Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Bu yazıda, yeni izole edilmiş insan bronş segmentlerinden insan bronşiyal epitel hücrelerinin büyümesi ve genişlemesi için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, kodlama ve kaşıma, yüz milimetrelik kültür plakaları, bronş dokusunun tamiri, eksplan bronş dokusu nakilleri, insan bronş epitel hücrelerinin siliyer olarak büyümesi, insan bronş epitel hücrelerinin transwelller üzerine geçişi olmak üzere beş bölümden oluşmaktadır. Başlamadan önce, tüm adımların biyolojik güvenlik kabininde yapıldığını unutmayın.

Aksi belirtilmedikçe, lütfen malzemeler, reaktifler ve hazırlama bölümünü okuyun ve uygun şekilde hazırlandığınızdan emin olun. Aşağıdaki kodlama, stok çözelti kültürü, ortam Ayrışma çözümleri, Kaplama ve çizik. Yüz milimetre kültür plakaları bst'de yapılmalıdır.

Her şeyi steril tutun. Steril yüz milimetre kültür plakalarını ve kaplama solüsyonunu yerleştirin. BST pipetinde, plakanın tabanını kaplamak için iki değirmen kaplama çözeltisi ve yüz milimetrelik plaka döner.

Kaplama solüsyonunun plakanın tabanını eşit şekilde kapladığından emin olun. Kalan çözeltiyi pipetleyin ve ikinci yüz milimetrelik bir plakayı kaplamak için kullanın. Gerektiği kadar çok tabak için tekrarlayın.

İhtiyaç duyulan plak sayısı, doku eksplantlarının sayısına göre değişir. Kaplama solüsyonunun plakaların tabanını eşit şekilde kapladığından emin olun. gösterildiği gibi.

Plakaları kapakları ile örtün. Plakaların inkübatörde bir ila iki saat kurumasına izin verin ve kullanmadan önce erişim solüsyonunu aspire edin Bronşiyal doku açıklaması için. Kullanılmayan kaplanmış kültür plakaları steril bir torbaya yerleştirilebilir ve daha sonra kullanılmak üzere dört santigrat derecede saklanabilir.

% 70 etanol içeren püskürtülerek temiz, küçük, keskin makas, neşter ve forseps kullanın ve plaka başına en az dört tane derin küçük XS oluşturmak için neşter ile sıkıca bastırarak BSC çizik kaplı plakalara getirin. Çizik yeterince derin değilse, doku parçaları Şırıngalara yerleşmeyecek ve BSC'nin dışına çıkacaktır, dokuyu bir P üç tabağına yerleştirin. İzole edilmiş insan bronş dokusunu Bss out'ta iyice durulayın.

Bronş parçalarını açın. Dokuyu BS'ye getirin ve DM EM jambon F 12 artı% 1 antibiyotik anti mikotik olarak adlandırılan steril bir yüz milimetre doku kültürü plakasına aktarın. Dokuyu iki ila üç milimetre küp parçalar halinde kesmek için keskin küçük makası kullanın.

Forseps ile her X'in ortasına bir parça kesilmiş doku yerleştirin ve bastırın. Doku parçalarının veya X eksplantlarının birkaç saniye boyunca plakaya yapışmasına izin verin. Ve sonra yavaşça 10 mil tam ortam ekleyin Doku yüzerse Ortam ekledikten sonra, dokuyu X'in sırtlarına itmek için forseps kullanın veya çıkıntılar yeterince derin değilse yeni X'ler yapmak için yeni bir X.It gerekebilir.

Plakaları inkübatöre yerleştirin ve her üç ila dört günde bir ortamı değiştirin, dokular nakledilmeye hazırdır. Dokuların etrafında bir ila iki santimetrelik alanları kaplayacak kadar yeterli epitel hücresi büyüdüğünde, bu yaklaşık dört hafta sürer. Yüz milimetre kaplamalı ve çizik plakalar kullanın.

Çünkü bazı doku ekspliyonu başarılı olmayabilir. Plaka sayısı, kaç parça doku naklettiğinize bağlıdır. Daha önce kaplanmış ve dört santigrat derecede saklanmış plakalar kullanıyorsanız, kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin Forseps kullanarak orijinal plakadan dikkatlice doku alın ve yeni plakada eksenin ortasına yerleştirin ve hafifçe bastırın.

Dokunun plakaya yapışmasına izin verin. Birkaç saniye boyunca medya ekleyin ve inkübe edin. X explan için daha önce açıklanan ekleyin.

Yani her yüz milimetre doku kültürü plakası için iki mil gezi ve EDTA stok çözeltisi. Stoğu altı mil steril 0.01 molar PBS ve iki mil stok çözeltisi ile altı mil PBS'ye seyreltin, son tripsin konsantrasyonu için mil başına iki 50 mikrogram ve EDTA için mil başına yüz mikrogram. Eksplantları yeni bir plakaya taşıdıktan sonra, bir ila iki santimetre hücre halkaları olan plakalardan ortamı aspire edin.

Sekiz mil ılık seyreltilmiş damla ekleyin ve her yüz milimetrelik plakaya bir çözelti ekleyin. Ve üç ila 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatör yerleştirin. Sık sık kontrol edin.

Tripsini çok uzun süre bırakmak hücrelere zarar verir. Hücrelerin çoğunun kaldırıldığından emin olmak için plakaları mikroskop altında kontrol edin, hücreler sekiz Mils sıcaklıkta gösterildiği gibi yuvarlanacak ve ayrılacaktır. EDT'yi bir çözelti olarak etkisiz hale getirmek için plaka başına ortamda% 10 FBS.

