Name: Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Keşfedin fibrin jel boncuk testi ile anjiyogenez aşamalarını in vitro ortamda nasıl çalışılır. Bu yöntem, damar biyolojisi araştırmalarında kan damarı oluşumunun dinamiklerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

HAZIRLAMA HÜCRELERİ <ol><li> FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 gün boncuk önce M199/10% HUVEC ve fibroblastlar getirin. </li><li> Fibroblastlar için gömmeden önce HUVEC ve gün için boncuk önce EGM-2 (Clonetics) gün orta açın. </li><li> ~ 400 HUVEC başına boncuk bir konsantrasyon gereklidir. </li><li> Ortalama 20.000 fibroblastlar ihtiyaç vardır. </li></ol> HUVEC İLE BONCUK KAPLAMA - GÜN -1 <ol><li> HUVEC Trypsinize. </li><li> Boncuk (SANTRİFÜJ VERMEYİN!) Yerleşmek için izin ver. Süpernatantı aspire ve 1 ml sıcak EGM-2 orta boy boncuklar kısaca yıkayın. </li><li> FACS tüp sıcak EGM-2 orta boy 1.5 mL Mix 2500 boncuk w / 1x10 6 HUVEC. Inkübatör dikey olarak yerleştirin. (Gerekirse ~ 10 kuyu. Ölçeği için yeterli olacaktır) </li><li> Tüp sallayarak her 20 dakikada, 37 ° C&#39;de 4 saat inkübe edin. (İyi kaplama filizlenmesi için çok önemlidir.) </li><li> 4 saat sonra, T25 EGM-2, 5 ml&#39;lik bir balona kaplı boncuklar transfer ve O / N terk </li></ol> Fibrin GEL &#39;IN KAPLI BONCUK Katıştırma GÜN 0 - <ol><li> 2.0 mg / ml fibrinojen solüsyonu (tarifi bölümüne bakınız) hazırlayın. </li><li> 0.15 Birimler / ml aprotinin fibrinojen solüsyonu ekleyin. </li><li> 15 mL konik bir tüp kaplı boncuk boncuk transferi ve yerleşmek. EGM-2 1 ml ve 1.5mL bir santrifüj tüpüne transfer süspanse edin boncuk. </li><li> YAVAŞÇA yukarı ve aşağı pipeting EGM-2 1mL 3X boncuk yıkayın. </li><li> Bir lamel tespih ve ~ 500 boncuk / ml &#39;lik bir konsantrasyon fibrinojen solüsyonu tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Her bir kuyu için 0.625 ünite / ml trombin ekleyin. </li><li> 24 plaka her bir kuyu için 0.5 mL fibrinojen / boncuk süspansiyonu ekleyin. Her bir kuyu için pipet ! </li><li> Trombin ve fibrinojen pipet ucu ile yaklaşık 4 - 5 kez yavaşça aşağı yukarı gidiyor ve karıştırın. Büyük baloncuklar yapmak için dikkatli olun. </li><li> Kaputu 5 dakika plaka bırakın, sonra bir pıhtı oluşturmak için 10-15 dakika süreyle 37 ° C-inkübatör yerleştirin. </li><li> Pıhtı beklerken, fibroblastlar trypsinize. </li><li> 1 EGM-2 mL başına damla damla ekleyin. </li><li> Ortalama 20.000 hücre bir konsantrasyon fibrin jel üstünde Tohum fibroblastlar. </li></ol> NOTLAR: Genellikle, fibrin jel oluşur, jel küçük kabarcıklar göreceksiniz. Merak etmeyin, bunlar 3-4 gün içinde kaybolur. , Her gün, yani Gün 2, 4, 6, vb ortam .. Günde 3 veya 4 ile çimlenme başlamalıdır.

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

, In vitro anjiyogenez deneylerde üç boyutlu (3D) 2D kültürleri kullanılarak elde edilebilir in vivo daha gerçek bir ortamda daha yakın bir model sunuyoruz artan bir fikir birliği yoktur. Bu üstün 3D sistemleri tekrarlanabilir ve anjiyogenez önemli adımlar birkaç taklit etmek mümkün gerektiği açıktır. Önceki birkaç 3D testleri geliştirilmiş olsa da, bunların pek çoğu ya mikrovasküler hücreleri elde etmek için zor kullanmak, ya da sadece bazı aşamaları özetlemek. Bu video, açıklamak ve vasküler araştırma ve kolayca elde edilebilen ve en sık ...

