobasal Büyüme Medya ortamı değiştirmek Medya değişen kültür çanak medya aspire bir vakum pompası kullanmayın; hafifçe bir pipet kullanın. Bu nöronlar yerinden oynatmamaya önler. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Dört saat sonra kaplama, nöronlar poli-L-lisin (PLL) kaplı yüzey uyulması gerekirdi. Faz kontrast aydınlatma altında, yapıştırılır hücre gövdeleri genellikle nispeten düz ve oval şekilli (Şekil 2a). Iyi yapışmış hücreler çanak tarafında çok hafifçe vurdu zaman hafifçe hareket küre gibi görünür. Birçok faktör potansiyel olarak (tartışma) hücre yapışmasını engelleyebilir. In vitro olarak 30 saat sonra, en fazla nöron, gözle görülür bir büyüme konisi (Şekil 2c, d) bir akson genişletmiştir . Kötü aksonal büyüme görülürse Neurobasal Büyüme Medya taze orta ve besin takviyeleri ile yapılmış olduğunu doğrulayın. Nöronlar, bu koşullarda en az 6 gün süreyle sağlıklı kalır. Bu prosedür nöronlar ~% 90 DCC (Yam ve ark 2009) ifade ile, güvenilir, yüksek commissural nöronlarda zenginleştirilmiş hazırlıkları verim kanıtlamıştır. Hücre süspansiyonu hazırlamak için kullanılan dorsal spinal kord şerit genişliği, ince şeritler kullanılmaktadır daha fazla saflıkta, kültürünün saflığını etkileyecektir. Örnek bir uygulama Şekil 3 (immünofloresan) gösterilir. Yam ark makalesine bakın. Daha fazla örnek için (2009). <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig1tmb.jpg" border="0" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 omurilik diseksiyonu adımları Şemalar. D = Dorsal, V = Ventral <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1773/1773fig1.jpg">daha büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.</a> <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 izole commissural Temsilcisi sonucunöronlar bir PLL kaplı cam lamel kaplamalı. a, b) 4 saat sonra kaplama, nöronlar yüzeye yapıştırılır. Bar = 20 mikron. c, d) 30 saat sonra kaplama, nöronlar, gözle görülür bir büyüme koni ile bir akson uzatıldı. Bar = 20 mikron. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 commissural nöron Phalloidin (F-aktin, kırmızı) ve DAPI (mavi) çekirdeği etiketli F-aktin, gama-tubulin (yeşil) immunohistokimyasal. Tarifler ve yorumlar Neurobasal Kaplama Media <ul><li> Neurobasal </li><li> % 10 Isı inaktive FBS (HiFBS) </li><li> 2 mM L-glutamin (200 mM stok solüsyonu) İsteğe bağlı: Penisilin / Streptomisin antibiyotik (yarısı normal konsantrasyon kullanmak) </li></ul> Neurobasal Büyüme Ortamı <ul><li> Neurobasal </li><li> B27 (1 / 50 dilüsyon stok) </li><li> 2 mM L-glutamin (200 mM stok solüsyonu) </li><li> İsteğe bağlı: Penisilin / Streptomisin antibiyotik (yarısı normal konsantrasyon kullanmak) Medya yapıldıktan sonra, iki hafta süreyle 4 ° C'de muhafaza edilebilir. Hücre, doku kültürü Petri kutularına medya ve doku kültürü inkübatör yer kaplama en az 1,5 saat önce, sıcaklık ve medya pH dengelenmesi için . </li></ul> Neurobasal Neurobasal orta bir şişe açıldıktan sonra, bir ay boyunca, 4 tutulmalıdır ° C karanlıkta. , Aksi halde hücre sağkalım daha düşük olacaktır bir aydan fazla açılmıştır Neurobasal atın. Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (HiFBS) veya at serumu (HiHS) 56 ısı inaktive FBS veya HS, ısı ° C su banyosunda 30 dakika. Swirl şişe yaklaşık olarak her 10 dakika kadar. Isı-inaktive FBS çökeltileri temizlemek için santrifüj gerekebilir (doğruluk yerleştirin. Bu noktada zamanlama başlayın. Şişe su, 56 ° C ulaşıldığında görmek için bir termometre, su ile dolu benzer büyüklükteki bir şişe kullanın) ve -20 ° C'de aliquoted ve tekrar dondurulmuş olabilir L-Glutamine Her zaman her bir deney için L-glutamin taze bir kısım Çözülme. B27 B27 Alikot 20 ° C Uzun süreli depolama ya da 4 ° C ile bir ay kadar saklanabilir.

