Büyüme inhibisyonu fenotipleri tanımlanması Mayalarda bakteriyel Tip III Efektör İfade İndüklenmiş

Bu protokole başlamak için, tercih ettiğiniz bakteriyel efektörün ekspresyonu için bir vektör seçin. Maya ve maya suşunda, vektör daha sonra maya hücrelerine transforme edilir. Ardından, efektörün ekspresyonu indüklenir.

Efektör ekspresyonunu doğrulamak amacıyla, indüklenmiş hücreler sonraki western blot analizi için lizlenir. Efektör ekspresyonu onaylandıktan sonra, hücreler büyütülür ve on katlık seri dilüsyonlar baskılayıcı ve indükleyici besiyerlerine damlatılır. Son olarak, iki ila üç gün sonra maya büyümesi analiz edilir.

Merhaba, ben Tel Aviv Üniversitesi Bitki Bilimleri Bölümü'nde Dr. Guido Cesa'nın laboratuvarından Do Solomon. Bugün size, mayada bakteriyel tip üç efektörlerin ekspresyonuyla indüklenen büyüme inhibisyon fenotiplerinin tanımlanması için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü, gram-negatif patojenik bakterilerin tip üç efektörlerinin fonksiyonlarını incelemek için laboratuvarımızda kullanıyoruz ve bu yöntem efektör TIC hedeflerinin tanımlanmasında bize yardımcı olan bir araçtır.

Öyleyse başlayalım. İlgilenilen tip üç efektörlerin ekspresyonu için uygun bir maya sistemi tasarlanırken birkaç önemli faktör göz önünde bulundurulmalı ve optimize edilmelidir. Bunların ilki, efektörlerin ekspresyonunu yönlendiren promotördür.

Bakteriyel tip üç efektörleri maya hücreleri için toksik olabileceğinden, ekspresyonlarını kontrol etmek için indüklenebilir bir promotör kullanılmalıdır. Bu deneyde GAL 1 promotörünü kullanacağız. İkinci faktör ise efektör geninin kopya sayısıdır.

Efektör genin iki mikronluk bir plazmit tarafından taşındığı durumlarda yüksek ekspresyon seviyeleri elde edilir. Sentromer içeren bir plazmit kullanıldığında orta düzeyde ekspresyon sağlanırken, efektör genin homolog rekombinasyon yoluyla maya genomuna entegre edildiği durumlarda düşük ekspresyon elde edilir. Göz önünde bulundurulması gereken üçüncü faktör ise, ilgilenilen efektöre karşı antikorların mevcut olmadığı durumlarda protein ekspresyonunu doğrulamak için kullanılan epitop etiketidir.

Güvenilir ticari antikorlarının bulunduğu M hemaglutinin HA veya flag, yaygın olarak kullanılan etiketlerdir. Efektör proteinin yapısı ve aktivitesi üzerindeki istenmeyen zararlı etkileri en aza indirmek için etiketin yalnızca tek bir kopyasının kullanılmasını öneririz. Son olarak, ekspresyon için kullanılacak maya suşu, ekspresyon vektörünün seçilebilir markörüne tropik olmalıdır.

Transformasyon için maya hücrelerini büyütmek amacıyla, taze bir plaktan bir maya kolonisi seçin ve 15 mililitrelik bir polipropilen tüp içindeki üç mililitre YPD'ye inoküle ederek vorteksleyin. Kültür tüpünü kısmen bir rollera yerleştirin ve sabit rotasyonla 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, kültürü rollerden çıkarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 Gs ile santrifüjleyin.

Santrifüjasyon sonrası süpernatantı tamamen uzaklaştırın ve hücreleri bir mililitre Resus süspansiyon tamponunda, maksimum hızda yaklaşık 10 saniye boyunca vorteksleyerek yeniden süspande edin. Transforme edilecek her bir plazmid ve ek bir kontrol transformasyonu için, hücre süspansiyonundan 100 mikrolitre mikro santrifüj tüpüne aktarın. Kontrol tüpü hariç her bir tüpe beş mikrolitre tek zincirli somon spermi DNA'sı ve 250 ila 500 nanogram plazmid DNA ekleyin.

Ardından, her tüpe dikkatlice 650 µL transformasyon solüsyonu ekleyin ve vorteksleyin. Tüpleri bir rotor üzerinde 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, hücrelerin parçalanmasını önlemek için her tüpe 70 µL DMSO ekleyin ve tüpleri 10 ila 15 kez tersyüz ederek karıştırın.

Tüpleri vortekslemeyin. Tüpleri 42 °C'ye önceden ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirin ve 15 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika sonra tüpleri su banyosundan çıkarın ve derhal iki dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

Tüpler soğuduktan sonra, hücreleri santrifüj ile hasat edin, ardından viskoz süpernatanı dikkatlice uzaklaştırmak için bir pipet kullanın. Her bir peleti 150 microliters steril çift distile su içinde yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonunu uygun seçici besiyerli bir plak üzerine yayın. Plakları iki dakika boyunca açık bırakın ve laminar akışlı kabinde kurumalarını sağlayın.

Ardından, maya hücrelerini büyütmek için plakları iki ila üç gün boyunca 30 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Protein ekstraktı hazırlamak için, taze bir plaktaki maya kolonisini üç mL uygun baskılayıcı ortama inoküle edin ve vortekslenmesini sağlayın. Ertesi gün, kültür tüpünü kısa bir süre 30 °C'de bir roller'a yerleştirin.

