Name: Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Öğrenin, bitki hücre duvarlarından matris polisakkaritleri ve kristal selülozu zayıf asit hidrolizi ve GC-MS kullanarak nicelendirin. Bu yöntem, biyoyakıt hammaddesi optimizasyonu için biyokütle kompozisyon analizinde araştırmacılara yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz mükemmel teknik servis ve John Ralph, University of Wisconsin için değerli tavsiyeler, tartışmalar ve kavak ahşap örnek Matthew Robert Weatherhead için minnettarız. Bu çalışma, Kimya Bilimleri, Yerbilimleri ve Biosciences Bölümü, Temel Enerji Bilimler, Fen Dairesi, ABD Enerji Bakanlığı (ödül hayır. DE-FG02-91ER20021) ve ABD Enerji Departmanı (DOE) tarafından Büyük Göller Dairesi tarafından finanse edildi Biyoenerji Araştırma Merkezi (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494).

1. Hücre duvar izolasyonu <ol><li> eziyet kabaca 60-70mg hava veya retschmill (1 dak, 25 Hz) kullanarak bir 2ml Sarstedt vidalı kapaklı tüp 5.5 mm paslanmaz çelik bilya ile kurutulmuş bitki materyali dondurmak. Bir alternatif, yüksek verimli bir taşlama ve robot olarak adlandırılan iWall dağıtım Part I 3 açıklanmıştır . </li><li> hücre duvarı izolasyon prosedürü ile devam etmeden önce çelik topları kaldırmak Hücre duvar malzemesi hazırlanması ayrıntılı protokol Part I 3 gösterilir. Protokol yazılı adımları burada tamlığı için. </li><li> 1.5 ml,% 70 sulu etanol ve iyice vorteks eklemek </li><li> pelet için 10 dakika alkol çözünmeyen kalıntı 10.000 rpm'de santrifüj </li><li> süpernatantı süzün veya aspirat </li><li> kalıntı kloroform / metanol (1:1 v / v) solüsyonu 1.5 ml ekleyin ve iyice tüp sallamak pelet tekrar süspansiyon </li><li> 10 dakika 10.000 rpm'de santrifüj ve supernatant süzün veya aspirat </li><li> aseton 500 ul tekrar süspansiyon pelet </li><li> 35 yaşında bir hava akışı ile solvent buharlaşması ° C kuruyana kadar Gerekli kurutulmuş örnekleri daha fazla işlem kadar oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> Örnek 1,5 ml 0,1 M sodiumacetate tampon pH 5.0 yeniden askıya pelet nişasta kaldırılması başlatmak için. </li><li> 20 dakika Sarstedt boru ve ısı kap. 80 ° C ısıtma bloğu. </li><li> buz üzerinde süspansiyon serin </li><li> pelet için aşağıdaki maddeler eklemek: 35 0.01% Sodiumazide ul (NaN 3), 35 ul Amilaz (50 μg/1mL H 2 O; Bacillus türleri, SIGMA), 17 ul Pullulanase (18.7 adet basil acidopullulyticus; SIGMA) . Ve iyice vorteks tüp kap. </li><li> Süspansiyon 37 gece boyunca inkübe ° C çalkalayıcı. Tüpler yönlendirmek yatay yardımcıları karışım geliştirdi. </li><li> ısı süspansiyon 100 ° C sindirim sonlandırmak için bir ısıtma bloğu 10 dk. </li><li> santrifüj (10.000 rpm, 10 dakika) ve atın supernatant içeren çözünür nişasta </li><li> 1.5 ml su ekleyerek karıştırın, centriguation ve çamaşır suyu şişeden kalan pelet üç kez yıkayın. </li><li> aseton 500 ul tekrar süspansiyon pelet </li><li> kuruyana kadar hava akımı 35 ° C ile solvent buharlaşır. Daha iyi kurutma için bir spatula ile tüp içindeki malzemeyi kırmak için de gerekli olabilir. Kurumuş malzeme izole hücre duvarı (lignocellulosics) sunar. Gerekli kurutulmuş örnekleri daha fazla işlem kadar oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol> 2. Matrix Polisakarid kompozisyon Bu yöntem, özünde Albersheim 1 tarafından yayımlanan yöntemi bir değişiklik. <ol><li> Duvar malzemesi monosakkarit kompozisyonunu belirlemek için, elle veya iWall, bir robot taşlama ve tartım robotu kullanarak highthroughput moda ya 2ml starstedt tüpler içine hücre duvar malzemesi 2 mg ağırlığındadır. </li><li> , Bir internal standart olarak bir İnositol solüsyonu (5mg/ml) 20 uL ekleyin. 