<ol><li>Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. , 113-1111 (2003).</li>
<li>Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+ipsilateral+retinal+ganglion+cell+axons+at+the+optic+chiasm+requires+the+Shh+Receptor+Boc%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc.</a> Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).</li>
<li>Helms, A. W., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitors+of+dorsal+commissural+interneurons+are+defined+by+MATH1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression.</a> Development. 125, 919-928 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boc+is+a+receptor+for+sonic+hedgehog+in+the+guidance+of+commissural+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons.</a> Nature. 444, 369-373 (2006).</li>
<li>Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+guides+axons+through+a+noncanonical%2C+Src-family-kinase-dependent+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway.</a> Neuron. 62, 349-362 (2009).</li>
</ol>

Biz embriyonik sıçan omurilik commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem tanımlanmıştır. Bu prosedür, laboratuvarda rutin olarak güvenilir bir akson rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları çalışma nöronların hazırlamak için kullanılır olmuştur. Hücre biyolojisi ve immünokimyanın deneyler, bir çöp diseksiyonu için yeterli nöron üretir. Daha fazla hücreler ihtiyaç olduğunda, birçok biyokimya deneyler, iki litre diseksiyonu gibi gerekli olabilir. Eğitimli bir kişi için, teşrih ve ~ 20 embriyoların ayrılma...

Embriyonik sıçan dorsal spinal kord diseksiyonu (Tablo ayrıca görüyorum) <ul><li> E13 sıçan gebelik aşamalı </li><li> Etanol 70% </li><li> Cerrahi makas, Güzel Bilim Araçları </li><li> Forseps, Dumont # 5 Güzel Bilim Araçları </li><li> Petri kutularına </li><li> L-15 orta </li><li> Diseksiyon mikroskobu, Leica </li><li> Plastik transferi pipetler </li><li> Microscissors, Güzel Bilim Araçları </li><li> Tungsten iğne ve pim sahipleri (kanca şeklinde bir iğne, bir L-şekilleri iğne, bir düz iğne), İnce Bilim Araçları </li><li> Isı ile inaktive At Serum (HiHS) </li><li> 15 ml plastik tüpler </li></ul> Commissural nöron kültürü (Tablo ayrıca bkz.) <ul><li> Doku kültürü inkübatörler (37 ° C,% 5 CO 2, nem kontrollü) </li><li> Alman Desag lamelleri cam ve / veya plastik doku kültürü yemekleri </li><li> Poli-L-lizin, Sigma </li><li> Steril milliQ H 2 O </li><li> Neurobasal, Invitrogen </li><li> Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (HiFBS) </li><li> L-Glutamine </li><li> B27, Invitrogen </li><li> Penisilin / Streptomisin antibiyotik </li><li> 37 ° C su banyosunda </li><li> Steril Pasteur Pipetler </li><li> Bunsen gaz yazıcı </li><li> HBSS, Ca 2 + Mg / 2 + ücretsiz, Invitrogen </li><li> DNAz, Worthington </li><li> MgSO 4 </li><li> Santrifüj </li><li> Hemasitometre </li><li> Tripan Mavi Çözümü </li></ul>

