Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

Bitki hücre duvarlarının matris polisakkarit bileşiminin ve kristalin selüloz içeriğinin belirlenmesi, çeşitli ekstraksiyonlara tabi tutulan kurutulmuş bitki materyali ile başlar. Elde edilen materyal sadece hücre duvarlarından oluşur ve daha sonra matris polisakkarit bileşimini belirlemek için bölünür. Duvar malzemesi, esas olarak hemo selülozlar olan kristal olmayan polisakkaritleri monosakkaritlerine hidrolize etmek için zayıf bir asit ile muamele edilir.

Monosakkaritler daha sonra karşılık gelen uçucu aldol asetatlarına türetilir, bunlar daha sonra kristalli selülozun belirlenmesi için bir kütle spektrometresine bağlı gaz kromatografisi ile analiz edilir ve miktarı belirlenir. İçerik duvarları, kristal olmayan duvar bileşenlerini sıyıran bir asit karışımı olan grafik reaktifi ile işlenir. Kalan kristalli selüloz, metrik olarak chole olarak test edilebilen monomer glikozuna indirgenir.

Lignin içeriğinin ve bileşiminin belirlenmesi, Bitki Hücre Duvarlarının Kapsamlı Bileşimsel Analizi, Birinci Lignin bölümü başlıklı başka bir J video yayınında gösterilmiştir. Merhaba, ben Marcus Pauley, Michigan Eyalet Üniversitesi'ndeki Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi'ndeki Wall analitik tesisinin başkanıyım. Ben Cliff Foster, Hücre Duvarı Analitik tesisinin müdürüyüm.

Bugün size, çeşitli Homo selülozlarda selüloz olan bitki hücre duvarı malzemesinde bulunan polisakkaritlerin bileşimini nasıl belirleyeceğinizi göstereceğiz. Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi'nde, bu şekerleri biyoyakıtlara dönüştürmek için teknoloji geliştiriyoruz. Optimal bir bitki hammaddesi belirlemek için, öncelikle bu biyokütlede bulunan şekerlerin türünü ve bolluğunu değerlendirmemiz gerekir.

Bitki Hücre Duvarlarının Kapsamlı Bileşimsel Analizi, birinci bölüm Lignin başlıklı başka bir videoda, polifenol analizine odaklanacağız. Öyleyse başlayalım. Bu işleme hücre duvarlarını izole ederek başlayın.

Yaklaşık 60 ila 70 miligram kurutulmuş bitki materyalini 5,5 milimetre paslanmaz çelik bilyelerle iki mil SAR TED vidalı kapaklı bir tüpte öğütün. Yüksek verimli bir alternatif olarak bir REM değirmeni kullanarak, birinci bölümde açıklandığı gibi göz duvarı olarak adlandırılan bir öğütme ve dağıtma robotu kullanın. Taşlama işlemi tamamlandığında çelik bilyeleri çıkarın.

Birinci bölümde gösterildiği ve beraberindeki yazılı protokolde açıklandığı gibi hücre duvarlarını izole etmeye ve kalıntı nişastayı çıkarmaya devam edin. İki miligram DS nişasta hücre duvarı malzemesini iki değirmenli sarılmış bir tüpe tartın. Bu görevi yerine getirmenin yüksek verimli bir yolu, göz duvarı robotudur.

Robot, öğütülmüş bitki materyali içeren bir tüp alır ve tüpün dibine bir delik açar. Delinmiş tüp daha sonra bir VI besleyiciye yerleştirilir. Boş bir tüp bir teraziye yerleştirilir ve titreşim yoluyla VI besleyicinin altına kaydırılır, malzeme yüklenen üst borudaki delikten süzülür ve istenen miktarda malzeme birikene kadar boş alt boruya

Dahili standart olarak 100 mikrogram asetol ekleyin. Tüpün altındaki hücre duvarı malzemesini toplamak için tüp duvarlarını asetonla durulayın ve asetonu hava akışı altında çok nazikçe buharlaştırın. Ardından, zayıf asit hidrolizi gerçekleştirin.

Her numuneye dikkatlice 250 mikrolitre iki molar trikloroasetik asit veya TFA ekleyin ve tüp duvarlarına hiçbir malzeme sıçramadığından emin olun. Tüpleri sıkıca kapatın ve 121 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda 90 dakika inkübe edin. Daha sonra ısıtma bloklarını ve numuneleri buz üzerinde soğutun ve tüpleri 10.000 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin.

Matris polisakkaritin çözünmüş şekerlerini içeren asidik süpernatanın 100 mikrolitresini, pelet malzemesini rahatsız etmemeye dikkat ederek vidalı kapaklı şişelere aktarın. Pelet, kristalin selüloz tahlili için kullanılabilir. TFA'yı bir buharlaştırma cihazında yumuşak bir hava akımı altında bir cam tüp içinde buharlaştırın.

Fazla asit girdabını gidermek ve 25 santigrat derecede buharlaştırmak için 300 mikrolitre iki propanol ekleyin. Toplam üç kez tekrarlayın. Monosakkaritlerin gaz kromatografisi ile tanımlanmasını sağlamak için bir aldol asetat türevizasyonu gerçekleştirin.

