Name: Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-25T16:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Keşfedin MamAΔ41 proteininin M. magneticum AMB-1'den saflaştırma protokolünü. Afinite, iyon değişim ve boyut dışlama kromatografisi kullanarak manyetozom ilişkili proteinlerin yapı ve fonksiyonlarını inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz, onların tavsiyelerini ve yorumlar için verdiği destek ve Geula Davidov, Noam Grimberg ve Chen Guttman Dr. Amir Aharoni kabul etmiş sayılırsınız.

1. E. Mama Gen Klonlama ve İfade coli 5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 've 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3' mutant gen mamAΔ41 primerler Magnetospirillum magneticum AMB-1 genomik DNA polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edildi. Çoğaltılan DNA parçaları, bir NcoI sitesinde başlatma kodon ATG sunuldu ve fesih kodon bir ScoI site ile değiştirilir. Parçaları NcoI ve Sacl ile sindirilir ve pET52b ilgili siteler (+) klonlanmış pET52bMamAΔ41-AMB1 sebebiyet veren. Bu yapı, mamAΔ41 gen-C-terminalindeki 10-tag ile çerçeve içinde erimiş oldu. Plazmid, E. coli suşu BL21 içine electroporated oldu. E. coli pET52bMamAΔ41 barındıran BL21 (15), oto-indüksiyon 3 saat ampisilin (50 mg / ml), 310 ° K içeren orta yetiştirilen süzün . Ekimi sıcaklığı 310 ° 'den 300 ° K, 300 ° K. kaydırılır ve ek bir 48 saat süreyle devam edildi Hücreleri 277 az 10 dak ° K. 5465g santrifüj tarafından toplandı 8 litre kültür ıslak hücre pelet 60 gram üretti. 2. Biyoinformatik Hesaplamalar ProtParam sunucusu (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html) kullanarak molekül ağırlığı (MW), amino asitler sırasına göre ve 280nm protein, 1mg/1ml öngörülen emme Hesaplamalar . 10His-Tag-MamAΔ41 için 22529 MW Da (240 amino asitler) ve MamAΔ41 (Trombin tarafından O'nun etiketi kaldırma sonra kalan 9 amino asitler) Mw 20596.5Da (187 amino asitler). 10His-Tag-MamAΔ41 için protein 280nm 1mg/1ml tahmin emme 0,595 ve 0,579 MamAΔ41 için. Buna ek olarak, amino asit dizisi, bir sistein kalıntıları içermez. Bu nedenle, indirgeyici ajanlar arıtma işlemi sırasında gerekli değildir. 3. MamAΔ41, saflaştırılması <ol><li> Stok solüsyonu hazırlanması için, tartmak ve aşağıdaki konsantrasyonlarda (200 ml) hazırlayın: imidazol (MW 228,2 g / mol) 4M çözümü, NaCl (Mw 58,44 g / mol) 5M çözüm, Tris-HCl (Mw 121.3 g / mol ) 1M çözelti, pH = 8 ayarlayın. Çözüm netleşene kadar bir girdap kullanarak çift distile su (DDW) ve karışımı ekleyin. 0.22μm oda sıcaklığında tutmak filtre ve filtre çözümleri. </li><li> Hazırlayın ve stok solüsyonları (Tablo 1) 6 taze tamponlar filtre. </li><li> Seyreltilir ve tampon 1:2 oranını, hücre gram tampon hacmi (ml) hücreler askıya. </li><li> DNaz I (1 mg / ml) bakteriler her 10gr için örnek DNA parçaları kırmak için 10μl ekleyin. EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyl bakterilerin her 20gr için 1 ml ekleyin. 20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Fransız basını, iki kür 25.000 psi hücreleri bozulur. Sonication aksine, Fransız basını, ince bir borudan yüksek basınç altında hücreleri zorlayarak yüksek hacimli (&gt; 10 ml) hücre ekstrüzyon hedeflenmektedir. Piston sıcaklık birikimi nedeniyle kullanım ve montaj önce on dakika boyunca buz üzerinde soğutulmalıdır. </li><li> 25ml ultrasantrifüjdeki tüpler içine parçalanmış hücreleri transferi ve örnek tüp boyun hattı ulaşıncaya kadar tampon A (50mg) tam denge. </li><li> 277, 1 saat süreyle 270.000 g Ultra santrifüj ayrı hücre artıkları ° K </li><li> 4 ml% 20 etanol konserveler Ni NTA reçine, sütun üzerine ekleyerek ev yapımı bir ağırlık Ni NTA sütun (2.5cm çap) hazırlayın. Tamamen sıvı bırakalım, daha sonra 40 ml DDW ile yıkayın ve tamamen sıvı bırakalım. 40 ml tampon A. sütun öncesi dengelenmiş reçine </li><li> Yerçekimi Ni NTA sütun üzerinde ultra santrifüj tüpleri çözünebilir fraksiyon uygulayın. Akış yoluyla toplamak (bağlantısı çözülmüş proteinler) ve 277K az korumak, sıvı bırakalım. </li><li> Pelet hurda küçük bir ipucu kullanarak ultra santrifüj tüpleri pelet örnek toplayın. 50μl 5% 2X β-merkaptoetanol SDS-PAGE örnek tampon ucu karıştırın. </li><li> 100 ml tampon B. sütun akış yoluyla toplamak ve 277K az korumak, sıvı bırakalım yıkayın. </li><li> 15 işaretli Eppendorf tüpleri (1.5ml) hazırlayın. </li><li> Elüsyon - yakın sütun vana ve sonra sütun üzerine tampon C 1ml yük, 3 dakika supap açılma ve flow-through toplama takip boyunca inkübe. Bu adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> Zehir geri kalanını askıya alma 1 ml tampon C artışlarla ve vanasını kapatın. </li><li> Kesirler 280nm az OD ölçün ve protein zirve konumunu değerlendirmek, OD hala&gt; 0.3 ise, ek örnekler ihtiyaç vardır. </li><li> Toplanan fraksiyonları SDS-PAGE analizi. Böyle bir analiz, aşağıdaki örnekleri ile de yapılmalıdır bağlanmamış proteinler, flow-through-through akış yıkayın ve uLTRA santrifüj pelet örnek. 