Tüm plakaların hacimlerini tek bir tüpte veya farklı dokuların ayrı tüplerinde birleştirin. Beş dakika boyunca yüz G'de bir Hema Sitometre santrifüjü kullanarak hücreleri sayın. Tüpün tabanında bir hücre peleti oluşacak ve hücre peletini tam ortamda istenen hücre konsantrasyonuna yeniden süspanse edecektir.

Her iki ila 3 milyon hücreyi T 75 şişesi başına yerleştirin ve gerektiği gibi eksiksiz ortam ekleyin. Ortamı kuluçkaya yatırın ve değiştirin. Her üç ila dört haftada bir, hücreler D 75 şişelerinde alt birleşime kadar büyür.

Yaklaşık dört hafta içinde, hücreler kaldırılmalı ve genişletilmeli veya sene'yi önlemek için alt birleşimde kullanılmalıdır. Transwell'lerin geçirgen membranlarını hazırlamakla başlayın. 24 kuyulu çoklu kuyu plakasına uyan 6,5 milimetrelik ekleri kullanın.

Zarın her iki tarafına da orta ekleyin. Altta altı mil ve üstte 0.1 mil işaret edin. Hücre kültürü inkübatöründe bir saat inkübe edin.

Ortamı zarın her iki tarafından dikkatlice çıkarın. Önce bazal hacimden dikkatli bir şekilde başlamak, zarın kolayca zarar görebileceği anlamına gelir. Bu nedenle, ortamı kültür ekinin yan tarafına pipetleyin, önerilen hacmi kullanın.

Bunu yapmamak, ortamın diğer kuyucuklara tohum hücrelerine sızmasına neden olur. Geçirgen desteğin ön inkübasyonundan sonra, hücre süspansiyonunuzu, zarın destansı tarafına 0,1 mil hücre süspansiyonunda 6,5 milimetrelik kuyular için zarın destansı tarafına dikkatlice pipetleyin. Pipet 0.6 M, zarın bazal tarafında orta.

Hücreleri 10 gün boyunca epik ve bazal taraflardan besleyin. İyi farklılaşmış bir kültür alışverişi oluşturmak için, haftada iki kez orta. Gösterilen yöntemi kullanarak, bazal hacmi çıkarın.

İlk olarak, epik hacmi değiştirin, zarın bazal tarafına 0.6 mil orta ekleyin. Bu yöntem, hücrenin zara bağlanmasını teşvik eder ve hücrelerin uzun süre havaya maruz kalmasını önler. Medyayı hızlı bir şekilde değiştirin ve bir kuluçka makinesini geri koyun.

AAL ortamını çıkararak ve zarın bazal tarafındaki 0,6 mil ortamı değiştirerek 10. günde bir hava sıvısı arayüzü oluşturun. Hücreleri altı hafta boyunca hava sıvı arayüzünde tutun, medyayı haftada iki kez değiştirin. Kirpikli hücreler, kulağın oluşturulmasından dört hafta sonra ortaya çıkmaya başlayacaktır.

Sıvı arayüz. Hücreler, kirpikli hücrelere düzgün farklılaşma elde edecektir. Kulak sıvısı arayüzünün oluşturulmasından altı hafta sonra.

Explan ve transplantasyonlardan sağlıklı epitel hücrelerine sahip insan bronşiyal segmentleri. Çalışmamızda, bronş dokusunun ekplansından başarılı kültürler dokuz dokudan sekizinde gerçekleşmiştir. Eksplan kültürlerden biri enfekte olduğunda, epitel hücrelerinin halkaları üç ila dört hafta içinde bir ila iki santimetre yarıçapına ulaştı.

Başarılı X explan, altı defaya kadar tekrar kültürlendi. Tüm başarılı kültürler, nakillerin başlamasından sonraki 48 saat içinde hücre göçünün kanıtını gösterir veya B hücrelerinde gösterildiği gibi X explan, B'de gösterildiği gibi bu epitel hücreleri için belirgin bir parke taşı görünümüne sahiptir.Ve sonraki şekillerde, eksplandan hücrelerin sitozin preparatlarının immüno boyaması ve örtü fişleri üzerine ekilen hücreler, tüm hücrelerin epitel spesifik sitokeratin için pozitif olduğunu ortaya çıkardı, insan alt kültür bronş hücreleri, alt birleşim ve T 75 şişeleri burada gösterilmiştir. Arnavut kaldırımı görünümüne dikkat edin.

İnsan subkültür bronşiyal hücreleri, kerin için tek tip pozitif immün boyama gösterdi ve E.Can him immünostaining, diğer hücre tiplerine karşı spesifik antikorlarla kültürlerin fibroblastlar, mezenkimal veya endotel hücreleri tarafından kontaminasyonuna dair herhangi bir belirti göstermedi. Daha fazla ayrıntı için, lütfen burada gösterildiği gibi kirpikli epitele farklılaşmış geçirgen polyester membranlar veya transwelller veya sıvı arayüzlü transwelller üzerinde kültürlenen metin hücrelerindeki şekil beşe ve açıklamasına bakın, hücreleri ve onlarınkini atın veya gösterildiği gibi farklı bir morfolojiye sahip hücreler varsa nakiller Burada Görünmeye başlar. Bu protokolde, primer insan bronşiyal epitel hücrelerinin kültürü ve genişletilmesi için ayrıntılı yöntemler sunduk.

İnsan akciğer hastalığı mekanizmalarının önemli yolaklarının belirlenmesi ve yeni ilacın toksisitesi ve farmakolojik taraması için insan hücresi temelli çalışmalara ihtiyaç vardır. Burada açıklanan yöntemlerin, insan bronşiyal epitel hücrelerini eksplantlardan kültürlemenizi ve bu hücreleri çalışma sistemlerinizde kullanmanızı teşvik edeceğini umuyoruz. Teşekkür ederim ve iyi şanslar.