<table><tbody><tr><td>Cytodex-3 Boncukları</td><td>Reaktif</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g/şişe. 1.0.5 g kuru boncuk, 50 mL PBS (pH = 7.4) içinde en az 3 saat oda sıcaklığında hidrate edilir ve şişirilir. 50 mL'lik bir tüp kullanın ve tüpü sarsıcıya yerleştirin.2.Boncukların çökelmesini bekleyin (~ 15 dk). Süpernatantı atın ve boncukları taze PBS (50 mL) içinde birkaç dakika yıkayın.3.PBS'yi atın ve taze PBS ile değiştirin: 25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60000 boncuk/mL veya 50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30,000 boncuk/mL4.Boncuk süspansiyonunu silikonize edilmiş bir cam şişeye (Windshield Wiper veya Sigmacote) yerleştirin.5.Boncukları 115&amp;#x00B0;C'de 15 dk otoklavlayarak sterilize edin.6. 4&amp;#x00B0;C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg/şişe. Liyofilize aprotinini DI su içinde 4 U/mL konsantrasyonda yeniden çözün. Steril filtreleyin. Her biri 1 mL olan alikotlar hazırlayın. -20 &amp;deg;C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Fibrinojen Tip I</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g. 2 mg/mL fibrinojeni DPBS içinde çözün. Pıhtılaşabilir protein % değerini not edin ve buna göre ayarlayın. Fibrinojeni çözmek için 37 &amp;#x00B0;C'lik su banyosunda ısıtın. Tüpü altüst ederek karıştırın. Vortekslemeyin. 0.22 µm filtreden geçirerek sterilize edin.</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1,000 ünite. Steril su içinde 50 U/mL konsantrasyonda yeniden çözün. Her biri 0.5 mL olan alikotlar hazırlayın. -20 &amp;deg;C'de saklayın.</td></tr></tbody></table>

anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş fibrin jel boncuk testi

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Anjiyogenez anjiyogenik uyaranlara yanıt olarak, yeni damarlar mevcut damarsal oluşturulan karmaşık çoklu adımlı bir süreçtir. Bu adımlar şunlardır: ekstrasellüler matriks, kablosuna AT uyum içine endotel hücreleri bazal membran, proliferasyon ve göç (çimlenme) (EC) bozulması, dallanma, lümen oluşumu, anastomoz, ve yeni bir bazal membran oluşumu. In vitro tayinlerde, bu süreç pek çok çalışma için geliştirilmiş, ancak çoğu sadece belirli aşamalarında anjiyogenez taklit ve morfolojik testlerin içinde gemilerin çoğu in vivo gemileri benzemez edilmiştir. Nehls ve Drenckhahn tarafından daha önceki çalışmaları üzerine dayanarak, insan umbilikal ven EC ve fibroblastlar kullanır in vitro anjiyogenez tayininde bir iyimserlik var. Bu model özetlediği anjiyogenez en önemli erken aşamalarında ve daha da önemlisi, gemilerin polarize Avrupa Komisyonu tarafından çevrili patent hücrelerarası lümen gösterilecek. EC cytodex microcarriers üzerine kaplanmış ve fibrin jel içine gömülü. Fibroblastlar EC boncuk yüzeyinden çimlenme teşvik gerekli çözünür faktörlerin sağlayan jel üstünde katmanlı. Birkaç gün sonra, çok sayıda gemiler, faz-kontrast ve zaman atlamalı mikroskobu altında kolayca gözlenebilir olduğunu mevcut. Bu video bu kültürlerin kurulmasında önemli adımlar gösteriyor.

Bu video in vitro anjiyogenez tayininde bir protokol anjiyogenez özetlediği çeşitli aşamaları olduğunu göstermektedir. Zaman atlamalı çimlenme görüntüleri, lümen oluşumu, dallanma ve anastomoz - anjiyogenez temel özellikleri gösterilmektedir.

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Anjiyogenez, anjiyojenik stimülasyonlara yanıt olarak mevcut damar yapısından yeni damarların oluşturulduğu, karmaşık ve çok aşamalı bir süreçtir. Bunlar...

Merhaba, benim adım Mar Katsu. UC Irvine Moleküler Biyoloji ve Biyokimya Bölümü'ndeki Hughes Lab'den geliyorum. Fibrin boncuk analizini gerçekleştireceğim.Tüm süreç iki günde tamamlanır. İlk gün, boncukların pubik veya insan göbek kordonu ven endotel hücreleri ile kaplanmasını içerir. İkinci gün ise, bu kaplanmış boncukların fibrin jellerine gömülmesini ve ardından bu jellerin üzerine fibroblastların tabaka halinde eklenmesini içerir.Bu deneyi, in vitro ortamda anjiyogenezin birçok aşamasını incelemek için kullanıyoruz. Birinci bölümün ilk gününde CY X three Bead'leri kullanıyoruz. Ardından ikinci gün; fibrinogen, thrombin ve aprotinin cytx olmak üzere bu üç reaktifi kullanıyoruz.Üç numaralı boncuklar Amazon Biosciences'tan temin edilmiştir ve endotel hücrelerinin boncuklara tutunması için özellikle kolajen kodlanmıştır. Bir sonraki reaktif, Sigma'dan temin ettiğimiz fibrinojenle ilgili olup, bu madde boncuk analizindeki asıl jeli veya pıhtıyı oluşturur.Trombin bir koagülasyon faktörüdür. Bu protein fibrinojeni fibrine dönüştürür, bu nedenle analize eklenir. Aprotinin ise bir serum proteaz inhibitörüdür.Proteazların fibrin jeli degrade etmesini önlemek için bunu kullanıyoruz. Burad

optimized-fibrin-gel-bead-assay-for-the-study-of-angiogenesis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, anjiyogenezin erken aşamalarında endotel filizlenmesini incelemek için perisitleri içeren modifiye edilmiş bir mikro taşıyıcı boncuk bazlı testi göstermektedir. Test, anjiyogenezin moleküler mekanizmalarını ve anti-anjiyogenetik terapötiklerin etkisini anlamak için in vitro deneysel bir model sağlar.

