Name: Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Öğrenin canlı hücre görüntüleme için SNAP-tag füzyon proteinleri ifade eden COS-7 hücrelerinde floresan etiketleme yöntemini. Bu teknik protein lokalizasyonunu gerçek zamanlı gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kai Johnsson Ivan Correa Andreas Brecht Katrin Müentener Chris Noren Luo Sun Ming Xu Theodore Davis Salvatore Russello Aihua Zhang Inca Ghosh Elissa Maunus Nicholas Labarthe James MacFarland John Buswell Brenda Desmond James Ellard Don Tarak

CHO-K1 Hücreler Kaplama: <ol><li> F-12K tam 6ml standart protokollere göre tripsinize CHO-K1 hücreleri 50-100μl ekleyin. </li><li> Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme hücre süspansiyonu karıştırın, 1.5 borosilikat coverglass odaları (tripsinize hücre süspansiyonu daha sonra steril bir 8-odacık Lab-Tek II odacıklı Coverglass her kuyuya kısım 300 ul Nalgene Nunc Int. Ürün # 155.409; Yeri: 100808-8-0). </li><li> Numuneleri 37 ° C,% 5 CO 2 gece boyunca inkübe edin. </li></ol> PSNAP ADRB2 ve pSNAP-H2B ile CHO-K1 Hücre Geçici Transfeksiyon <ol><li> Hücre yoğunluğu ve sağlık için önceki gün seribaşı hücre kültürü odaları kontrol edin. </li><li> Mikrofuge'de tüplerin uygun sayıda etiketleyin. </li><li> Laminer akış kaputu, transfeksiyon kompleks karışımlar 0.3 mikrogram pSNAP ADBR2 Kontrol Plazmid DNA veya pSNAP-H2B Kontrol Plazmid DNA, TransPass D2 1 ul ve 1 TransPass V ul 0.3 mikrogram ile aşağıdaki örnek grafiğe göre ayarlamak her reaksiyon için. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> plazmid </td><td> reaksiyon sayısı </td><td> serum orta, ul </td><td> TransPass D2, ul </td><td> TransPass V, ul </td><td> plazmid DNA, ul </td><td> TransPass D2/reaction, ul </td><td> TransPass V / reaksiyon, ul </td><td> DNA / reaksiyon ng </td><td> DNA kons. (Ng / ul) </td><td> plazmid DNA / reaksiyon, ul </td></tr><tr><td> SNAP-ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236,5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3,5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472,34 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> H2B-Snap </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515,89 </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> Sahte </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Untransfected </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li> İlk olarak, F-12K uygun plazmid DNA ile serum serbest, daha sonra sonra TransPass V Transfeksiyon Reaktif eklemek TransPass D2 Transfeksiyon Reaktif ekleyip karıştırın. Bileşenlerin her reaktifin ilavesinden sonra birkaç kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iyi karıştırın. </li><li> Reaksiyon oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> İnkübasyon sırasında, tam DMEM 600 ul kez hücreleri yıkayın ve her bir örnek için 450 tam DMEM ul ekleyin. </li><li> Yavaş yavaş ve akıllıca bir damla moda, her bir örnek 50 ul transfeksiyon karmaşık bir karışımı ekleyin. </li><li> 37 ° C,% 5 CO 2 gecede örnekleri inkübe edin. </li></ol> SNAP-geçici pSNAP ADRB2 ve pSNAP-H2B ile transfekte CHO-K1 Hücre Hücre TMR Yıldız Etiketleme: <ol><li> Dikkatle vakum emme her örnekten transfeksiyon karmaşık ortamı çıkarın. F-12K tam iki kez 600 ul hücreleri yıkayın ve F-12K tam 600 ul ile her bir kuyunun medya yerine. </li><li> 995 F-12K ve 51 ul 0.6 mM SNAP-Cell TMR-Star substrat ul ekleyerek boya etiketleme medya karıştırın. SNAP-Cell TMR-Star final konsantrasyon 3mm olmalıdır. Substrat eklenmesinden sonra karıştırmak için birkaç kez aşağı ve yukarı Pipet. </li><li> Dikkatle örneklerinden büyüme ortamı çıkarın ve her bir kuyunun 200 ul boya etiketleme medya ekleyin. 37 numune ° C'de,% 5 CO 2 30 dakika. </li><li> Tam F-12K 10 ml; örnekleri kuluçka iken, Hoechst 33.342, trihydrochloride, trihidrat (Invitrogen Molecular Probes suda 10 mg / ml solüsyon, 16,2 mM çözüm) 1 ul karıştırılarak Hoechst 33.342 çözüm örnekleri nükleer boyanması için hazırlamak . </li><li> Tüm örneklerde medyayı çıkartın ve her numune için seyreltilmiş Hoechst çözüm 600 ul ekleyin. 37 numune ° C'de,% 5 CO 2 5 dakika. </li><li> F-12K tam 600 ul örnekleri üç kez yıkayın. </li><li> Numuneleri 37 ° ° C'de,% 5 CO 2 adi fluorofor hücrelerin diffüz izin vermek için ek bir 30 dakika . </li><li> 30 dakika sonra, SNAP-Cell örnekleri, son bir kez medya değiştirmek ve görüntüleme geçin. </li><li> Zeiss Apotome Axiovert 200M floresan mikroskop kullanılarak Görüntü hücreler. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1.SNAP-tag füzyonlar ifade canlı COS-7 hücreleri standart floresan mikroskopi kullanılarak floresan görüntüleme bazı temsilcisi sonuçları. Bu ilk görüntü, SNAP-Cell TMR-Star etiketli pSNAP-H2B (histon nükleer) ifade COS-7 hücreleri canlı gösterir. PSNAP-H2B inşa pSNAP-tag (m) vektörü kullanılarak oluşturulmuştur. Hücreler 30 dakika boyunca SNAP-Cell TMR-Star etiketli ve çekirdekleri Hoechst 33.342 (mavi) ile zıt. Pembe floresan kırmızı floresan histon protein çekirdeği gösteren mavi floresan yanı sıra mevcut kaplamayı göstermektedir. H2B protein ifadesi, açık ve kolay bir şekilde tespit edilir. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 2 ve 3 Bu önümüzdeki iki görüntü geçici pSNAP-ADRβ2 transfekte canlı COS-7 hücreleri göstermektedir. Hücreler SNAP-Cell TMR-Star (kırmızı) etiketli ve Hoechst 33.342 (mavi) ile zıt. PSNAP ADRβ2 inşa pSNAP-tag (m) vektörü kullanılarak oluşturulmuştur. Hücreler 30 dakika boyunca SNAP-Cell TMR-Star etiketli ve çekirdekleri Hoechst 33.342 (mavi) ile zıt. Mavi floresan çekirdeği tanımlar iken kırmızı floresan hücre yüzeyinde reseptör protein ADRB2 varlığını gösterir.