2 mg hücre duvarı örnek için 100 ug eklemek için önerilir. </li><li> tüpün alt hücre duvarı malzeme toplamak için tüp duvarları 250 ul aseton ile temizleyin, durulayın ve aseton çok hafif hava akımı altında buharlaşması. </li><li> Zayıf asit hidrolizi için her numune 2M trifloroasetik asit (TFA) 250 ul ekleyin. Hiçbir malzeme tüp duvarlarına sıçrayan sağlamak için dikkatle TFA ekleyin. </li><li> sıkı kapağı ve 121 90 dakika boyunca inkübe ° C ısıtma bloğu. </li><li> ısıtma blokları ve örnekler buz üzerinde soğutun. </li><li> Tüpleri 10 dakika 10.000 rpm'de santrifüj. </li><li> pelet malzeme rahatsız değil emin olun bir bardak vidalı kapaklı şişeleri monosakkarit elde edilen matris polisakkarit içeren asidik süpernatant 100 ul aktarın. Pelet (3) aşağıdaki kristalin selüloz tayini için kullanılan </li><li> hafif bir hava akımı altında bir buharlaştırma cihazı, cam tüp içinde TFA buharlaşır. </li><li> 300 ul 2-Propanol, girdap ve buharlaşması 25 ° C (toplam üç kez tekrar) </li><li> Alditol asetat türevlendirme prosedürün ilk adımı, bunlara karşılık gelen alditols Monosakkaritler bir azalma yapmaktır. Bu amaçla her kurutulmuş örnek bir çözüm sodyum bor hidrür, 200 ul ekleyin. Taze bir çözüm her zaman başına 1M Amonyum hidroksit 1 ml sodyum bor hidrür 10mg kullanarak hazırlayın. </li><li> Cam şişe, 1,5 saat boyunca oda sıcaklığında terk </li><li> 150 ul buzul asetik asit ekleyerek çözüm nötralize </li><li> 25 girdap ve buharlaşması ° C. </li><li> 250 ul asetik asit / Metanol (01:09 v / v), girdap ve 25 buharlaşmaya ˚ C </li><li> (toplam üç kez tekrar) 250 ul Metanol ekleyin ve hava akışı altında buharlaşması </li><li> Alditols asetilasyonu için asetik anhidrit, 50 ul ve Pyrid 50 ul ekleyin20 dakika için 121 ine, girdap ve inkübe ° C ısıtma bloğu. </li><li> buz bloğu serin numuneler oda sıcaklığında yaklaşık için geçici azalma beklerken. </li><li> reaktifler oda sıcaklığında hafif bir hava akımı altında buharlaşır. Dikkatli olun: alditol asetatlar havai. </li><li> hava altında 200 ul Toluen ekleyin ve buharlaşması (x3) </li><li> Son adımları alditol asetatlar ayıklanır. İlk olarak, etil asetat ve hafifçe girdap 500 ul ekleyin. </li><li> 2 ml su, şapka tüpleri ve vorteks ekleyin. </li><li> net ayrı katmanlarda (etil asetat, üst alt su) elde etmek için 5 dakika için 2,000 RPM tüpler santrifüj </li><li> GC / MS ekler ile şişeleri içine etil asetat tabaka pipet 50 ul. </li><li> aseton 100 ul GC-şişe ve kapak ekleyerek sulandırmak. Örnek konsantrasyonu çok yüksek ise, örnek hacmi ve seyreltme hacim GC / MS aşırı yüklenmesini önlemek için ayarlanabilir. GC-flakon, 4 ° C, GC / MS analizi hemen devam gelmez eğer saklanabilir </li><li> Numuneleri, bir quadrupole MS ile donatılmış bir GC enjekte ama alev iyonizasyon dedektörü de uygundur. Supelco SP-2380 (30mm X 0.25mm x 0.25 mikron film kalınlığı) sütun 4min çözücü bir gecikme ve 1.5ml/min bir akış hızı ile kullanılır. Enjekte örnekleri aşağıdaki sıcaklık programına tabi tutulur: 160 İlk tutun ° C için 2 dk, 20 ° ile 200 C / dak rampa ° C ve 5 dakika boyunca tutun; 20 ° ile 245 C / dak rampa ° C ve basılı tutun 12 dakika; başak 270 ° C ve 160 ° C 2,26 ilk sıcaklık soğutma önce 5 dakika boyunca basılı tutun) Peaks kitle profilleri standartlar ve / veya alıkonma süreleriyle tanımlanır. Monosakkaritler standart eğrileri dayalı sayısal vardır. </li></ol> 3. Kristal Selüloz İçerik Bu yöntem aslında Updegraf 8 tarafından açıklanmıştır. İzole hücre duvar malzemesi (1) veya zaten 2M TFA (2.8 'e bakınız) ya kalan pelet asit tedavisi hemen sonra (2.8) veya TFA ile tedavi edildikten duvar malzemesi: Bu prosedür için başlangıç ​​materyali sayısı vardır pelet, 2-propanol ve kuru ile yıkanır olmuştur. <ol><li> Updegraff reaktif vidalı kapaklı cam tüp 1 ml (nitrik asit: su, 08:01:02 v / v asetik asit) TFA pelet ekleyin. </li><li> Kapağını sıkıca kapatın tüp 100 ısıtma bloğu, girdap ve ısı ° C de 30 dakika. Bu tedavinin bir sonucu olarak sadece kristal selüloz pelet çözünmez kalır. </li><li> Blok, oda sıcaklığında veya soğuk buz üzerinde soğutun örnekleri </li><li> 15 dakika 10.000 rpm'de santrifüj örnekleri </li><li> Pelet ve kaldırılır rahatsız pelet hiçbir malzeme olmadığı sağlamak süpernatant atın. Bu amaçla yaklaşık bırakın. 