embriyonik omurilik commissural nöronlar diseksiyon ve kültür

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural nöronların yaygın, embriyonik omurilik gelişim sırasında akson rehberliği altında yatan mekanizmaları araştırmak için kullanılmaktadır. Bu nöronların hücre gövdeleri dorsal omurilik bulunur ve aksonlar embriyonik gelişim sırasında kalıplaşmış yörüngeleri takip. Commissural aksonlar ilk Taban doğru ventral proje. Orta hatta geçtikten sonra, bu aksonlar, beyin tarafına doğru anteriora ve proje çevirin. Bu adımların her biri birkaç rehberlik ipuçlarının eylem tarafından düzenlenir. Commissural nöronlar yüksek oranda zenginleştirilmiş Kültürler ideal dönüm deneyleri, immünokimyanın ve biyokimya da dahil olmak üzere, akson yol bulma mekanizmaları, birçok deneyler için uygundur. Burada, E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem açıklanmaktadır. İlk olarak, omurilik, izole edilir ve dorsal şeritler disseke vardır. Dorsal doku trypsinization ve mekanik bozulması hücre süspansiyonu sonra ayrışmış. Nöronlar, poli-L-lizin kaplı cam lamelleri veya doku kültürü yemekleri üzerine kaplanmıştır. 30 saat sonra<em&gt; In vitro</em&gt; En nöronların akson uzatıldı. Kültür saflık (Yam<em&gt; Ve ark.</em&gt; 2009), tipik olarak% 90 üzerinde, commissural nöron belirteçlerinin DCC, LH2 ve tag1 (Helms ve Johnson, 1998) ile immunolabeling tarafından değerlendirilir olabilir. Bu nöronal hazırlanması için yararlı bir araçtır.<em&gt; In vitro</em&gt; Hücresel ve moleküler mekanizmaları omurilik gelişimi sırasında commissural akson büyüme ve rehberlik çalışmalar.

Bu video E13 sıçan dorsal spinal kord commissural nöronlar incelemek ve kültürüne bir yöntem gösteriyor. Disosiye commissural nöronların akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için yararlıdır.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Komissüral nöronlar, embriyonik omurilik gelişimi sırasında akson yönlemesinin altında yatan mekanizmaları araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Hücre gövdeleri ...