Erken Evre Anjiyogenez Değerlendirmesi için Boncuk Filizlenme Testi: Perisitlerin Varlığında Endotelyal Filizlenmeyi İncelemek İçin İn Vitro Boncuk Tabanlı Bir Model

48 saatlik bir süre boyunca çevre kontrollü bir biyoreaktörde fibroblast aracılı jel sıkıştırma ve fibrin fiber yeniden hizalamayı gözlemlemek ve analiz etmek için zaman atlamalı mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri kullanılmıştır.

Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme

Lokal anjiyogenezi uyaran organa özgü mikroçevrenin rekapitülasyonu, hasarlı dokuların başarılı bir şekilde rejenerasyonu için vazgeçilmezdir. Bu rapor, akciğere özgü mikro çevrenin yetişkin farede anjiyogenezi ve alveolar rejenerasyonu nasıl modüle ettiğini araştırmak için canlı farenin akciğer yüzeyine fibrin jelleri implante etmek için yeni bir yöntemi göstermektedir.

Fare Akciğer Fibrin Gel implantasyonu Akciğer özel Anjiogenez Eğitim için

Kanser hücreleri bir kollajen jele gömülür ve daha sonra uydu tümörlerinin invazivliği ve oluşumunun izlenebileceği bir 3D kültür sistemi oluşturmak için bir aselüler fibrin jeli içine sıkıştırılır.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Bir roman vitro boncuk tahlil bu protokolü sunar daha uygun modelleri perisitlerden dahil ederek angiogenez çimlenme vivo içinde süreci. Bu değişiklik daha sadakatle heterotypic hücresel etkileşimlerin endotel hücreleri ve anjiogenezi için kritik olan duvar hücreler arasındaki özetlemek boncuk tahlil sağlar.

Perisitlerden tahlil filizlenen bir endotel hücre boncuk birleşmeyle

Burada, proliferatif diyabetik retinopati Patofizyoloji üç boyutlu yerel doku karakterizasyonu ve ex vivo kültürü için hasta kaynaklı, cerrahi olarak eksize, fibrovascular dokuları kullanarak eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu ex vivo kültür modeli sınama veya yeni tedaviler geliştirmek için mükellef da.

Bir Ex Vivo doku kültürü modeli Fibrovascular komplikasyon proliferatif diyabetik retinopati

Bu yöntem, standart mikroakışkan bir platformda 40 perfüze 3D mikrokap olarak iPSC kaynaklı endotel hücrelerinin kültürünü açıklar. Bu platform, anastomoz ve anjiyojenik filizlerin ölçeklenebilir ve yüksek iş lenme tarzında stabilizasyonu da dahil olmak üzere, degrade odaklı anjiyojenik filizlenmenin 3Boyutlu olarak incelenmesini sağlar.

IPSC türetilmiş Endotel Hücrelerinin Perfüzyonlu 3D Anjiyojenik Filizlenmesini İn Vitro Olarak İncelemek Için Standart ve Ölçeklenebilir Tsay

Burada sunulan yöntem, reaktiflerin anjiyogenez veya vasküler geçirgenlik üzerindeki etkisini in vivo boyamadan değerlendirebilir. Yöntem, neo-damarları veya vasküler sızıntıyı görselleştirmek için kuyruk damarı yoluyla dekstran-FITC enjeksiyonunu kullanır.

Anjiyogenez Çalışmaları için Modifiye In Vivo Matrix Jel Plug Testi

Mekanik olarak izole edilmiş stromal vasküler fraksiyon (SVF), bir fibrin hidrojel ile kombinasyon halinde, doku mühendisliği ve/veya yara iyileşmesi amaçları dahil olmak üzere çeşitli endikasyonlar için canlı adipoz türevli stromal hücreler için kolay ve verimli bir taşıyıcı sunar. Burada, translasyonel araştırma ve klinik uygulama için mekanik bir SVF (mSVF)-fibrin hidrojel yapısının hazırlanmasını sunuyoruz.

Mekanik Olarak İzole Edilmiş Stromal Vasküler Fraksiyon ve Fibrin Hidrojel Kombinasyonu: Bir İşleme Protokolü

Burada, Sipunculus nudus'un fibrinojenolitik ajanlarını hızlı bir şekilde ayırmak ve görüntülemek için bir fibrinojen-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) protokolü sunuyoruz.

Fibrinojen-Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile Sipunculus nudus'ta Aktif Fibrinojenolitik Ajanların Hızlı Ayrılması ve Görüntülenmesi

Keşfedin fibrin jel boncuk testi ile anjiyogenez aşamalarını in vitro ortamda nasıl çalışılır. Bu yöntem, damar biyolojisi araştırmalarında kan damarı oluşumunun dinamiklerini anlamaya yardımcı olur.

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Daha fazla video keşfet