150 tüp süpernatant ul. </li><li> santrifüj sallamak, 1.5 ml su ekleyin ve yukarıda yaptığımız gibi süpernatant atın. </li><li> 1.5 ml aseton kullanarak işlem 3 kez yıkama tekrar </li><li> Hava kuru pelet hava ile çok nazik ya da geceleme bankta kurumaya bırakın </li><li> pelet (kristal selüloz) Saeman hidroliz ne denir artık tamamen glikoza hidrolize olur. Bu amaçla Sarstedt tüp 175 ul% 72 Sülfürik asit eklemek için </li><li> başka bir 15 dakika için 30 dakika, girdap ve inkübe oda sıcaklığında inkübe </li><li> 825 ul su ve vorteks eklemek </li><li> 5 dakika 10.000 rpm'de örnekleri santrifüj. Tüp içinde kalan bazı kahverengi çözünmez malzeme, lignin, olabilir. </li><li> Süpernatantı glikoz içeriği kolorimetrik anthrone assay kullanılarak denenmiştir. Bu testte 96 polistiren mikrotiter plate yapılır. </li><li> Standart eğri 1mg/ml şekeri stoku (0 ° C'de depolanan) ve 0, 2, 4, 6, 8 ve 10 ul pipetleme, 0, 2, 4, 6, 8, ve 10 ug standartları kopyasını oluşturmak için ayrı uygun bir kuyuya. Her iyi 100 ul su ile doldurun. </li><li> ayrı hücrelere ancak standart olarak aynı mikrotiter plate ul her örnek süpernatant 10 ve 90 ml su ekleyin. </li><li> taze hazırlanmış Anthrone Reaktif (Anthrone konsantre sülfürik asit, 2 mg anthrone / ml sülfürik asit içinde çözünmüş), 200 ul eklemek </li><li> 80 az 30 dakika ısı plakası ° C fırında (alüminyum ısı yayıcı). Glikoz içeren örnekler, sarı, mavi-yeşil renge çevirin. </li><li> plaka oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin ve iyice çalkalayın. </li><li> mikrotiter plate okuyucusu kullanarak 625 mm plaka emilimini okuyun. </li><li> Glikoz (ve dolayısıyla kristal selüloz içeriği) absorbans dayalı, aynı plaka üzerine kurulmuş standart eğri göre hesaplanır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Bir duvar analizi bir örnek Şekil 2'de sunulmuştur. Bu durumda kavak kök (ağaç) protokol bölümünde belirtilen çeşitli işlemler analiz edildi. Matris polysaccharide yapısı, bitki hücre duvarları tipik şeker mevcut tanımlayan bir örnek kromatogram vurgulanır, fucose, ramnoz, ksiloz, arabinoz, galaktoz, mannoz ve glikoz (ve iç standart inositol). Yüksek Xylose içeriği tarafından gösterildiği gibi, kavak başlıca hemicellulosic bileşeni Xylan. Ancak, bu şekerlerin bol miktarda hammadde used4 bağlı olarak değişecektir. Bu analizde glikoz ve amorf selüloz hemiselüloz xyloglucan türetilmiştir. Veri analizi sayesinde mol% veya ug / mg duvar malzemesi (veya kuru ağırlık) olarak sunulabilir. Kristalin selüloz içeriği kendi kendini açıklayıcı, bir duvar kuru ağırlığının% 20-50 arasında değerler bekleyebilirsiniz. Bölüm I3 ve burada sunulan sonuçlar dayanarak kavak ağacından lignocellulosic kompozisyonu% 21 lignin,% 30 hemiselüloz ve% 41 kristal selüloz. Geri kalan kül olacaktı. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: lignocellulosic analiz Genel Bakış Hücre duvarları (lignocellulosics) ham kurutulmuş bitki materyali izole edilmiştir. Duvar malzemesi, sonra alikotları içine ağırlıklı ve çeşitli deneyleri için bölünmüştür. Matrix polisakkarit kompozisyon duvar malzemesi, zayıf bir asit (2M TFA) ile tedavi alditol asetatlar elde edilen çözünür Monosakkaritler derivatizing, ve GC-MS analizi sonra kurulmuştur. Zayıf asit tedavisi kalıntı sözde Updegraff reaktif geride bırakarak sadece çözünmez crystlline selüloz ile yıkanır. Selüloz sülfürik asit çözünür ve glikoz içeriği belirleyen bir kolorimetrik yöntemi ile sayısal. Buna paralel olarak, Bölüm I 3 açıklandığı gibi lignin içeriği ve bileşimi tespit edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: kavak (Populus tremoloides) kavak ahşap Kapsamlı lignocellulosic analiz Ahşap cips açıklanan protokole tabi tutuldu. Sol üst: Matrix polisakkarit bileşimi; FUC fucose; Rha ramnoz; Ara arabinoz; Xyl ksiloz Man mannoz, galaktoz Gal GLC glikoz; inositol internal standart.