Bu video, embriyonik spinal korddan komişoral nöronların diseksiyonu ve kültürü için bir yöntemi göstermektedir. Prosedür, E 13 sıçan embriyolarının toplanması ve ardından spinal kordların diseksiyonla çıkarılmasıyla başlar. Diseksiyon sırasında, spinal kordlar roof plate boyunca açılır ve "açık kitap" konfigürasyonunda hazırlanır.Dorsal doku şeritleri diseke edilir ve bir tüpe toplanır. Dorsal doku, tripsin ve mekanik parçalama yoluyla tek hücreli bir süspansiyona dönüştürülür. Ardından komissüral nöronlar, polilizin kaplı cam lameller veya doku kültürü kapları üzerinde kültüre edilir.Ardından bunlar, akson büyümesinin ve yönlendirmesinin hücresel ve moleküler mekanizmalarını incelemek için kullanılabilirler. Merhaba, ben Montreal Klinik Araştırma Enstitüsü'ndeki Sinirsel Gelişimin Moleküler Biyolojisi Laboratuvarı'ndan Sebastian. Merhaba, ben de Sinirsel Gelişimin Moleküler Biyolojisi Laboratuvarı'ndan Steve Moen.Bugün sizlere, embriyonik omurilikten komissural nöronların diseksiyonu ve kültüre edilmesi prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, akson yöneliminin hücresel ve moleküler mekanizmalarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Bugün, diseksiyon boyunca L 15 ortamı içeren bir kapta tutulan, yeni toplanmış E 13 sıçan embriyolarından spinal kordlar diseke edilecektir. Embriyoların ve solüsyonların buz üzerinde tutulması önemlidir. Tüm diseksiyon adımlarında, spinal kordun tamamen sağlam bir şekilde izole edilmesini engelleyebileceği için onun gereğinden fazla gerilmemesinin kritik olduğunu unutmayın.Bir diseksiyon mikroskobu altında, embriyoyu tüm ekstra embriyonik dokulardan ve embriyonik membranlardan ayırın. Ardından bir embriyoyu diseksiyon kabına yerleştirin. Burada gösterilen açılardan baş ve posterior kısımları kesip çıkarmak için mikro makas kullanın.Bu işlem, omuriliğe kolayca erişebilmek için embriyonun konumlandırılmasına yardımcı olacak düz bir yüzey oluşturacaktır. Embriyoyu, anterior kısmı karşıya bakacak şekilde ventral tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Embriyoyu bir taraftan sıkıca sabitlemek için pens kullanın.Forcepsleri sıkıştırmayın veya bırakmayın, aksi takdirde ikinci forseps çiftiyle doku yırtılacaktır. Omuriliğin yanındaki deriyi kavrayın. Tutucu forsepslerin uçlarını hafifçe oynatın.Omuriliği saran meningesleri ortaya çıkarmak için embriyonun sırtını kaplayan deriyi soyun ve omuriliğin sağındaki dokuyu kısmen ayırın. Tutucu pensin bulunduğu seviyeden başlayarak dokuyu dürtmek için kapalı pens kullanın. Omuriliğe temas etmeden ona mümkün olduğunca yakınlaşın.Omurilik boyunca birkaç kez tekrarlayın. Bu işlem bazı dorsal kök ganglionlarını ekleyecek ve ventral organları bozacaktır. Anterior uçtan başlayarak, anterior ve posterior uçlarda bir miktar doku bırakın.Meningesleri kesmek ve spinal kordu roof plate boyunca açmak için kanca şeklinde bir tungsten iğne kullanın. Embriyoyu 180 derece döndürün ve aynı yöntemi kullanarak dokuyu kalan taraftan ayırın.Ardından, spinal kordun sol tarafındaki, başlangıçta sağda olan ve daha önce bozulmuş olan taraftaki dokuyu tamamen ayırın, spinal kordu yan yatırın ve kalan mezenkimal dokunun ve dorsal kök ganglionlarının çoğunu uzaklaştırmak için pens kullanın. Meningeslerden kısa bir flebi soyarak açmak için pens kullanın. Bu aşamada, meningesler ve spinal kord, sandviç şeklinde iki doku tabakası halindedir.Omuriliğin anterior uçtaki daha büyük kısmını sabitlemek için pens kullanın. İki ayrılmış segmenti pensle tutun ve meningesleri soyun. Pürüzsüz ve sabit bir hareketle ilerleyin; düzensiz soyma işlemi meninges tabakasının ve/veya omuriliğin kopmasına neden olabilir.Çekme işlemi sırasında meninges tabakası yırtılırsa, meningeslere yapışık kalan omurilik kısmı genellikle kurtarılamaz; ancak bu durum bazen mümkün olabilir. Daha fazla embriyo ile işlem yapmadan önce, izole edilen omuriliği plastik bir pipet kullanarak buz üzerinde, %10 ısı ile inaktive edilmiş at serumu içeren L 15 ortamı bulunan bir kaba nazikçe aktarın.Embriyoyu soğuk tutmak ve doku bütünlüğünü korumaya yardımcı olmak için diseksiyon kabındaki besiyerini soğutulmuş L 15 ile değiştirmeyi unutmayın. Dorsal omurilik diseksiyonlarına geçmeden önce tüm embriyolardan omurilikleri hasat edin. Dorsal kord diseksiyonuna başlamak için, taze izole edilmiş bir omuriliği, %10 ısı ile