Embriyonik Spinal Commissural Aksonlar yönünü difüze Sinyal Molekülleri yeteneği Assaying

Sırtal spinal kord eksplantları sıçan embriyolarından diseke edilir ve aday bir sinyal molekülünü eksprese eden hücrelere karşı konumlandırılmış üç boyutlu bir kolajen jel içinde kültüre edilir. Sinyal molekülünün, dorsal spinal eksplant içinde büyüyen aksonları yeniden yönlendirme yeteneği immünohistokimya kullanılarak değerlendirilir.

Merhaba, ben Southern California Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki Samantha Butler laboratuvarından Virginia Hazen. Ben de Butler laboratuvarından Keith Fun. Ve ben de Butler laboratuvarından Ken Ya Mai.

Bugün size, kolajen matris içinde dorsal spinal implantların ve transfekte edilmiş kost hücre agregatlarının kültüre edilmesi prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, aday ligand moleküllerinin spinal nöronları yönlendirme yeteneğini analiz etmek için kullanıyoruz. Bu deneyde, kemik morfogenetik protein veya BMP seven'ın bir kemorepellant olarak hareket etme yeteneğini inceleyeceğiz.

Hadi başlayalım. Burada, ilgilenilen molekül olan kemik morfogenetik protein veya BMP seven için ekspresyon plazmidi ile transfekte edilmiş co hücrelerinden gelen kom koral aksonların yörüngesini test etmek için kullanılan co hücre agregatlarını hazırlayın.

Kapla içindeki besiyerini aspire edin ve hücreleri 1 mL 1X PBS ile yıkayın. PBS'yi uzaklaştırın ve hücreleri 15 dakika boyunca 0,5 mL enzim içermeyen hücre ayrıştırma besiyeri ile muamele edin. Bir mililitre fetal bovin serum içeren besiyeri ekleyerek reaksiyonu durdurun.

1000 µL'lik bir pipet ucu kullanarak, kültür kabının yüzeyinde hiç hücre kalmayana kadar hücreleri tekrar tekrar çekin. Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri iki dakika boyunca çöktürün. 2000 RPM'de, süpernatantı uzaklaştırın ve yeniden süspansiyon haline getirmek için pipetle aşağı yukarı çekme işlemini uygulayın.

35 milimetrelik bir kültür kabı kapağının iç kısmına, 100 mikrolitre besiyeri içerisine hücre solüsyonundan birden fazla 20 mikrolitrelik damla damlatın. Kapağı kabın üzerine kapatın ve hücrelerin kümelenmesini sağlamak için birkaç saat boyunca inkübatörde bekletin. Dorsal spinal kord implantlarını hazırlamak için, hücreleri taze hasat edilmiş halde tutun.

E 11 sıçan embriyolarını buz üzerinde bekletin. L 15 ortamında, sivriltilmiş bir tungsten iğne kullanarak, her embriyonun ön kol tomurcuğunun hemen altındaki gövde bölgesinden dört ila altı mite segmentinden oluşan bir kesit çıkarın. Plastik bir pipet kullanarak, dokuyu dört kuyucuklu bir plakadaki bir kuyucuğa toplayın.

Buz üzerindeki bir kapta yer alan kuyucuk. Tüm segmentlerin diseksiyonu tamamlandığında, parçaları pipet kullanarak L 15 besiyeri ve disk pastası içeren buz üzerindeki kaptaki ikinci bir kuyucuğa aktarın. Dokuyu oda sıcaklığında beş dakikadan fazla olmamak kaydıyla inkübe edin.

Hücre ölümünü önlemek için dokuyu aşırı sindirmeyin. No tabağının üçüncü kuyucuğuna, %5 ısı ile inaktive edilmiş keçi serumu içeren bir mililitre taze L 15 medyum ekleyin. Ardından doku parçalarını bu kuyucuğa aktarın.

Diz alan inkübasyonunun sonunda, dokunun bir saat boyunca buz üzerinde dinlenmesine izin verin. Mikro santrifüj tüpü içindeki sonraki diseksiyonu kolaylaştırmak için, 360 µL kolajene 40 µL 10 x minimal essential medium ekleyin. Karıştırmak için kısa süreli vorteksleyin ve bir piko santrifüjde çöktürün.

Çözelti sarı renkte olacaktır ve kolajenin donmasını önlemek için mümkün olduğunca buz üzerinde tutulmalıdır; her kolajen grubu için, kolajen çözeltisini hafifçe turuncuya çevirecek miktarda 0.8 molar sodyum bikarbonat ile titrasyon yapın. Her eklemeden sonra çözeltiyi karıştırın. Kolajen çözeltisi bu renkte olduğunda, buz üzerinde tutulursa sıvı kalacak ancak oda sıcaklığına getirildiğinde donmaya hazır hale gelecektir; eğer karıştırma işleminden sonra çözelti pembeleşirse, yeni bir kolajen tüpü ile işleme baştan başlayın; temiz bir dört kuyucuklu kapta her kuyucuğa 20 µL kolajen damlatın.

Pipet ucunu kullanarak kollajeni küçük bir ped oluşturacak şekilde yayın. Kollajenin oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca donmasını bekleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, yeni bilenmiş bir tungsten iğne ve ince uçlu bir pens yardımıyla, bir embriyonun omuriliği çevreleyen mezodermünü tungsten iğne ile uzaklaştırın ve taban plakasının varlığıyla ayırt edilebilen omuriliğin ventral kısmını çıkarın.