Kültürü silindirden çıkarın ve oda sıcaklığında 800 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı atın ve hücre peletini yeniden süspanse edin. Vortex ile karıştırılmış üç mililitre steril DDW içerisinde tekrar santrifüjleyin, süpernatantı atın ve hücreleri üç mililitre steril DDW içinde yeniden süspanse edin. Şimdi, hücre süspansiyonundan 200 mikrolitreyi, vortex ile karıştırılmış üç mililitre uygun indükleme ortamı içeren yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın.

Tüpü bir roller cihazına yerleştirin ve gece boyunca 30 °C'de inkübe edin. Ertesi sabah, düşük yoğunluklu kültürler için bir mililitre veya daha fazla kültürle birlikte mikro santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri, oda sıcaklığında 800 G'de beş dakika santrifüjleyerek hasat edin; bundan sonra toksik Beamer kapto etanol buharlarını solumamak için çalışmaya çeker ocak içerisinde devam edin.

Süpernatantı bir pipet yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın ve hücre peletini 100 µL buz gibi soğuk lizis solüsyonunda yeniden süspanse edin. Vorteksleyerek güçlü bir şekilde karıştırın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. 30 dakikalık inkübasyon süresince, 100 µL lizis tamponunu pH 9'dan 10'a titre etmek için gereken normal hidroklorik asit hacmini belirleyin.

Bunu yapmak için, 10 farklı tüpteki 100 µL lizis tamponuna çeşitli hacimlerde hidroklorik asit ekleyin ve uygun hidroklorik asit hacmi ile lizata ekleme yaptıktan sonra inkübasyon sonunda bir pH indikatör şeridi kullanarak çözeltinin pH'ını kontrol edin ve vorteksleyerek karıştırın. Ardından, lizata 50 µL üç katlı örnek tamponu ekleyin ve vorteksleyerek karıştırın; mikro santrifüj tüpünün kapağına bir iğne ile delik açın ve lizat çözeltisini ısıtma bloğunda beş dakika boyunca kaynatın. Kaynatma işleminden sonra, çözeltinin oda sıcaklığında iki dakika boyunca soğumasını bekleyin.

Ardından lizat çözeltisini vorteksleyip 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Lizat, hücreleri damlatma deneyi (spotting assay) için hazırlamak amacıyla immünokimyasal kan analizine hazır hale gelmiştir. Ertesi gün, daha önce gösterildiği şekilde her suşun üç mililitrelik kültürlerini büyütün.

Lösin içermeyen sentetik komplet ortam içeren iki plaka hazırlayın. Plakalardan birinin ortamı %2 glikoz ile, diğerinin ise %2 laktoz ve %1 rafinoz ile takviye edilmelidir. Plakaları steril bir laminer akışlı kabinde, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kurutun.

Hücreleri hasat edin ve her bir hücre peletini üç mililitre steril DDW içinde yeniden süspande edin. Santrifüj adımını tekrarlayın ve hücreleri tekrar üç mililitre steril DDW içinde yeniden süspande edin. Her bir kültürün optik yoğunluğunu veya OD değerini belirleyin ve ardından steril mikrofuge tüplerinde OD 600 değeri bir olan bir mililitrelik hücre süspansiyonları hazırlayın.

Ardından, 900 µL steril DDW ile doldurulmuş üç adet steril mikrotüp kullanarak hücre süspansiyonlarının her birinden on katlık üç seri dilüsyon hazırlayın. Kuru plakları bir ızgara üzerine yerleştirin ve her kültür noktası için, sırasıyla dördüncü dilüsyondan 10 µL damlatın. Damlatma işleminden sonra, plakları birkaç dakika boyunca çeker ocak içinde açık bırakın.

Damlacıklar kuruduğunda, plakların üzerini kapatın ve iki ila üç gün boyunca 30 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Şimdi, büyüme inhibisyonunun tespiti için yapılan bir maya damlatma analizinin sonuçlarını göstereceğiz. Buradaki tip üç efektörlerin, bakterinin A-V-R-P-T-O hop, AA11 ve AAV RE1 tip üç efektörlerinin ekspresyonu ile indüklenen fenotipler.

Domates patojenimiz olan Pseudomonas Riner yolu, baskılayıcı ortamdaki bir maya suşunda, sentromer içeren bir plazmitten eksprese edildi. A-V-R-P-T-O ve HOP AA one one ekspresyonu için plazmid taşıyan maya suşları, boş vektör içeren kontrol suşuyla benzer büyüme sergiledi. AAV RE one taşıyan mayalar, muhtemelen GAL one promotörünün sızıntısı ve AV RE one'ın yüksek sitotoksisitesi nedeniyle hafifçe azalmış bir büyüme gösterirken, indükleme koşulları altında AV E one veya HOP AA one one ekspresyonu, herhangi bir dilüsyonda koloni oluşmamasıyla kendini gösteren drastik bir büyüme inhibisyonu fenotipine neden oldu. Buna karşılık, A-V-R-P-T-O ekspresyonu herhangi bir büyüme inhibitör etkisi yaratmadı.

Mayalarda bakteriyel tip üç efektörlerin ekspresyonunun neden olduğu büyüme inhibisyon fenotiplerinin nasıl tanımlanacağını göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken, her ikisi de sonuçları önemli ölçüde etkileyebileceği için ekspresyon vektörünü ve suşu dikkatli seçmeyi unutmamak önemlidir. Ayrıca, prosedürün tüm adımlarında taze transformasyon yapılmış koloniler kullanmayı unutmayın.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde başarılar dileriz.