<ol><li>Albersheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+analysis+of+sugars+in+plant+cell+wall+polysaccharides+by+gas-liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.</a> Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).</li>
<li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulosic+Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellulosic Biofuels.</a> Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).</li>
<li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+%28Lignocellulosic+biomass%29%2C+Part+I%3A+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li>
<li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterisation+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar%3A+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endotransglycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biocatalysis+and+Biotransformation%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li>
<li>UPDEGRAF, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEMIMICRO+DETERMINATION+OF+CELLULOSE+IN+BIOLOGICAL+MATERIALS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS.</a> Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).</li>
</ol>

Açıklanan yöntemlerden lignocellulosic bitki biyokütle kompozisyon hızlı bir nicel değerlendirmesini sağlar. Yani matris polisakkaritler hemiselülozlar şeker kompozisyonu, kristalin selüloz içeriği de dahil olmak üzere, bu malzemelerin bileşimi belirleme yöntemi sağlar. Kişi başına düşen çeşitli analitik yöntemlerin hacmi değişir. Burada açıklanan protokolleri kullanarak, 20 örnekleri kristal selüloz içeriği için matris polisakkarit kompozisyonlar ve 30 işlenebilir. Nicel veri en uygun hammadde bitkileri doğası nedeniyle, çeşitli veya genotipler, biyoyakıt üretimi için kendi uygunluk açısından değerlendirilebilir.

<table><tbody><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>myo-İnositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum borohidrür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>Piridin</td><td>JT Baker</td><td>3348-01</td><td></td></tr><tr><td>Asetik anhidrit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Spectromax Plus 384</td><td>Molecular Devices</td><td>Plus384</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>7890A GC/5975C MSD</td><td></td></tr><tr><td>5.5mm Paslanmaz Çelik Bilyalar</td><td>Salem Ball Company</td><td>(N/A)</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyucuklu plaka ısı dağıtıcı</td><td>Biocision</td><td>Coolsink 96F</td><td></td></tr><tr><td>Retsch Değirmen</td><td>Qiagen</td><td>TissueLyser II</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma bloğu</td><td>Techne</td><td>Dri-block DB-3D</td><td></td></tr><tr><td>Numune konsantratörü</td><td>Techne</td><td>FSC400D</td><td></td></tr></tbody></table>

bitki hücre duvarları kapsamlı kompozisyonel analiz (lignocellulosic biyokütle) bölüm ii: karbonhidratlar