10μl 5% 2X SDS-PAGE örnek tampon β-mercaptoethanol her örnekten 10μl karıştırın. % 15 SDS-PAGE numuneleri yükleyin ve 180 Volt 45 dakika çalıştırın. </li><li> InstantBlue çözüm 15 ml jel Lekesi, 1 saat süreyle çalkalayın. Plastik kutu kapalı ve ışıktan korumalı olduğunu emin olun. </li><li> Jel değerlendirin; protein ekspresyonu gösterge bantlara göre, yüksek ve özel ise, seçilen yıkandı, kesirler birleştirmek. </li><li> 10-His-etiketi kaldırmak için, kombine örnek için üreticinin tavsiyesine göre, sığır trombin (10 adet / ml), 1 mg protein başına 10μl trombin. </li><li> Diyaliz aşırı imidazol çıkarılması için kullanılır ve iyon değişimi bağlanma sırasında gerekli seviyeleri için NaCl konsantrasyonları azaltmak için. Diyaliz için 7 kD molekül ağırlığı, istenilen uzunlukta kesilmiş (MWCO) diyaliz tüp kesti. DDW ile yıkayın ve bir ucunu (veya klipler ile mühür) bir düğüm. Üst kısmında biraz boşluk bırakarak çanta üzerine birleştirilmiş protein çözüm transferi ve mengene. </li><li> Batmak 4 litre soğuk tampon diyaliz diyaliz tüp (Tampon D). 277 gece boyunca yavaş yavaş çözüm karıştırın ° K </li><li> Beher diyaliz tüp dışarı atın, küçük bir kesim yapmak ve tüp 50ml protein transfer. </li><li> İyon-değişim kromatografisi: Hızlı Performans Sıvı Kromatografisi (FPLC) MonoQ 4.6/100 PE sütun önceden paketlenmiş monte edin. DDW filtrelenmiş su 5 sütun hacimleri (CV) ile sütun yıkayın. Tampon D. 5 CV ile dengelenmiş sütun </li><li> DDW (iki döngü hacimleri) ile enjeksiyon döngü yıkayın ve Yük enjeksiyon döngü içinde protein tampon D. ile tekrarlayın. </li><li> Protein örneği (1 ml / dak akış hızı) enjekte edilir ve sınırsız proteinlerinin SDS-PAGE tespiti için kesirleri toplamaya başlar. </li><li> Tüm örnek sütun yükleninceye kadar, ilk protein hacmi (adım 3.23) enjeksiyon döngü daha büyükse, döngü yıkamadan, 3,25-3,26 adımları tekrarlayın. </li><li> Sınırsız proteinlerin ortadan kaldırmak için 3 CV ile tampon C sütunu yıkayın. </li><li> Tamponlar D &amp; E (% 100 tampon E degrade sonuna), akış hızı 1 ml / dk (arasında 40 2000mm NaCl 60 dakika doğrusal bir degrade, maliyeti yüksek debilerde kullanılan olmasına rağmen protein Zehir geniş hacimli, ama daha az yoğun, protein zirveleri). 280nm kromatogram göründükleri gibi proteinler doruklarına toplayın. </li><li> Temizlik öncesi dolu sütun tavsiye üretimi göre. </li><li> Toplanan fraksiyonları SDS-PAGE analizi. Böyle bir analizi aşağıdaki örnekleri ile yapılmalıdır, sınırsız proteinler akış yoluyla ve aracılığıyla protein doruklarına akış. SDS-PAGE çalıştırın ve adımları 3,17-3,18 söz leke. </li><li> Protein ön lekeli işaretine göre, tahmin edilen Mw protein bantları varlığı için jel değerlendirin. Birleştirme ilgili protein içeren seçilen elüsyon kesirler. </li><li> Boyut dışlama kromatografisi için gerekli NaCl konsantrasyonlarının azaltılması amacıyla, birleştirilmiş numunelerin Dialyze. 3,21-3,23 tampon F. karşı adım belirtildiği gibi diyaliz gerçekleştirin. </li><li> Protein örnek Konsantre bir Vivaspin-15 10.000 MWCO için 8 mg / ml 'bir tablo santrifüj, 4000 rpm. Kuvars küvet 280nm az OD ölçerek arzu konsantrasyon onaylayın. Protein çok konsantre ise tampon F sulandırmak ve tekrar ölçmek. </li><li> Boyut dışlama önceden paketlenmiş sütun, FPLC Hiload 26/60 superdex 200, birleştirin; sütun DDW filtrelenmiş su 3 CV ile yıkayın. Tampon F. 3 CV ile dengelenmiş sütun </li><li> Yük en fazla 4 ml enjeksiyon döngü içinde protein örnek enjeksiyon döngü ile aynı hacimde tampon F. takip 5ml DDW (iki döngü cilt) ile yıkayın. </li><li> Protein örneği (3.5 ml / dak akış hızı) enjekte edilir ve 280nm kromatogram göründükleri gibi proteinler zirve kesirleri toplamaya başlar. Sütun hacmi ulaşıncaya kadar tampon akışı olsun. </li><li> Tüm örnek sütun yükleninceye kadar, ilk protein hacmi (adım 3.23) enjeksiyon döngü daha büyükse, döngü yıkamadan, 3,25-3,26 adımları tekrarlayın. </li><li> Temizlik önceden paketlenmiş sütun üretimi önerisine göre. </li><li> Toplanan fraksiyonları SDS-PAGE analizi. Böyle bir analiz protein doruklarına örnekleri ile yapılmalıdır. SDS-PAGE çalıştırın ve adımları 3,17-3,18 söz leke. </li><li> Jel Değerlendirin: protein doruklarına özgü olmadığını, doğru tahmin Mw protein lekeli öncesi marker ve sadece tek bir bant göre ilgili protein yıkandı, kesirler seçili birleştirme görünür. </li><li> &gt; 20 mg / ml, bir tablo santrifüj 4000 rpm bir Vivaspin-15 10.000 MWCO kullanarak protein örnek Konsantre. 280nm az OD ölçerek arzu konsantrasyon onaylayın. Saflaştırılmış MamAΔ41 sonra kristalleşmesi için 26.5 mg / ml konsantre oldu. </li> &lt;li&gt; Matriks yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI-TOF) kullanarak örnek saflık ve protein kimlik onaylayın. <li> Her 25-50μl protein, protein, kütle spektrometresi ve SDS-PAGE göre arıtılmış ise, önceden işaretlenmiş Eppendorf tüplerine konsantre MamAΔ41 bölün. </li><li> Flash 193 ° K, sıvı azot ve mağaza donmuş </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokol doğru yapıldığında bir yüksek derecede saflaştırılmış, boyut, homojen ve konsantre protein örneklerinin almalısınız. Bu protein örneklerinin yanı sıra kristalizasyon çalışmalarda, enzim kinetiği, afinitesi ve daha fazlası gibi biyokimyasal