Büyüme inhibisyonu fenotipleri tanımlanması Mayalarda bakteriyel Tip III Efektör İfade İndüklenmiş

Bu protokole başlamak için, en sevdiğiniz bakteri efektörünün ifadesi için bir vektör seçin. Maya ve maya suşunda, vektör daha sonra maya hücrelerine dönüştürülür. Efektörün bir sonraki ifadesi indüklenir.

İndüklenen hücreler, efektörün ekspresyonunu doğrulamak için müteakip western blot analizi için parçalanır. Efektör hücrelerin ekspresyonunun doğrulanmasından sonra büyür ve on kat artar, baskılayıcı ve indükleyici ortam üzerinde seri seyreltme tespit edilir. Son olarak, iki ila üç gün sonra maya büyümesi analiz edilir.

Merhaba, ben Tel Aviv Üniversitesi Bitki Bilimleri Bölümü'nde Dr.Guido Cesa'nın laboratuvarından Do Solomon. Bugün size, mayadaki bakteriyel tip üç efektörlerin ekspresyonu ile indüklenen büyüme inhibisyonu fenotiplerinin tanımlanması için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda, gram negatif patojenik bakterilerden elde edilen tip üç efektörlerin işlevini incelemek için kullanıyoruz ve efektör TIC hedeflerinin tanımlanmasında bize yardımcı olan bir araçtır.

Öyleyse başlayalım. İlgilenilen tip üç efektörlerin ekspresyonu için uygun bir maya sistemi tasarlanırken birkaç önemli faktör göz önünde bulundurulmalı ve optimize edilmelidir. Birincisi, efektörlerin promotör sürüş ifadesidir.

Bakteriyel tip üç efektörler maya hücreleri için toksik olabileceğinden, ekspresyonlarını kontrol etmek için indüklenebilir bir promotör kullanılmalıdır. Bu deneyde GAL bir promotörü kullanacağız. İkinci faktör, efektör genin kopya sayısıdır.

Efektör gen iki mikronluk bir plazmit tarafından taşındığında yüksek ekspresyon seviyeleri elde edilir. Ara ekspresyon, plazmit içeren bir sentromer kullanılarak elde edilir ve efektör gen, homolog rekombinasyon ile maya genomuna entegre edildiğinde düşük ekspresyon elde edilir. Dikkate alınması gereken üçüncü bir faktör, ilgilenilen efektöre karşı antikorların mevcut olmadığı durumlarda protein ekspresyonunu doğrulamak için kullanılan epitop etiketidir.

Yaygın olarak kullanılan etiketler, güvenilir ticari antikorların mevcut olduğu M hemaglutinin HA veya bayrağıdır. Efektör proteinin yapısı ve aktivitesi üzerindeki istenmeyen zararlı etkileri en aza indirmek için etiketin yalnızca bir kopyasını kullanmanızı öneririz. Son olarak, ifade için kullanılacak maya türü, ifade vektörünün seçilebilir işaretleyicisine göre tropikal olmalıdır.

Dönüşüm için maya hücrelerini büyütmek için, taze bir plakadan bir maya kolonisi seçin ve 15 mililitrelik bir polipropilen tüp girdabına üç mililitre YPD aşılayın. Kültür tüpünü kısaca bir silindire yerleştirin ve sabit dönüşle gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, kültürü silindirden çıkarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 Gs'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı tamamen çıkarın ve hücreleri, yaklaşık 10 saniye boyunca maksimum hızda girdaplama ile karıştırılmış bir mililitre Resus süspansiyon tamponu içinde yeniden süspanse edin. Dönüştürülecek her plazmit ve ek bir kontrol dönüşümü için, hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini bir mikro füj tüpüne aktarın. Kontrol tüpü hariç her tüpe beş mikrolitre tek iplikli somon spermi, DNA ve 250 ila 500 nanogram plazma DNA'sı ekleyin.

Daha sonra dikkatlice, her tüpe ve girdaba 650 mikrolitre dönüşüm çözeltisi ekleyin. Tüpleri bir silindir üzerinde 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, her tüpe 70 mikrolitre DMSO ekleyin ve hücrelerin kırılmasını önlemek için tüpleri 10 ila 15 kez ters çevirerek karıştırın.

Tüpleri girdap haline getirmeyin. Tüpleri 42 santigrat derece önceden ılık su banyosuna yerleştirin ve 15 dakika inkübe edin. 15 dakika sonra, tüpleri su banyosundan çıkarın ve hemen iki dakika boyunca buzun üzerine koyun.

Tüpler soğuduktan sonra, hücreleri santrifüjleme ile hasat edin, ardından bir pipetleyici kullanın Viskoz süpernatanı dikkatlice çıkarmak için. Her peleti 150 mikrolitre steril çift damıtılmış su içinde yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu uygun seçici ortam ile bir plaka üzerine yayın. Plakaları iki dakika açık bırakın ve laminer akış başlığında kurumaya bırakın.

Bundan sonra, maya hücrelerini büyütmek için plakaları iki ila üç gün boyunca 30 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bir protein özütü hazırlamak için, uygun baskılayıcı ortamın üç mililitresini taze bir plaka ve girdaptan maya kolonisi ile aşılayın. Kültür tüpünü ertesi gün 30 santigrat derecede bir silindire kısaca yerleştirin.