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Yenilenebilir, karbon nötr, sanayi ve toplum için sürdürülebilir hammadde ihtiyacını 21. yüzyıl için en önemli sorunlardan biri haline gelmiştir. Bu ulaşım için sıvı yakıtların üretimi için endüstriyel hammadde olarak bitkisel ürünlerin kullanımı ilgi başlattı.<sup&gt; 2</sup&gt; Biokompozit malzemeleri gibi ve diğer ürünler<sup&gt; 6</sup&gt;. Bitki biyokütle, gezegen üzerindeki en büyük enerji rezervlerinin biri olmaya devam ediyor<sup&gt; 4</sup&gt;. Bu daha çok enerji selüloz dahil olmak üzere zengin polimerler, çeşitli hemiselüloz ve polifenol lignin oluşan hücre duvarlarının oluşur<sup&gt; 5</sup&gt; Ve bu nedenle bazen lignocellulosics olarak adlandırılır. Ancak, bitki hücre duvarları, duvarları, tesisin tamamının gücü ve yapısal bütünlüğünü yoğun katkıda bozulmaya karşı inatçı evrildi. Için gerekli sertliğin rağmen, hücre duvarı, metabolik olarak aktif ve bitki büyüme ve farklılaşma gibi sayısız hücre faaliyetlerinde hayati roller oynamaktadır son derece dinamik bir varlıktır<sup&gt; 5</sup&gt;. Duvarları çeşitli işlevleri nedeniyle, büyük bir yapısal çeşitliliği, tek bir bitki içinde, farklı bitki türlerinin ve hücre tiplerinin duvarları içinde var<sup&gt; 4</sup&gt;. Bu nedenle, bitki türleri, bitki çeşitliliği, bitki doku biorefinery için ne bağlı olarak, kimyasal / enzimatik süreçleri ve sıvı biyoyakıtlar için çeşitli şekerler sonraki fermantasyon depolymerisation işleme adımları ayarlanabilir ve optimize edilmesi gerekir. Bu gerçek temelini oluşturan bitki biyokütle hammadde tam bir karakterizasyonu için ihtiyaç. Burada lignocellulosics bileşimi tespitine olanak sağlar ve yüksek verimlilik analizi (Şekil 1) bir orta için uygun, kapsamlı bir analitik yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem destarched hücre duvarı materyalinin hazırlanması ile başlar. Ortaya çıkan lignocellulosics sonra hemiselülozlar monosakkarit kompozisyon ve diğer matriks polysaccharides1 ve kristalin selüloz içeriği belirlemek için ayrıldı.<sup&gt; 7</sup&gt;. Lignocellulosic biyokütle lignin bileşenleri analiz etmek için protokol Bölüm tartışıldı<sup&gt; 3</sup&gt;.

Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve duvar türetilen karbonhidrat bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol.

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

Sanayi ve toplum için yenilenebilir, karbon nötr ve sürdürülebilir ham madde ihtiyacı, 21. yüzyılın en acil meselelerinden biri haline gelmiştir...