çalışmalar, daha sonra hazır. Arıtma protokolü ana adımlar temsilcisi sonuçlar burada nitelendirdi. Ni-NTA afinite sütun elüsyon profili SDS-PAGE analizi ~ 22kDa (Şekil 1) uygun MW mediğinin ifade protein üzerinde çok açığa çıkarmalıdır. Bu SDS-PAGE analizi de flow-through sınırsız proteinler herhangi bir protein, akış ve ultra santrifüj pelet örnek yıkama en az açığa çıkarmalıdır. Uygun protein büyük bantlar bu örnekler görünür yoksa bir yanlış tampon hazırlanması, hücre parçalama veya kültür oto-indüksiyon koşulları ve büyüme sorunları sorunları göz önünde bulundurmalısınız. İyon değişim kromatografisi nikel reçine (elektrostatik etkileşimleri veya histidin / olumsuz amino asitlerden zengin protein döngüler nedeniyle) ve kesilmemiş Onun Takip edilen arzu protein bağlı diğer E.coli proteinler arasında bizim arzu edilen proteini ayırmak için önceden şekillendirilmiş. Bu sütun artan NaCl konsantrasyonları altında pozitif yüklü reçine afinitesi göre proteinler ayırır. Yüksek olumsuz ücret proteini yüksek NaCl konsantrasyonları negatif yüklü olanları orta appose Zehir. Bu sütunun avantajları yüksek akış hızı ve bağlama kapasitesi vardır. Iyon değişimi kromatogram (Şekil 2) artan NaCl konsantrasyonu 3 proteinler nüfus arasında iyi bir ayırım ortaya koymaktadır. SDS-PAGE analizi, ileri arıtma adımları gerekli olup olmadığını arzu edilen bir ve değerlendirme tecrit, her nüfus MW belirlemek amacıyla ihtiyaç duyulmaktadır. Ikinci nüfus sığır trombin tarafından parçalanır ve üçüncü nüfusun SDS-PAGE düşük konsantrasyon nedeniyle mümkün değildir değildi MamAΔ41 + Onun Tag (~ 22kDa) ise ilk nüfus MamAΔ41 (~ 20 kDa). Proteinler doruklarına açıkça ayrılmış değilseniz bir yanlış tampon hazırlık düşünün veya NaCl degrade eğimi değiştirerek. Boyut dışlama kromatografisi Ni-NTA reçine bağlı ve iyon değişimi kromatografisi sırasında ayrılmış değil diğer E.coli hücre proteinleri bizim arzu protein arasındaki ayırmak için önceden şekillendirilmiş. Bu sütun, boylarına göre proteinler ayırır. Büyük proteinler karşı büyük hacimlerde yıkandı, küçük küçük elüsyon hacimleri Zehir. Sütun kromatogram (Şekil 3), iyi bir ana nüfus olarak arzu edilen bir protein ayırma ortaya koymaktadır. Nüfus uygun monomer boyutu ~ 20 kDa MW Zehir görünür. ~ 80 kDa bandı (Ni-NTA reçine bağlar E.coli tipik protein) varlığı sütun yükleme SDS-PAGE önce tespit edilir ve bu çalışması sırasında kaybolur. Bu ~ 80 kDa protein konsantrasyonu ile başlayan düşük olduğundan, nüfus, seyreltme ve SDS-PAGE analizi, arıtma etkinliğini belirlemek için gerekli nedeniyle kromatogram görünmüyor. Biz bir kesinlikle uygun MW saf protein varlığını belirlemek için SDS-PAGE ana zirve seyreltilmiş ve konsantre bir örnek yükleme önerilir. Bu aşamada proteinin saflaştırılmış ve homojenlik MALDI-TOF tarafından değerlendirmeye tabi tutulmalıdır. Bu analiz MW 10.176 Da (Şekil 4) Mw 20347 Da ve başka bir protein saptandı. ~ 10 kDa protein ~ 20 kDa protein ücret iki katına çıkar. His-Tag kaldırma sonra kalan 9 amino asitler ile MamAΔ41 tahmin MW 20.596,5 Da edildi. Elde edilen MALDI-TOF MW karşılaştırarak bunların dışında 248 Da bulundu. Bu benzemezliği MALDI-TOF ölçüm hataları ve / veya ilk metiyonin ortak bozulması ve ikinci glisin nedeniyle neden olabilir. Sonuç olarak, proteinin yüksek derecede saflaştırılmış ve daha fazla deneyler için kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844table.jpg" alt="Tablo 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tablo 1"> Tablo 1. Tampon formülasyonlar. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Ni-NTA sütun arıtma Temsilcisi SDS-PAGE analizi, sağdan sola; P-ultra santrifüj pelet (3.11 protokol adım), W yıkama (3.12 protokol adım), U-sınırsız proteinleri (3.10 protokol adım), E - elüsyon samp beş şeritles (3.14 protokol adım), M-protein işaretleyici (sayı MW belirtiniz). Ok MamAΔ41 gösterir. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Iyon değişim kromatografisi adım (a) İyon değişimi (MonoQ sütun) kromatogram Analizi; Mavi - toplanan fraksiyonları göstergesi emme 280nm, protein konsantrasyonu, Yeşil-NaCl konsantrasyonu, Kırmızı temsil eder. (B) iyon değişimi arıtma adım Temsilcisi SDS-PAGE analizi. Soldan sağa; M-protein işaretleyici (numaraları Mw göstermektedir), A6 - ilk zirve fraksiyonu, A8-ikinci zirve fraksiyonu. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Boyut dışlama kromatografisi analizi (a) Boyutu hariç tutma (Superdex 200 sütun) kromatogram; Mavi - emilimi 280nm, protein konsantrasyonu, toplanan fraksiyonları Red göstergesi temsil eder . (B) boyut dışlama arıtma adım Temsilcisi SDS-PAGE analizi. Soldan sağa; M-protein işaretleyici (numaraları MW göstermektedir), PreI pre-enjekte örnek, ilk zirve toplanan A4-6 kombine fraksiyonu, A4-6D Seyreltilmiş fraksiyonu zirveden toplanır. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Matriks yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI-TOF) kütle spektrumu saflaştırılmış MamAΔ41. Matris Sinapic asit (SA). MamAΔ41 de gösterildiği gibi, 20.347 Da gösterilen 10.176 Da MamAΔ41 iki katına ücret türler.