İlk olarak, monosakkaritleri karşılık gelen açık halka aldollerine indirgeyin, bunlar daha sonra asetillenir. Ayrıntılı talimatlar için ekteki yazılı protokole bakın. Prosedürün her adımı, daha önce gösterilen protokolü, bir hava akımı altında reaktif inkübasyon buharlaştırmasının eklenmesini ve ardından çeşitli yıkama adımları ile fazla reaktifin uzaklaştırılmasını takip eder.

Son adımlarda, aldol asetatları ekstrakte edilir. İlk önce 500 mikrolitre etil asetat ekleyin ve hafifçe döndürün. Daha sonra iki mil su ekleyin, tüpleri kapatın ve girdap, tüpleri 2000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin, üstte Al Dettol asetat içeren etil asetat ve alt pipette su bulunan net ayrı katmanlar elde edin, 50 mikrolitre etil asetat tabakasını, GC şişesine 100 mikrolitre aseton ekleyerek seyreltin, GC şişelerine ekler ile GCMS şişelerine yerleştirin ve GC şişesi dört santigrat derecede saklanabilir.

GCMS analizi hemen devam etmezse, numuneleri dörtlü kütle spektrometresi ile donatılmış bir gaz kroma fotoğrafçısına enjekte edin. Koşunun sütunu ve ayrıntıları için lütfen ekteki yazılı protokole bakın. Kristalin selüloz içeriğinin belirlenmesi için başlangıç malzemesi, asit muamelesinden hemen sonra veya depolanabilir kurutulmuş formda, izole edilmiş hücre duvarı malzemesi veya halihazırda zayıf asit TFA ile muamele edilmiş duvar malzemesi olabilir.

Daha önce gösterildiği gibi fazla TFA'yı izo propanol ile çıkardıktan sonra, asetik asit, nitrik asit ve sudan oluşan bir M kadar degra reaktifi tüpe iki M sardaki TFA peletine ekleyin, sekiz ila bir ila iki hacim / hacim oranı ekleyin. Tüpü sıkıca kapatın, girdap yapın ve 30 dakika boyunca 100 santigrat derecede bir ısıtma bloğunda ısıtın. Bu işlemin bir sonucu olarak, pelette sadece kristalli selüloz kalır.

Diğer tüm polisakkaritler, buz üzerindeki blokta oda sıcaklığına veya daha soğuk olana kadar hidrolize edilmiş soğuk numunelerdir. Daha sonra numuneleri santrifüjlemeden sonra 15 dakika boyunca 10.000 RPM'de santrifüjleyin, peletin bozulmadığından ve peletten hiçbir malzemenin çıkarılmadığından emin olarak süpernatanı atın. Bu amaçla, tüpte yaklaşık 150 mikrolitre süpernatan bırakın, peleti birkaç kez suyla yıkayın.

Daha sonra, kristal ve selüloz peletini tamamen glikoza hidrolize etmek için konsantre sülfürik asit ile aynı ve hidrolizi gerçekleştirin. Sarta tüpüne 175 mikrolitre% 72 sülfürik asit ekleyerek başlayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İlk inkübasyondan sonra, numuneyi girdaplayın ve 15 dakika daha inkübe edin.

Daha sonra 825 mikrolitre su ve girdap ekleyin ve numuneleri beş dakika boyunca 10.000 RPM'de santrifüjleyin. Glikoz süpernatantın içindeyken tüpte kalan çoğunlukla lignin olmak üzere bazı kahverengi ve çözünür materyaller olabilir. Süpernatantın glikoz içeriği, Kolormetrik anton testi kullanılarak test edilir.

Bu test, 96 oyuklu bir polistiren mikrotitre plakasında gerçekleştirilir. Ekteki yazılı protokoldeki talimatları izleyerek bir glikoz standart eğrisini iki kez onarın. Her numunenin 10 mikrolitresini, supernat ve 90 mikrolitre suyu, 200 mikrolitre taze hazırlanmış ve atılmış reaktif ekleyerek standart cila ile aynı mikrotitre plakasının ayrı kuyularına birleştirerek numuneleri hazırlayın.

Ardından, plakayı alüminyum ısı yayıcılı bir fırında 80 derecede 30 dakika ısıtın. Isıtma tamamlandığında glikoz içeren numunelerin sarıdan maviye yeşile döndüğünü gözlemleyin. Plakayı oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve iyice çalkalayın.

Bir mikrotitre plaka okuyucu kullanarak 625 nanometrede absorpsiyonu okuyun. Selülozun yapı taşı olan glikoz içeriği, aynı plaka üzerinde oluşturulan standart eğriye kıyasla absorbansa dayalı olarak hesaplanır. İşte bir kavak ağacı parçasının polisakkarit analizinin bazı temsili sonuçları.

Gaz kromatogram tepe noktaları, kütle profilleri ve/veya standartların alıkonma süreleri ile tanımlanır. Monosakkaritler, standart eğrilere göre ölçülür. Matris polisakkaritlerinin şeker analizi, hemi selüloz ksam'ı temsil eden yüksek miktarda ksiloz gösterir, ancak başka şekerler de mevcuttur.

Yapılan analizlere göre kavak malzemesinin %40'ı kristal ve selülozdan oluşmaktadır. Lütfen bu içeriklerin ve bileşimlerin bitkiden bitkiye veya farklı bitki anatomileri arasında değişebileceğini unutmayın. Polifenol lignin analizi için lignano selülozik biyokütlenin polisakkarit içeriğinin ve bileşim analizinin nasıl belirleneceğini size az önce gösterdik.

Birinci bölüme geçin. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.