Bitki hücre duvarlarının matriks polisakkarit bileşiminin ve kristal selüloz içeriğinin belirlenmesi, çeşitli ekstraksiyon işlemlerine tabi tutulan kurutulmuş bitki materyali ile başlar. Elde edilen materyal yalnızca hücre duvarlarından oluşur ve ardından matriks polisakkarit bileşimini belirlemek için parçalara ayrılır. Duvar materyali, temel olarak hemiselülozlar olan kristal olmayan polisakkaritleri monosakkaritlerine hidroliz etmek için zayıf bir asit ile işleme tabi tutulur.Monosakkaritler daha sonra ilgili uçucu aldol asetatlarına türevlendirilir ve ardından kristal selülozun belirlenmesi için kütle spektrometresine bağlı gaz kromatografisi ile analiz edilip miktarları belirlenir. Hücre duvarları, kristal olmayan duvar bileşenlerini uzaklaştıran asit karışımı olan grafik reaktifi ile işlenir. Geriye kalan kristal selüloz, kolorimetrik olarak analiz edilebilen monomer glikoza parçalanır.Lignin içeriğinin ve bileşiminin belirlenmesi, Bitki Hücre Duvarlarının Kapsamlı Bileşim Analizi, Birinci Bölüm Lignin başlıklı başka bir J video yayınında gösterilmektedir. Merhaba, ben Marcus Pauley, Michigan Eyalet Üniversitesi'ndeki Great Lakes Bioenergy Research Center'daki Duvar Analitik Tesisinin sorumlusuyum. Ben de Hücre Duvarı Analitik Tesisi yöneticisi Cliff Foster.Bugün, çeşitli hücreli materyallerdeki selüloz içeren bitki hücre duvarı materyalinde bulunan polisakkaritlerin bileşiminin nasıl belirleneceğini göstereceğiz. Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi'nde, bu şekerleri biyoyakıtlara dönüştürecek teknolojiler geliştiriyoruz. Optimal bir bitki ham maddesini belirlemek için öncelikle bu biyokütlede bulunan şekerlerin türünü ve miktarını değerlendirmemiz gerekmektedir.Bitki Hücre Çeperlerinin Kapsamlı Kompozisyonel Analizi, birinci bölüm Lignin başlıklı diğer bir videoda, polifenol analizine odaklanacağız. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre hücre çeperlerini izole ederek başlayın.Yaklaşık 60 ila 70 miligram kurutulmuş bitki materyalini, iki mil SAR TED vidalı kapaklı tüp içinde 5,5 milimetre paslanmaz çelik bilyalarla öğütün. Yüksek kapasiteli bir alternatif olarak REM değirmen kullanırken, birinci bölümde açıklandığı üzere eyewall olarak adlandırılan bir öğütme ve dağıtma robotu kullanın. Öğütme işlemi tamamlandığında, çelik bilyaları çıkarın.Birinci bölümde gösterildiği ve beraberindeki yazılı protokolde açıklandığı gibi hücre duvarlarını izole etmeye ve kalıntı nişastayı uzaklaştırmaya devam edin. İki miligram DS nişasta hücre duvarı materyalini iki mililitrelik sared tüpüne tartın. Bu görevi gerçekleştirmenin yüksek kapasiteli bir yolu eyewall robotudur.Robot, öğütülmüş bitki materyali içeren bir tüpü alır ve tüpün altına bir delik açar. Delinen tüp daha sonra bir VI besleyiciye yerleştirilir. Boş bir tüp terazi üzerine yerleştirilir ve titreşim yoluyla VI besleyicinin altına kaydırılır; materyal, istenen miktar birikene kadar üstteki dolu tüpteki delikten süzülerek alttaki boş tüpe akar.İç standart olarak 100 micrograms aseto ekleyin. Hücre duvarı materyalini tüpün dibinde toplamak için tüp duvarlarını asetonla durulayın ve asetonu hava akışı altında çok nazikçe uçurun. Ardından, zayıf asit hidrolizi gerçekleştirin.Her bir örneğe, tüp duvarlarına herhangi bir materyalin sıçramadığından emin olarak dikkatle 250 µL iki molar trikloroasetik asit veya TFA ekleyin. Tüpleri sıkıca kapatın ve bir ısıtma bloğunda 121 °C'de 90 dakika boyunca inkübe edin. Ardından ısıtma bloklarını ve örnekleri buz üzerinde soğutun ve tüpleri 10.000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Matris polisakaritinin çözünürleştirilmiş şekerlerini içeren asidik süpernatantın 100 microliters kısmını, pelet materyalini rahatsız etmemeye dikkat ederek vidalı kapaklı viallere aktarın. Pelet, kristalin selüloz analizi için kullanılabilir. TFA'yı, bir evaporasyon cihazında, hafif bir hava akımı altında cam tüp içinde evaporate edin.Fazla asidi uzaklaştırmak için 300 µL iki propanol ekleyin, vorteksleyin ve 25 °C'de buharlaştırın. Bu işlemi toplamda üç kez tekrarlayın. Monosakkaritlerin gaz kromatografisi ile tanımlanmasını sağlamak için aldol asetat türevlendirmesi gerçekleştirin.