<ol><li>Faivre, D., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+Bacteria+and+Magnetosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic Bacteria and Magnetosomes.</a> Chem Rev. 108, 4875-4898 (2008).</li>
<li>D'Andrea, L. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPR+proteins%3A+the+versatile+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">TPR proteins: the versatile helix.</a> Trends Biochem Sci. 28, 655-662 (2003).</li>
<li>Young, J. C., Barral, J. M., Hartl, U. lrich, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+folding%3A+localized+functions+of+cytosolic+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">More than folding: localized functions of cytosolic chaperones.</a> Trends Biochem Sci. 28, 541-547 (2003).</li>
<li>Brocard, C., Hartig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+targeting+signal+1%3A+is+it+really+a+simple+tripeptide%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peroxisome targeting signal 1: is it really a simple tripeptide?</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1565-1573 (2006).</li>
<li>Fransen, M., Amery, L., Hartig, A., Brees, C., Rabijns, A., Mannaerts, G. P., Van Veldhoven, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+PTS1-+and+Rab8b-binding+properties+of+Pex5p+and+Pex5Rp%2FTRIP8b%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of the PTS1- and Rab8b-binding properties of Pex5p and Pex5Rp/TRIP8b.</a> Biochim Biophys Acta. 1783, 864-873 (2008).</li>
<li>Baker, M. J., Frazier, A. E., Gulbis, J. M., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein-import+machinery%3A+correlating+structure+with+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein-import machinery: correlating structure with function.</a> Trends Cell Biol. 17, 456-464 (2007).</li>
<li>Mirus, O., Bionda, T., von Haeseler, A., Schleiff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+evolved+discriminators+in+the+3-TPR+domain+of+the+Toc64+family+involved+in+protein+translocation+at+the+outer+membrane+of+chloroplasts+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Model%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily evolved discriminators in the 3-TPR domain of the Toc64 family involved in protein translocation at the outer membrane of chloroplasts and mitochondria.</a> J Mol Model. 15, 971-982 (2009).</li>
<li>Gatsos, X., Perry, A. J., Anwari, K., Dolezal, P., Wolynec, P. P., Likic, V. A., Purcell, A. W., Buchanan, S. K., Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+and+outer+membrane+assembly+in+Alphaproteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein secretion and outer membrane assembly in Alphaproteobacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 32, 995-1009 (2008).</li>
<li>Tiwari, D., Singh, R. K., Goswami, K., Verma, S. K., Prakash, B., Nandicoori, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+residues+in+Mycobacterium+tuberculosis+protein+kinase+G+play+a+role+in+regulating+kinase+activity+and+survival+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host.</a> J Biol Chem. 284, 27467-27479 (2009).</li>
<li>Edqvist, P. J., Broms, J. E., Betts, H. J., Forsberg, A., Pallen, M. J., Francis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratricopeptide+repeats+in+the+type+III+secretion+chaperone%2C+LcrH%3A+their+role+in+substrate+binding+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tetratricopeptide repeats in the type III secretion chaperone, LcrH: their role in substrate binding and secretion.</a> Mol Microbiol. 59, 31-44 (2006).</li>
<li>Grunberg, K., Muller, E. C., Otto, A., Reszka, R., Linder, D., Kube, M., Reinhardt, R., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+proteomic+analysis+of+the+magnetosome+membrane+in+Magnetospirillum+gryphiswaldense%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and proteomic analysis of the magnetosome membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 1040-1050 (2004).</li>
<li>Komeili, A., Vali, H., Beveridge, T. J., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosome+vesicles+are+present+before+magnetite+formation%2C+and+MamA+is+required+for+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Magnetosome vesicles are present before magnetite formation, and MamA is required for their activation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 3839-3843 (2004).</li>
<li>Okuda, Y., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+a+magnetosome-associated+protein%2C+TPR-containing+MAM22%2C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of a magnetosome-associated protein, TPR-containing MAM22, in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 491, 169-173 (2001).</li>
<li>Taoka, A., Asada, R., Sasaki, H., Anzawa, K., Wu, L. F., Fukumori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+localizations+of+Mam22+and+Mam12+in+the+magnetosomes+of+Magnetospirillum+magnetotacticum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spatial localizations of Mam22 and Mam12 in the magnetosomes of Magnetospirillum magnetotacticum.</a> J Bacteriol. 188, 3805-3812 (2006).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li>
</ol>