En ventral kenarda, taban plağı (floor plate), dorsal kenardaki tavan plağından (roof plate) biraz daha kalındır. Bu örnekte, omurilik ventral tarafı aşağıya gelecek şekilde konumlandırılmıştır. Dokuyu, taban plağına paralel çalışarak dikkatlice kesin ve omuriliğin ventral beşinci kısmını atın.

Dorsal spinal kord explanını dikey olarak ikiye bölmek için iğneyi kullanın. Kenarların mümkün olduğunca temiz kesildiğinden emin olun ve gerekirse yeniden düzeltin. Her bir x explanını ayrı bir kolajen ped üzerine aktarmak için 0.5 mm çapında cam kapiler tüp takılmış bir ağız pipeti kullanın.

Tungsten iğne ile, transfekte edilmiş ko hücre agregatını, dorsal spinal kordun lateral kenarı ile yaklaşık aynı genişlikte kareler şeklinde kesin. Eksplan. Karelerden birini ağız pipeti kullanarak x eksplanı içeren kolajen pedin üzerine aktarın. Fazla sıvıyı çekmek için ağız pipetini kullanın.

Kollajenin sonraki uygulamasında yardımcı olacağı için küçük bir miktar sıvı bırakın ve aşırı aspirasyon yapmayın; pedin üzerine 4 µL önceden hazırlanmış kollajen uygulayın. Dokuya doğrudan temas etmeden kollajeni implantların üzerine taşımak için tungsten iğneyi kullanın. İğneyi kollajen içinde hareket ettirerek, her bir x explan'ı, co hücre agregatı lateral kenarına bitişik olacak şekilde yönlendirin.

Kolajenin 15 ila 20 dakika boyunca donmasını bekleyin. Bir sonraki embriyoya geçmeden önce, doku kültürü davlumbazı altında, x eksplantın tamamen kolajenle kaplandığından emin olmak için dört microliter kolajen ile uygulama işlemini tekrarlayın; 0.5 milliliters besiyerinde, bir inkübatörde 30 ila 40 saat boyunca kültüre edin. Çeker ocak altında, eksplantları PBS içindeki %4'lük Paraformaldehit çözeltisinin 0.5 milliliters miktarı ile 45 dakika boyunca fikse edin. Dokuyu buz üzerinde tutarak, 0.5 milliliters bloklama ve permeasyon çözeltisi (PBTN) ile iki kez yıkayın.

x eksplantlarını, tercihen gece boyunca, dört derece Celsius'ta bloklama çözeltisi içerisinde inkübe edin. X eksplantını dörtlü kuyucuklu plakadan çıkarmak için pens kullanın ve her birini 48 kuyucuklu bir kabın bir kuyucuğuna yerleştirin.

Her bir kuyucuğa 200 µL primer antikor ekleyin. Komissüral aksonları görselleştirmek için mouse anti ttag antikoru kullanın ve hücreler arası transfeksiyonun başarılı olup olmadığını belirlemek için test edilen moleküle karşı bir antikor ekleyin. 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Her bir örneği, dört derece Celsius'ta, her yıkama bir saat sürecek şekilde PBTN bloklama çözeltisi ile beş kez yıkayın. PBTN'yi uzaklaştırın ve her birine 200 µL sekonder antikor ekleyin. Ağartmayı önlemek için kuyucukları folyo ile kapatın ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.

Numuneleri daha önce olduğu gibi PBTN ile beş kez yıkayın. Her bir örneği üç kuyucuklu çökme lamına aktarın. Fazla sıvıyı uzaklaştırın, invecta shield ortamı ile monte edin ve bir lamel ile kapatın.

Slaytları, mikroskop altında gözlemlenmeye hazır olana kadar 4 veya -20 °C'de, ışık geçirmeyen bir klasörde veya kutuda saklayın. Şimdi, kültüre edilmiş, fikse edilmiş, boyanmış ve konfokal mikroskopi ile görüntülenmiş x eksplantlarının bazı temsili görüntülerini göstereceğiz; panel A, beyazla çevrelenmiş bir roof plate X eksplantının, tag bir pozitif koral aksonları kendisinden uzaklaştırarak yeniden yönlendirebildiğini ve böylece roof plate'in bir akson kemorepelen kaynağı olduğunu göstermektedir. Panel B, M tact sinyal molekülü olan kemik morfogenetik protein veya BMP 7 salgılayan co hücrelerinin, roof plate'e benzer şekilde karseral aksonları repele edebildiğini göstermektedir.

Yalnızca ekspresyon plazmidi salgılayan hücreler, aksonların yönelimi üzerinde herhangi bir etki yaratmaz. Size omurilik explanlarını nasıl diseke edeceğinizi, yönlendireceğinizi ve kültüre edeceğinizi ve aday bir sinyal molekülünün akson yeniden yönlendirme aktivitesine sahip olup olmadığını belirlemenize olanak tanıyan hücre agregatlarını nasıl oluşturacağınızı göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, kollajenin mümkün olduğunca buz üzerinde tutulması ve explanın kültür medyasıyla doğrudan temas etmemesi için tamamen kollajenle kaplanması önemlidir.

Ve son olarak, aksonlar eksplanın ventral kenarına uzanana kadar kültürleyin. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.