İlk olarak, monosakkaritleri karşılık gelen açık halkalı aldollerine indirgeyin ve ardından bunları asetilleştirin. Detaylı talimatlar için ekteki yazılı protokole başvurun. Prosedürün her bir adımı; reaktif ekleme, inkübasyon, bir hava akımı altında buharlaştırma ve ardından çeşitli yıkama basamaklarıyla fazla reaktifin uzaklaştırılması şeklinde önceden gösterilen protokolü takip eder.Son aşamalarda, aldol asetatlar ekstre edilir. İlk olarak, 500 µL etil asetat ekleyin ve hafifçe çalkalayın. Ardından iki mL su ekleyin, tüplerin kapağını kapatın ve vorteksleyin; tüpleri 2000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj ederek, üstte aldol asetatları içeren etil asetat tabakasının ve altta su tabakasının bulunduğu net ayrışmış katmanlar elde edin. Etil asetat tabakasından 50 µL'yi insertli GC-MS viallerine pipetleyin; GC vialine 100 µL aseton ekleyerek seyreltin. Hazırlanan GC vialleri 4 °C'de saklanabilir.GC-MS analizi hemen gerçekleştirilmeyecekse, örnekleri kuadrupol kütle spektrometresi ile donatılmış bir gaz kromatografına enjekte edin. Kolon ve çalışma detayları için lütfen beraberindeki yazılı protokole başvurun. Kristalin selüloz içeriğinin belirlenmesi için başlangıç materyali olarak, izole edilmiş hücre duvarı materyali veya zayıf asit TFA ile önceden işlem görmüş duvar materyali (asit işleminden hemen sonra veya saklanabilir kurutulmuş formda) kullanılabilir.Daha önce gösterildiği gibi izopropanol ile fazla TFA uzaklaştırıldıktan sonra, iki M sars tüplerindeki TFA peletine; asetik asit, nitrik asit ve sudan oluşan bir M up degra reaktifini sekize bire veya ikiye bir hacim/hacim oranında ekleyin. Tüpün kapağını sıkıca kapatın, vorteksleyin ve bir ısıtma bloğunda 100 °C'de 30 dakika boyunca ısıtın. Bu işlemin sonucunda, pelette yalnızca kristalize selüloz kalır.Diğer tüm polisakkaritler hidrolize edilir; blok üzerindeki numuneler buz üzerinde oda sıcaklığına veya daha düşük bir sıcaklığa kadar soğutulur. Ardından numuneler 10, 000 RPM hızında 15 dakika boyunca santrifüj edilir; santrifüjleme işleminden sonra, peletin bozulmadığından ve peletten herhangi bir materyalin uzaklaştırılmadığından emin olarak süpernatan uzaklaştırılır. Bu amaçla, tüpte yaklaşık 150 microliters süpernatan bırakılır ve pelet su ile birkaç kez yıkanır.Ardından, kristali ve selüloz peletini tamamen glikoza hidrolize etmek için konsantre sülfürik asit ile bir hidroliz işlemi gerçekleştirin. Sarta tüpüne 175 µL %72 sülfürik asit ekleyerek başlayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İlk inkübasyonun ardından, numuneyi vorteksleyin ve 15 dakika daha inkübe edin.Ardından 825 µL su ekleyin, vortexleyin ve örnekleri 10.000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Glikoz süpernatantta yer alırken, tüpte çoğunlukla ligninden oluşan bazı kahverengi ve çözünür maddeler kalmış olabilir. Süpernatantın glikoz içeriği, Kolorimetrik anton assay yöntemiyle analiz edilir.Bu analiz, 96 kuyucuklu polistiren bir mikrotiter plakada gerçekleştirilir. Ekli yazılı protokoldeki talimatları izleyerek glikoz standart eğrisini dubleks olarak hazırlayın. Her bir örnekten 10 µL süpernatan ve 90 µL suyu, standartlarla aynı mikrotiter plakanın ayrı kuyucuklarına ekleyerek örnekleri hazırlayın; ardından 200 µL taze hazırlanmış reaktif ekleyerek işlemi tamamlayın.Ardından, plakayı alüminyum bir ısı dağıtıcı ile birlikte fırında 80 °C'de 30 dakika boyunca ısıtın. Isıtma işlemi tamamlandığında, glikoz içeren örneklerin sarıdan mavi-yeşile döndüğünü gözlemleyin. Plakanın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve iyice çalkalayın.Bir mikroplaka okuyucu kullanarak 625 nanometredeki absorbansı ölçün. Selülozun yapı taşı olan glukoz içeriği, aynı plaka üzerinde oluşturulan standart eğri ile karşılaştırılan absorbansa göre hesaplanır. Burada, bir kavak ağacı parçasının polisakkarit analizine ait bazı temsili sonuçlar yer almaktadır.Gaz kromatogramı pikleri, kütle profilleri ve/veya standartların alıkonma süreleri ile tanımlanır. Monosakkaritler, standart eğrilere göre kantifiye edilir. Matris polisakkaritlerinin şeker analizi, hemiselülozu temsil eden yüksek miktarda ksiloz olduğunu göstermektedir, ancak diğer şekerler de mevcuttur.Analize göre, kavak materyalinin %40'ı kristal ve selülozdan oluşmaktadır. Bu içeriklerin ve bileşimlerin bitkiden bitkiye veya farklı bitki anatomileri arasında değişiklik gösterebileceğini lütfen unutmayın. Polifenol ligninin analizi için lignoselülozik biyokütlenin polisakkarit içeriğinin nasıl belirleneceğini ve bileşim analizinin nasıl yapılacağını göstermiş olduk.Birinci bölüme göz atın. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