Kültürü silindirden çıkarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 Gs'de santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücre peletini yeniden süspanse edin. Vorteksleme santrifüjü ile karıştırılan üç mililitre steril DDW'de, süpernatanı tekrar atın ve hücreleri üç mililitre steril DDW'de yeniden süspanse edin. Şimdi 200 mikrolitre hücre süspansiyonunu, girdaplama ile karıştırılmış üç mililitre uygun indükleyici ortam içeren 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Tüpü bir silindire yerleştirin ve ertesi sabah gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Düşük yoğunluklu kültürler için bir mililitre veya daha fazla kültürü bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 Gs'de santrifüjleme ile hasat edin, buradan itibaren toksik Beamer capto etanol buharlarını solumaktan kaçınmak için bir çeker ocakta çalışın.

Bir pipetleyici kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 100 mikrolitre buz gibi soğuk lizis çözeltisinde yeniden süspanse edin. Girdap yaparak kuvvetlice karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. 30 dakikalık inkübasyon sırasında, 100 mikrolitre lizis tamponunu pH dokuz ila 10'a çıkarmak için gereken altı normal hidroklorik asit hacmini belirleyin.

Bunu yapmak için, 10 farklı tüpte 100 mikrolitre lizis tamponuna çeşitli hacimlerde hidroklorik asit ekleyin ve inkübasyonun sonunda bir pH indikatör şeridi kullanarak çözeltinin pH'ını uygun hacimde hidroklorik asit lizata kontrol edin ve girdaplama ile karıştırın. Daha sonra lizata 50 mikrolitre üç x numune tamponu ekleyin ve girdap yaparak karıştırın, mikro füj tüpünün kapağına bir iğne ile bir delik açın ve lizat solüsyonunu ısıtma bloğunda beş dakika kaynatın. Kaynattıktan sonra, çözeltinin oda sıcaklığında iki dakika soğumasına izin verin.

Daha sonra lizat çözeltisini girdaplayın ve 10 saniye boyunca döndürün. Lizat artık lekelenme testi için hücreleri hazırlamak üzere immüno-kan analizine hazırdır. Ertesi gün daha önce gösterildiği gibi her suşun üç mililitre kültürünü büyütün.

Lösin içermeyen sentetik tam ortam içeren iki plaka hazırlayın. Bir plakanın ortamı %2 glikoz ve diğer plakanın ortamı %2 aktoz ve %1 rafinoz ile desteklenmelidir. Plakaları steril bir laminer akış başlığında oda sıcaklığında 20 dakika kurutun.

Hücreleri hasat edin ve her hücre peletini üç mililitre steril DDW'de yeniden süspanse edin. Santrifüjleme adımını tekrarlayın ve hücreleri üç mililitre steril DDW'de tekrar askıya alın. Her kültürün optik yoğunluğunu veya OD'sini belirleyin ve ardından steril mikrofiş tüplerinde bir OD 600 ile bir mililitre hücre süspansiyonu hazırlayın.

Daha sonra, 900 mikrolitre steril DDW ile doldurulmuş üç steril mikro tüp kullanarak hücre süspansiyonlarının her birinden on kat seri seyreltme hazırlayın. Kuru plakaları bir ızgaraya yerleştirin ve her kültür noktası için arka arkaya dört seyreltmeden 10 mikrolitre yerleştirin. Lekelenmeden sonra, plakaları birkaç dakika kaputta açık bırakın.

Lekeler kuruduğunda, plakaları örtün ve iki ila üç gün boyunca 30 santigrat derece inkübatöre koyun. Şimdi, büyüme inhibisyonunun tespiti için bir maya lekelenme testinin sonuçlarını göstereceğiz. Burada tip üç efektörlerin ekspresyonu ile indüklenen fenotipler, tip üç efektörler, A-V-R-P-T-O atlaması, AA bir tane ve AAV RE bir bakteri.

Domatesimizin Pseudomona Riner yolu, A-V-R-P-T-O ve HOP AA ekspresyonu için plazmit taşıyan baskılayıcı orta maya suşları üzerindeki bir maya suşunda plazmit içeren bir sentromerden eksprese edildi, biri boş bir vektör içeren kontrol suşuna benzer büyüme gösterdi. AAV RE taşıyan maya, muhtemelen GAL bir promotörün sızıntısı ve AV RE birinin yüksek sitotoksisitesi nedeniyle biraz azalmış bir büyüme gösterirken, AV E veya HOP AA birinin indükleyici ekspresyonu, herhangi bir seyreltmede koloni eksikliği ile yansıtılan şiddetli bir büyüme inhibisyonu fenotipine neden oldu. Buna karşılık, A-V-R-P-T-O ekspresyonu herhangi bir büyüme inhibitör etki göstermedi.

Mayadaki bakteriyel tip üç efektörlerin ekspresyonunun neden olduğu büyüme inhibisyonu fenotiplerini nasıl tanımlayacağınızı az önce gösterdik. Bu prosedürü yaparken, her ikisi de sonuçları önemli ölçüde etkileyebileceğinden, bu suşun yanı sıra ifade vektörünü de dikkatli bir şekilde seçmeyi unutmamak önemlidir. Ek olarak, prosedürün tüm adımlarında yeni dönüştürülmüş bu kolonileri kullanmayı unutmayın.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.