Proteinlerin saflaştırılması, herhangi bir biyokimyasal proteinler ya da yapısal çalışmalar içinde önemli bir adımdır. Her protein kendi davranışları ile benzersiz olduğu için, onun özelliklerini tanımlamak ve buna göre arıtma değiştirmek gerekiyor. Protein hedef biyoinformatik araçlar kullanarak arıtma doğru bir ilk adım olarak analiz edilmelidir. Onlar, hedef iso-elektrik nokta hesaplamak için çevre ve özel iyonları / ligandlar için ihtiyacı azaltıcı / oksitleyici ihtiyacı değerlendirmek için kullanılır. Protokol hede...

<table><tbody><tr><td>French Press</td><td>Ekipman</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-078A</td><td></td></tr><tr><td>Basınç hücresi</td><td>Ekipman</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-santrifüj</td><td>Ekipman</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Discovery 90SE</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Ekipman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Ti60</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-santrifüj tüpleri; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml</td><td>Ekipman</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>BC-355618</td><td></td></tr><tr><td>2.5cm çapında, Cam Econo-Kolon Kromatografi Kolonları</td><td>Ekipman</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2521</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His Bind reçinesi</td><td>Ekipman</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>M0063428</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Ekipman</td><td>Amersham</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Kuvars küvet</td><td>Ekipman</td><td>Hellma</td><td>104-QS</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Sıvı Kromatografisi- AKTA purifier 10</td><td>Ekipman</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>İyon değişim kolonu &amp;#8211; MonoQ 4.6/100 PE</td><td>Ekipman</td><td>GE Healthcare</td><td>10025543</td><td></td></tr><tr><td>Boyut dışlama ön doldurulmuş kolonu-HiLoad 26/60 Superdex 200</td><td>Ekipman</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1071-01</td><td></td></tr><tr><td>Centricon - Vivaspin15 &amp;#8211; 10,000 MWCO</td><td>Ekipman</td><td>Sartorius AG</td><td>VS1501</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj</td><td>Ekipman</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>IEC CL30R</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Ekipman</td><td>Bruker Corporation</td><td>Reflex IV</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (hidroksimetil) aminometan</td><td>Reaktif</td><td>BioLab</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Reaktif</td><td>FRUTROM</td><td>235553470</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Reaktif</td><td>Alfa Aesar</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA içermeyen proteaz inhibitörleri kokteyli</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8849</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I (Deoksiribonükleaz I)</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Trombini</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25432</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Reaktif</td><td>BioLab</td><td>07132391</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td>Reaktif</td><td>BioLab</td><td>19822391</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Reaktif</td><td>Expedeon</td><td>1SB01L</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Ön Boyalı Protein Merdiveni</td><td>Reaktif</td><td>Fermentas</td><td>SM0671</td><td></td></tr></tbody></table>

saflaştırılması m. magneticum deformasyon amb-1 magnetosome İlişkili protein mamaΔ41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bakteri jeomanyetik alanlar boyunca kendi yolunuzu mümkün Sudaki mikroorganizmaların çeşitli bir grup oluşturmaktadır. Bu davranış uygun ortamlar için arama yardımcı olduğuna inanılıyor<em&gt; (1)</em&gt;. Bu yetenek magnetosome öngördüğü, lipid lineer bir zincir montaj oluşan bir hücre içi organel manyetit veya greigite ~ 50-nm kristal biomineralize ve içine her mümkün vezikül. Fonksiyonel veziküllerin oluşumu için gerekli olduğu gösterilmiştir magnetosome bir ilke bileşeni Mama. Mama en karakterize magnetosome ilişkili proteinlerin biridir oldukça bol magnetosome ilişkili protein<em&gt; In vivo</em&gt;<em&gt; (2-6)</em&gt;. Bu makale, Mama arıtma odaklanır çalışılan rağmen<em&gt; In vivo</em&gt; Net fonksiyonel veya yapısal ayrıntılar için tespit edilmiştir. Biyoinformatik analizi Mama, protein içeren bir tetra-tricopeptide tekrar (TPR) olduğunu ileri sürdü. TPR proteinlerin geniş bir yelpazede büyük bir kat ya da yapıcı bir parçası olarak bulunan bir yapısal motif, protein-protein etkileşimleri ve aracılık çok protein kompleksleri için bir şablon olarak hizmet vermektedir<em&gt; (7)</em&gt;. TPRs ökaryotik hücre organel süreçleri ve birçok bakteriyel yollar çok önemli görevlerde yer<em&gt; (8-14).</emMama anlamak&gt; için, protein içeren eşsiz bir TPR, bir ilk adım olarak yüksek derecede saflaştırılmış protein gereklidir. Bu makalede, istikrarlı bir Mama silme mutant (MamAΔ41) arıtma protokolü mevcut<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Mama magnetosome aktivasyonu dahil olmak gösterildi eşsiz bir Magnetosome ilişkili protein. Burada Mama silme mutant arıtma protokolü (MamAΔ41) mevcut<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Magnetotaktik bakteriler, kendilerini jeomanyetik alanlar boyunca yönlendirebilen sucul mikroorganizmalardan oluşan çeşitli bir grubu kapsar. Bu davranış...