comprehensive-compositional-analysis-plant-cell-walls-lignocellulosic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitki biyokütle, biyoyakıt üretimi için kullanılan olabilir önemli bir karbon-nötr yenilenebilir bir kaynaktır. Bitki biyokütle esas hücre duvarları, lignocellulosics olarak adlandırılan bir kompleks yapılara sahip kompozit malzemeden oluşmaktadır. Burada içerik ve polifenolik lignin bileşimi kapsamlı bir analiz için bir protokol açıklar.

Bitki Hücre Duvarları kapsamlı Kompozisyonel Analizi (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm I: Lignin

Bir ekstrasellüler matriks polisakkaritlerin yapısına anlayışlar kazanmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Yöntemi dakika miktarda malzeme analiz edilmesi için izin kütle spektrometresi glycosylhydrolases özgüllüğü ve duyarlılığı yararlanır. Bu teknikte doku kendisini doğrudan kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

Etiket lignin bitki hücre duvarlarında görselleştirme ve farklı dokuları, numune veya türlerin lignification karşılaştırılması sağladığını konfokal Raman mikroskobu dayalı bir yöntem sunulmaktadır.

Etiket- In situ</emBitki Hücre Duvarlar Lignification> Görüntüleme

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Bu araştırmanın amacı, tabaka-katman nanocellulose fibrillerin montaj ve seyreltik sulu süspansiyonlar monte izole edilmiş lignin kullanılan sentetik bitki hücre duvarı doku oluşturmaktır. Kuartz kristali mikro-ve atomik kuvvet mikroskopisi yüzey ölçüm teknikleri, polimer-polimer nanokompozit materyalin oluşumunu izlemek için kullanıldı.

Nanocellulose, Lignin Fabrikasyon Serbest duran Filmler ve Sentetik polikatiyon: Biomimicking Wood Doğru

Bir çift sarmallı RNA girişimi (dsRNAi) tekniği mısır sinamoil koenzim alt bitki lignin içeriğine A redüktaz (ZmCCR1) geni aşağı regüle etmek için kullanılır. Lignin hücre duvarından aşağı-regülasyon mikroskopik analiz ile görselleştirilmiştir ve Klason yöntemi ile ölçülür. Yarı selüloz ve kristalin selüloz içinde Bileşim değişiklikler analiz edilmiştir.

Lignin Aşağı düzenleme<em&gt; Zea mays</em&gt; DsRNAi ve Klason Lignin Analizi ile

Bitki hücre duvarı yapısı ve kimyası özellikleri, biyoyakıtlar ve biyo-malzemeler için ideal hammaddeleri belirlemek için değerlendirilir. Standart yöntemlerin büyük veri kümelerine uygulandığında sınırlamaları vardır. Bu yüksek verimli ön arıtma, enzim sakarifikasyonu ve piroliz-moleküler ışın kütle spektrometresi yöntemleri, çok sayıda biyokütle örneğini düşük deney süresi ve maliyeti ile karşılaştırır.

Toplam Lignin, lignin Monomer ve enzimatik Şeker Yayın: Lignocellulosic Biyokütle rekalsitrantların Varyasyonları yüksek verimlilik Taraması

Bu protokol, bitki hücre duvarlarındaki lignin, selüloz ve hemiselülozun Raman görüntüleme ve çok değişkenli analizi kullanılarak görselleştirilmesi için genel bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır.

Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi

Bir iletişim kuralı tarafından mannan örnek olarak kullanarak Jel Elektroforez (AKPM), polisakkaritler yapısal analizi için tanımlanır.

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

13C,15N etiketli mantar ve bitki örnekleri çok boyutlu solid-state NMR spektroskopisi ve dinamik nükleer polarizasyon (DNP) araştırmalar için hazırlanması için bir protokol sunulmuştur.

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

Updegraff yöntemi selüloz tahmini için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu gösterimin temel amacı, bitki biyokütle örneklerinde selüloz içeriğinin tahmini için ayrıntılı bir Updegraff protokolü sağlamaktır.

Updegraff Yöntemi Kullanılarak Bitki Biyokütlesinin Kristal Selüloz İçeriğinin Tahmini

Öğrenin, bitki hücre duvarlarından matris polisakkaritleri ve kristal selülozu zayıf asit hidrolizi ve GC-MS kullanarak nicelendirin. Bu yöntem, biyoyakıt hammaddesi optimizasyonu için biyokütle kompozisyon analizinde araştırmacılara yardımcı olur.

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

Daha fazla video keşfet