aktive edilmiş at serumu içeren L 15 bulunan bir Petri kabına yerleştirin.Arka beynin bir kısmını içeren daha geniş ön bölümü kesin. Ardından omuriliği düz bir şekilde yatırın ve açık bir kitap gibi yayın. Omuriliğin açık kitap şeklindeki yapısının en lateral kısımlarında yer alan dorsal dokuyu, düz bir tungsten iğne ile sabitleyerek L şeklinde bir tungsten iğne yardımıyla omuriliğin bir yarısının genişliğinin yaklaşık beşte biri kadar bir şerit halinde kesin; daha geniş şeritler kesmek verimi artıracak ancak kültürün saflığını azaltacaktır.Birden fazla dorsal şeridi, %10 at serumu içeren L 15 medyumlu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü buz üzerine yerleştirin. Prosedürün geri kalanı doku kültürü kabininin yakınında veya içinde gerçekleştirilecektir. Bu kültürler için, çözeltilerin ve ekipmanların önceden, genellikle diseksiyondan önce hazırlanması önemlidir.Tasyon adımı, biri orijinal boyutun yarısı çapında ve diğeri biraz daha küçük olan iki farklı boyutta ateşle cilalanmış pasta pipetleri kullanır. Başlamadan önce, pipetlerin içine medium aspire ederek ve 30 saniye bekleterek iki ateşle cilalanmış pipeti serum içeren medium ile kaplayın. Bu işlem, tasyon sırasında cama yapışan hücre sayısını azaltacaktır.Sırt şeritlerinin tüpün dibine çöktüğünü doğrulayarak başlayın. Laminer akışlı kabin altında, SUP yüzen kısmının çoğunu düz bir pipetle uzaklaştırın. Üç mililitre soğuk, magnezyum ve kalsiyum içermeyen HBSS ile hızlıca yıkayın.Dorsal nöral tüp şeridinin iki dakika boyunca çökmesini bekleyin. Ardından, HBSS'yi pipetle uzaklaştırın. Hacmi 4,7 mililitreye tamamlayın.Sıcak HBSS ile, nihai konsantrasyon %0,15 Trypsin olacak şekilde 0,3 mililitre %2,5 trypsin ekleyin ve nazikçe karıştırıp 37 °C su banyosunda yedi dakika inkübe edin. İnkübasyonun ortasında bir kez nazikçe karıştırın. İnkübasyon süresi dolduğunda, nihai konsantrasyonu mililitre başına 150 ünite olacak şekilde DNAs ve nihai konsantrasyonu %0,15 olacak şekilde magnezyum sülfat ekleyip kısa süreli karıştırın.Dorsal nöral tüp kesitleri artık parçalanmış olmalıdır. Doku parçalarını 200 G'de dört dakika boyunca santrifüjleyin. Tüpün dibinde yaklaşık 50 ila 100 µL sıvı bırakacak şekilde SUP süpernatantını bir pipet yardımıyla uzaklaştırın.Pelleti gevşetmek için tüpü hafifçe sallayın. Ardından, beş mililitre ılık HBSS ekleyerek hücreleri yıkayın. Hücrelerin oda sıcaklığında iki dakika boyunca çökmesini bekleyin.Hücreleri tekrar çöktürün ve yıkayın. Bu kez, iki mililitre sıcak HBSS içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri yavaşça dört ila altı kez pipetleyerek tritüre etmek için yarım çaplı alevle cilalanmış bir pipet kullanın; hücre ölümünü azaltmak için daha büyük kümeleri parçalamak amacıyla sıvıyı tüpün kenarına doğru pipetleyin.Kabarcık oluşumundan kaçının ve aşırı pipetleme yapmayın. Hücreleri daha fazla ayrıştırmak için en küçük alevle cilalanmış cam pastör pipeti kullanarak, aynı şekilde yavaşça üç veya dört kez yukarı aşağı pipetleme yapın. Ölü hücreler ve döküntülerden agregatlar oluşma eğiliminde olduğundan, tüm hücre kümelerini ayrıştırmaya gerek yoktur.Herhangi bir doku fragmanının çökmesi için bir dakika bekleyin. Ardından, hemo soter cihazında sayım için süspansiyon halindeki hücreleri içermesi gereken SUP üst fazından 20 µL alın; nöronlar, tripan mavisi boyama plakası ile en az %95 canlı olmalıdır. Nöronları, uygulamanız için uygun bir konsantrasyonda nörobazal ekim medyasına aktarın.16 ila 18 saat sonra, nöronların yerinden çıkmasını önlemek için besiyerini nöral bazal büyüme besiyeri ile değiştirin. Besiyerini, vakum pompasıyla aspire etmek yerine bir pipet yardımıyla nazikçe uzaklaştırın. İşte PLL kaplı cam lameller üzerine ekilen izole komissural nöronların temsilci sonuçları; nöronlar, ekimden 4 saat sonra yüzeye yapışmış durumdadır ve ekimden sonra 30 saat geçmiştir.Çoğu nöron, görünür bir büyüme konisine sahip uzatılmış aksonlara sahiptir. Bu nöronlar, immünofloresan deneylerinde kolaylıkla kullanılabilir. Bu örnekte, mikrotübüller yeşil, aktin kırmızı ve NA mavi renkle işaretlenmiştir.Embriyonik omuriliklerden komissural nöronların nasıl diseke edileceğini ve kültüre edileceğini gösterdik. Bu prosedürü uygularken, komissural nöronların saflığının, diseke edilen dorsal şeridin kalınlığına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