Saflaştırma işlemi, Mame. Delta 41 rekombinant proteini eksprese eden hücre peletleri ile başlar. Hücre membranının parçalanmasını takiben çözünür ve çözünmez fraksiyonların ayrımı gerçekleştirilir. Çözünür rekombinant proteini ekstrakte etmek amacıyla, afinite kromatografisi kullanılarak etiketli rekombinant protein diğer hücresel proteinlerden ayrıştırılır.İyon değişim kromatografisi, afinite kromatografisi ve boyut dışlama sonrası geri kalan diğer hücresel proteinlerden mamma Delta 41'i ayırır. Kromatografi, mamma Delta 41'i daha da ayrıştırarak oligomerik durumunu ortaya çıkarır. Son olarak, rekombinant proteinin saflığı ve homojenliği analiz edilir.Merhaba, ben Raza, Benon University of the Negative Yaşam Bilimleri Bölümü'ndeki XVA Laboratuvarı'nın başıyım. Ben de Z Lab'dan Natalie. Bugün size rekombinant protein saflaştırma prosedürünü göstereceğiz.Laboratuvarımızda, manyetizma ile ilişkili proteinleri incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu protokolün başlangıcında, MAME Delta 41 proteini 10 histidin füzyon proteini olarak eksprese edilir.BL 21 e coli hücrelerini, Epi Brazilin içeren oto-indüksiyon besiyerinde 310 K'de üç saat boyunca büyütün. Ardından kültür sıcaklığını 300 K'ye düşürün ve hücreleri 48 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından hücreleri santrifüj ile hasat edin, süpernatantı dökün ve elde edilen hücre peletini tartın.Sekiz litre kültür, yaklaşık 60 gram ıslak hücre peleti üretmelidir. Protein saflaştırma öncesinde; 4 M NaCl, 5 M sodyum klorür ve 1 M tris-HCl pH 8 stok çözeltilerinden 200 mililitre hazırlayın.Çift distile su veya DDW kullanarak çözeltileri berraklaşana kadar vorteksleyin ve 0,22 µm filtre ile süzün. Stok çözeltileri taze olarak hazırlayıp filtreleyin ve A'dan F'ye kadar olan tamponları bu videoya eşlik eden yazılı protokolde açıklandığı şekilde süzün. Protein saflaştırmaya başlamak için, hücreleri hücre kütlesinin tampon hacmine oranının 1:2 olduğu tampon A içerisinde yeniden süspande edin.Her 10 gram bakteri için, örnekteki tüm DNA fragmanlarını sindirmek üzere 10 mikrolitre dna ekleyin. Ardından, bir serbest proteaz inhibitör kokteyli olan bir mililitre E dt ekleyin. Her 20 gram bakteri için, çözeltiyi buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.İnkübasyonun ardından, hücreleri 25,000 PSI basınçta iki döngü French press ile liz edin. Sıcaklık artışı nedeniyle, piston kullanımdan önce 10 dakika boyunca buz üzerinde soğutulmalıdır. Liz edilen hücreleri 25 millilitre ultrasantrifüj tüplerine aktarın.Tüpleri boyun çizgisine kadar tampon A ile doldurun ve hassas bir şekilde dengeleyin. Ardından, hücre döküntülerini ultrasantrifüjasyon ile ayırın. Bu sırada, 2,5 santimetrelik bir cam kolona dört mililitre nikel NTA reçinesi ekleyerek bir nikel NTA yerçekimi kolonu hazırlayın.Reçineyi, üretici talimatlarına ve S talimatlarına uygun olarak protein saflaştırması için hazırlayın. Numuneler santrifüj edildikten sonra, ultrasantrifüj tüplerindeki çözünür fraksiyonu nikel NTA kolonuna dökün. Bağlanmayan proteinleri akış fraksiyonunda toplayın.Kolonu 100 mililitre tampon B ile yıkamaya devam edin ve akışFraksiyonlarını toplayın. Akış fraksiyonlarını 277 K'de muhafaza edin. Proteini numaralandırılmış 15 adet 1,5 mililitrelik eppendorf tüpüne elüe edin. Kolon vanasını kapatın ve kolona bir mililitre tampon C yükleyin.Üç dakikalık inkübasyon süresinin ardından valfi açın ve akışı toplayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın. Üç dakikalık inkübasyon yapmadan, proteini bir mililitrelik tampon artışlarıyla elüye etmeye devam edin.Bir UV spektrofotometre kullanarak, 280 nanometredeki optik yoğunluğu ölçerek fraksiyonlardaki protein pikini belirleyin. Son olarak, toplanan fraksiyonların SDS page analizini gerçekleştirin. Bağlanmayan protein akış yolu, yıkama, akış yolu ve jelden elde edilen bir ultrasantrifüj peleti örneği analiz edilir.Hangi elüye fraksiyonların yüksek protein seviyelerine sahip olduğunu belirleyin ve seçilen fraksiyonları birleştirin. His etiketi olan 10'u uzaklaştırmak için, birleştirilmiş örneğe miligram başına 10 µL sığır trombini ekleyin. Ardından, fazla imidazolü uzaklaştırmak ve sodyum klorür konsantrasyonunu düşürmek için örneği tampon D ile diyalize edin.İyon değişim kromatografisi hazırlığı için, yedi kilodalton moleküler ağırlık kesim noktalı diyaliz tüpünden istenilen uzunlukta kesin. Tüpü DDW ile yıkayın ve bir ucundan düğüm atarak bir torba oluşturun; trombin ile sindirilmiş protein çözeltisini, üst kısımda biraz boşluk bırakacak şekilde torbaya aktarın. Diyaliz tüpünü klemple kapatın.Diyaliz tüpünü dört litre soğutulmuş tampon D içerisine daldırın. Çözeltiyi 277 K'de gece boyunca yavaşça karıştırın; gece boyu süren diyaliz işleminden sonra tüpü beherden çıkarın. Küçük bir kesik açın ve proteini 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne aktarın; memay Delta 41 proteinini daha fazla saflaştırmak için iyon değişim kromatografisi kullanılır. Önceden paketlenmiş bir mono Q4 0.6 100 PE kolonunu bir FPLC ACTA purifier sistemine bağlayın.Kolonu beş kolon hacmi veya CV filtreli DDW ile yıkayın ve kolonu beş CV Tampon D ile dengeleyin. Enjeksiyon döngüsünü önce iki döngü hacmi DDW, ardından iki döngü hacmi Tampon D ile yıkayın. Proteini enjeksiyon döngüsüne yükleyin. Protein örneğini dakikada bir mililitre akış hızında enjekte edin ve fraksiyonları toplamaya başlayın. Bu fraksiyonlar, bağlanmamış proteinlerin SDS-PAGE ile tespiti için kullanılacaktır.Tüm numune kolona yüklenene kadar protein yükleme ve enjeksiyon işlemine devam edin. Kolonu üç CV tampon D ile yıkayın. Bağlanmamış proteinleri uzaklaştırmak için, 40 millimolar ile başlayıp iki molar ile sona eren lineer bir sodyum klorür gradyanı kullanarak, dakikada bir mililitre hızında 60 dakika boyunca proteini elüe edin. %100 tampon E seviyesine ulaşıldıktan sonra, 280 nanometre kromatogramında görünen protein piklerini toplayın.Prepec kolonunu üreticinin önerisine göre temizleyin. Bağlanmamış protein ve protein pik akış hızı dahil olmak üzere, toplanan FPLC fraksiyonlarının önceden boyanmış markerlar kullanarak SDS-PAGE analizini gerçekleştirin. Mame'nin öngörülen molekül ağırlığında protein içeren fraksiyonları belirlemek için protein bantlarını değerlendirin.Delta 41, boyut dışlama kromatografisi hazırlığı için seçilen fraksiyonları birleştirir. Birleştirilen örneklerin sodyum klorür konsantrasyonu, daha önce açıklandığı üzere tampon f ile diyaliz edilerek düşürülür. Gece boyu süren diyalizin ardından.10.000 moleküler ağırlık kesim noktasına sahip bir santrifüj konsantratörü kullanarak protein örneğini konsantre etmek için bir masaüstü santrifüj kullanın. Proteini 4.000 RPM'de mililitre başına sekiz miligrama konsantre edin. İstenen konsantrasyonu, kuvars küvetle 280 nanometrede OD ölçümü yaparak doğrulayın.Yüksek kapasiteli 26 60 superdeck 200 boyut dışlama ön doldurulmuş kolonunu bir FPLC ACTO purifier sistemine monte edin. Kolonu üç cv filtrelenmiş su ile yıkayın ve üç cv tampon F ile dengeleyin. Enjeksiyon loop'unu önce iki loop hacmi DDW, ardından aynı hacimde tampon F ile yıkayın. FPLC yıkandıktan ve dengelendikten sonra, protein örneğini enjeksiyon loop'una yükleyin. Protein örneğini enjekte edin ve 280 nanometre kromatogramında göründükçe protein pik fraksiyonlarını toplamaya başlayın.Kolon boşluk hacmine ulaşana kadar tamponun akmasına izin verin. Önceden doldurulmuş kolonu üreticinin önerisine göre temizleyin. Toplanan fraksiyonların SDS-PAGE analizini gerçekleştirin ve jeli değerlendirin.Protein, protein standart markörüne göre öngörülen doğru moleküler ağırlıkta görünmeli ve yalnızca tek bir bant izlenmelidir. Saf protein fraksiyonlarını birleştirin ve 10,000 moleküler ağırlık kesme sınırına sahip bir santrifüj konsantratör ile masaüstü santrifüj kullanarak protein örneğini mililitre başına 20 miligramdan daha yüksek bir konsantrasyona getirin. İstenilen konsantrasyonu, 280 nanometrede OD ölçümü yaparak doğrulayın.MAME delta 41 örneğinin saflığını ve kimliğini matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu uçuş süresi (MALDI-TOF) kütle spektrometrisi ile doğrulayın. Son olarak, konsantre edilmiş saflaştırılmış MAME delta 41 proteinini, her biri 25 ila 50 µL hacminde olacak şekilde önceden işaretlenmiş endotoksin içermeyen tüplere paylaştırın. Örnek, sıvı azot içinde hızlıca dondurulabilir ve 193 K sıcaklıkta saklanabilir. Bu protokol, yüksek derecede saf, boyut açısından homojen ve konsantre bir MAME Delta 41 protein örneği ile sonuçlanmalıdır. Nikel NTA elüsyon profilinin SDS-PAGE analizi, elüsyon fraksiyonlarında yaklaşık 22 kDa ağırlığında yüksek düzeyde MAME delta 41 10-his proteinini ortaya koymaktadır.SDS-PAGE analizi ayrıca yıkama, akış ve ultrasantrifüj peleti örneklerindeki bağlanmamış protein akışında herhangi bir memay delta 41 proteini olup olmadığını da ortaya çıkaracaktır. Bu örneklerde 22 kilodalton civarında büyük bantlar görülürse, sorun giderme işlemi gereklidir. MAME Delta 41 proteinini örnekteki diğer proteinlerden iyon değişimi yoluyla ayırmak için iyon değişim kromatografisi uygulanır.Artan sodyum klorür konsantrasyonları altında, iyon değişim kromatogramı iki protein popülasyonu arasında iyi bir ayrım olduğunu göstermektedir. Numunelerin SDS-PAGE ile konsantrasyon analizi, her bir popülasyonun moleküler ağırlığını ortaya koymaktadır. İlk pik MAME delta 41, ikinci pik ise sığır trombini tarafından kesilmemiş olan MAME delta 41 10 hiss proteinidir.İyon değişim kromatografisi tamamen ayrışmış protein pikleri ile sonuçlanmazsa, tampon hazırlama sürecini ve sodyum klorür gradyanının eğimini gözden geçirin. MAME delta 41 saflaştırmasının son adımı boyut dışlama kromatografisidir. Kromatogram, 20 kilodaltonda elüe olan tek bir pik göstermektedir.Saflaştırılmış MAME delta 41 proteinini doğrulamak için MAME Delta 41 proteininin uygun monomer boyutu MALDI-TOF ile belirlenmiştir. Bu analiz, biri 20.347 Dalton'da tek yüklü proteini, diğeri ise 10.176 Dalton'da çift yüklü proteini temsil eden iki tür ortaya çıkarmaktadır. His-tag temizlenmesinin ardından rekombinant MAME delta 41 proteini için öngörülen moleküler ağırlık 20.597 Dalton'dur.Küçük 250 Dalton farkı, ilk metiyoninin ikinci glisine yaygın bozunmasından kaynaklanıyor olabilir. Sonuçlar, yüksek derecede saflaştırılmış MAME delta 41 proteini olduğunu ortaya koymaktadır. Bu protein, ileri deneylerde kullanılabilir.Sizlere rekombinant bir silabl proteinin nasıl saflaştırılacağını göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, tampon çözeltileri kendi özel proteinlerinize göre ayarlamanız ve bu deneyleri mümkün olduğunca hızlı gerçekleştirmeniz gerektiğini unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