dissection-culture-commissural-neurons-from-embryonic-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu testte commissural aksonların yeniden yönlendirmek için bir sinyal molekülü yeteneği, burada kemik morfogenetik protein 7 (BMP7) değerlendirir. Embriyonik dorsal spinal kord bir eksplant COS hücreleri salgılayan aday büyüme faktörleri toplu bir komşu kültür. Eksplant içinde büyüyen Nokia'nın commissural aksonlar immünohistokimya ile görüntülendi.

Embriyonik Spinal Commissural Aksonlar yönünü difüze Sinyal Molekülleri yeteneği Assaying

Biz civciv E4 statoacoustic ganglion ve E6 omurilik eksplantlar incelemek ve kültürüne nasıl gösterilmektedir. Eksplantlarındaki 24 saat için 3D kollajen jel serum serbest koşullar altında kültüre. Neurite yanıt büyüme faktörü desteği orta ve protein kaplı boncuklar ile test edilir.

Diseksiyon ve Chick Statoacoustic Ganglion ve Kollajen Jeller Omurilik eksplantlar Kültür Neurite akıbet Tahliller

Video, transgenik bir fare embriyosundan okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların izolasyonunu göstermektedir. Embriyo, kolay görselleştirme ve tanımlama için yeşil bir floresan proteini (GFP) ile etiketlenmiş motor nöronları eksprese eder. Motor nöronlar bir floresan mikroskobu altında cerrahi olarak izole edilir ve bir kültür ortamında tutulur.

Bir Fare Embriyosundan Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyonu ve Kültürü

Dilim kültürleri gen ve farmakolojik tedirginliklerin tarafından embriyo gelişiminin manipülasyonu kolaylaştırır. Ancak, kültür koşullarının normal gelişim dilim azalır ortamında devam edebilirsiniz emin olmalısınız. Biz en az 24 saat süreyle devam etmek omurilikteki normalde gelişimi kolaylaştıran bir protokol göstermektedir.

Tavuk embriyo Omurilik Dilim Kültür Protokolü

Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Zemin plakası, omurilik gelişmekte atalarıdır yayılabilir sinyalleri veren ve ayırt nöronların önemli bir yapıdır. Biz, zemin plakası klimalı ortam üretmek için taze omurilik dokusu uygulamak için, ve biyokimya ile ilgi proteinler üzerinde sonuçlarını değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Zemin Plaka yayımlanan Sinyalleri fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için klimalı ortamda İzole Zemin Plaka Doku ve Üretim Kültürü

Lamprey tam omurilik hasarı sonrası lokomosyonu kurtarmak. Ancak, bazı spinal çıkıntı nöronlar iyi rejeneratörler ve diğerleri değildir. Bu kağıt tam omurilik kesilerde üreten ve in situ hibridizasyon için Wholemount beyinleri ve omurilik hazırlama, konut deniz taşemen larvaları (ve son zamanlarda dönüştürülmüş yetişkinler) için teknikleri göstermektedir.

Sonradan wholemount için komple Omurilik Yaralanmalı ve Beyin Diseksiyon Protokolü<em&gt; Yerinde</em&gt; Larva Deniz taşemen içinde Hibritleşme

Hücre kültürü modelleri çevre koşulları üzerinde ayrıntılı kontrol sağlar ve böylece nöronal hücre biyolojisi sayısız yönlerini aydınlatmak için güçlü bir platform sağlar. Biz civciv embriyolardan duyusal nöronlar, izole ayırmak ve kültür bir, hızlı, ucuz ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Katmanlarından hazırlanması ve immunositokimya detayları da sağlanmıştır.

Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür

Burada in vitro propriyospinal bağlantıları işlevsel rejenerasyonu çalışma çoklu elektrot dizileri üzerinde kültürlü omurilik dilimleri dayanan bir protokol mevcut.

Çok elektrot Dizileri Yetiştirilen Organotipik Omurilik Co-kültürler Fonksiyonel Rejenerasyon incelenmesi

Bu çalışma, WT yenidoğan farelerinden nöronların izole edilmesi için bir teknik sunmaktadır. Yenidoğan faresinden omuriliğin dikkatli bir şekilde parçalanmasını ve bunu takiben nöronların omurilik dokusundan mekanik ve enzimatik bölünme yoluyla ayrılmasını gerektirir.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

Bu çalışma, primer okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların homojen hücre kültürlerini ortaya çıkarmak için bir protokol sunmaktadır. Bu kültürler, oküler ve spinal motor nöronların morfolojik, hücresel, moleküler ve elektrofizyolojik özelliklerinin karşılaştırmalı analizleri için kullanılabilir.

Prenatal Islmn'den Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyon ve Kültürü :GFP Transgenik Fareler

Öğrenin E13 sıçan embriyolarından komissüral nöronların diseksiyon ve kültür yöntemini. Bu teknik, akson büyümesi ve yönlendirmesinin hücresel mekanizmalarını incelemek için kullanılır.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Daha fazla video keşfet