purification-m-magneticum-strain-amb-1-magnetosome-associated-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Video, immünomanyetik hedefleme ve periferik kan mononükleer hücre süspansiyonundan ayırma yoluyla B hücrelerini saflaştırmanın bir yolunu açıklıyor. Yöntem, istenmeyen hücre tiplerinin, manyetik ayırma yoluyla heterojen hücre süspansiyonundan tükenecek olan spesifik hücre yüzey proteinlerini hedefleyen spesifik antikorlar veya ligandlar (manyetik parçacıklara bağlı) ile etiketlenmesini içerir.

Negatif İmmünomanyetik Seçim: Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden B Hücrelerini Saflaştırmak İçin Bir Yöntem

Bu videoda, manyetik mikro boncuklar kullanarak eksozomları hedef biyoakışkanlardan izole etmek için bir prosedür gösteriyoruz. Prosedür, aşağı akış analizi için kullanılabilen eksozomların hızlı bir şekilde yakalanmasını sağlar.

Manyetik Boncuk Bazlı Eksozom Ekstraksiyonu: Biyoakışkanlardan Belirli Eksozomları İzole Etme Tekniği

Bu videoda, manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralaması kullanarak fare yavrusu beyinlerinden mikroglia da dahil olmak üzere CD11b hücrelerini izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin dokuları, anti-CD11b antikor kaplı mikro boncuklarla inkübe edilen tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için homojenize edilir, ardından CD11b+ hücre popülasyonunu saflaştırmak için manyetik sütun bazlı bir ayırma yapılır.

Mikroglia'nın Fare Yavrusu Beyinlerinden Manyetik İzolasyonu

Bu doğal sularda da uygulanabilir magnetotactic bakteriler (MTB) toplamak için bir yöntem göstermektedir. MTB izole ve bakteri doğal manyetizma yararlanır nispeten basit bir kurulumu kullanarak sediment örneklerinin zenginleştirilebilir. İzole MTB sonra ışık ve elektron mikroskobu kullanarak hem ayrıntılı olarak incelenebilir.

Doğal Çevre gelen Magnetotactic Bakteri meydana gelen toplanması, İzolasyon ve Zenginleştirme

Bu işlem yetişkin fare beyin mitokondri ilişkili ER membranlar veya MAM ve MAM ve mitokondriyal hazırlıkları glycosphingolipid zenginleştirilmiş microdomain fraksiyonları izole etmek için nasıl göstermektedir.

Mitokondri ilişkili ER Membranlar (MAM) ve Glycosphingolipid zenginleştirilmiştir Microdomains (GEM&#39;lerle): Fare Beyin izolasyon

Eksozomlar, potansiyel olarak önemli hastalık ayırıcı biyobelirteçler taşıyan biyosıvılar içinde bulunan mikroveziküler yapılardır. Burada, eksozomları spesifik olarak çıkarmak ve tekdüze olmayan elektrikli döngüsel kare dalgalar kullanılarak eksozomların parçalanmasını takiben her iki RNA/protein hedefi için ekzozomal yükü hızlı bir şekilde test etmek için yeni bir yöntem kullanılmaktadır.

Elektrik Alan-kaynaklı Release ve Ölçme (EFIRM) tarafından Exosomal Biomarker Algılama

Kobalt katkılı manyetoferritinin sentezi ve katyizasyonu için bir protokolün yanı sıra kök hücreleri katyonlaştırılmış manyetoferritin ile hızlı bir şekilde manyetize etmek için bir yöntem sunulmaktadır.

Hücrelerin ultra hızlı Mıknatıslanma için katyonize Magnetoferritin sentezi

Bu yazıda bir PEI / MNP vektörü ve mıknatıslanarak endotel hücrelerine miR verimli, viral olmayan iletimi açıklanır. Bu nedenle, genetik modifikasyon ek olarak, bu yaklaşım, manyetik hücre rehberlik ve MR taranabilirlik sağlar. teknik terapötik hücre ürünleri özelliklerini geliştirmek için de kullanılabilir.

Hazırlık ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mıknatıslanmış karakterizasyonu Endotel Hücreleri miR-modifiye

Burada açıklanan nerede eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili düşmesine çapraz-sunum tarafından işlenen hücresel kompartmanlarda arıtma için izin verir yeni bir vezikül yalıtım Protokolü yöntemidir.

Membran yuvası arıtma için çapraz-sunudaki eksojen antijenleri endoplazmik retikulum ilişkili bozulma

Burada, aynı biyolojik kökeni ve doğal hücre dışı veziküllerin (EV'ler) benzer yapısını, morfolojisini ve protein bileşimini paylaşan yeni bir tür eksozom taklitleri (EM'ler) olarak endozomdan türetilmiş nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemini açıklıyoruz.

Endozom kaynaklı veziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı homojenizasyon yöntemi

Bu protokol, fikoeritrin (PE) etiketli akış sitometrisi antikorları ve anti-PE mikroboncukları kullanarak yüksek postsort hedef-belirteç pozitifliğine sahip spesifik mezenkimal kök hücre alt popülasyonlarını izole etmek için manyetik boncuk tabanlı bir sıralama yöntemini tanımlar; test edilen koşullarda CCK-8 tabanlı proliferasyon/metabolik aktivite gerektiren bu yöntem pahalı hücre sorgulayıcıları veya hedefe özgü özel boncuklar gerektirmeden izole eder.

Dodoplanin-pozitif mezenkimal kök hücre alt popülasyonlarının dolaylı manyetik boncuk stratejisi kullanılarak izolasyonu ve doğrulanması

Keşfedin MamAΔ41 proteininin M. magneticum AMB-1'den saflaştırma protokolünü. Afinite, iyon değişim ve boyut dışlama kromatografisi kullanarak manyetozom ilişkili proteinlerin yapı ve fonksiyonlarını inceleyin.

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Daha fazla video keşfet