<ol><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li>
<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-tag+Technologies%3A+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22NEB+Expressions%22%5BJournal%5D)">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li>
</ol>

Bu makalede kullanılan reaktifler ve araçlar üreten New England Biolabs yazarları tarafından istihdam edilmektedir.

Fluorofor fotostabilite solma önce ele olmalıdır ne kadar hızlı floresan belirler odak, lazer yoğunluğu, ekipman özellikleri, lens kullanılır, vs gibi gözlenen sonuçlar etkileyen birçok değişken vardır. Protein etiketleme Bu yöntem, çok yönlü ve birçok uygulama için uygundur. Sentetik problar ile füzyon proteinleri belirli bir etiketleme için SNAP-etiket ve CLIP-etiket teknolojileri bir çok canlı hücreler ve hücre lizatları dinamik süreçleri de dahil olmak üzere protein fonksiyonu çeşitli yönleriyle sağlar. SNAP, CLIP, MCP-ve ACP-etiket teknolojileri, canlı ve sabit hücrelerin proteinlerin görüntüleme ve proteinlerin in vitro çalışmada, sadelik ve olağanüstü çok yönlülük sağlar. Tek bir gen yapının oluşturulması fluorophores, biotin veya boncuk gibi çeşitli fonksiyonel gruplar, bir kovalent bağ kurma yeteneğine sahip etiketli füzyon proteini verir. Ilgi protein klonlanmış ve ifade sadece bir kez ve daha sonra füzyon floresan substratlar canlı hücrelerin içinde aynı anda protein etiketleme, protein yerelleştirme ve translokasyon, darbe-kovalamaca deneyler, reseptör içselleştirilmesi çalışmaları gibi çok sayıda alt uygulamalar için çeşitli kullanılabilir olmalıdır , seçici hücre yüzeyinde etiketleme, protein testleri, SDS-PAGE, akış sitometri, microtiter plakalar, biyosensör etkileşim deneyleri yüksek verim bağlayıcı deneyleri protein algılama ve FRET-temelli bağlayıcı deneyleri aşağı çekme.

<table><tbody><tr><td>CHO-K1 Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>Serumsuz F-12K</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5 borosilikat lam odacıklı Lab-Tek II Chambered Coverglass</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td>Lot: 100808-8-0</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342, trihidroklorür, trihidrat (suda 10 mg/ml çözelti, 16.2 mM çözelti)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>470519</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome Axiovert 200M floresan mikroskobu</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transpass V</td><td>New England Biolabs</td><td>M2561S</td><td>0030709</td></tr><tr><td>Transpass D2</td><td>New England Biolabs</td><td>M2554S</td><td>0060802</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>pSNAP-ADBR2 Kontrol Plazmidi</td><td>New England Biolabs</td><td>N9178S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>pSNAP-H2B Kontrol Plazmidi</td><td>New England Biolabs</td><td>N9179S</td><td>0010811</td></tr></tbody></table>

canlı hücre görüntüleme için snap-tag fusion proteinler ifade cos-7 floresan etiketleme

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-etiket ve CLIP-tag protein etiketleme sistemleri, canlı hücreler ilgi bir protein, floresan boyalar da dahil olmak üzere moleküller, kendine özgü, kovalent eklenti sağlar. Bu sistemler, görüntüleme enstrümantasyon bir dizi için optimize edilmiş floresan substratların geniş bir seçki sunuyor. Klonlanmış ve ifade sonra tekrar clone kalmadan, etiketli protein çok sayıda downstream uygulamalar için çeşitli substratlar kullanılmalıdır. Bu sistemi kullanarak iki adım vardır: SNAP-tag füzyon, füzyon seçim SNAP-tag substrat etiketlenmesi ve protein gibi ilgi klonlama ve ifade. SNAP-etiket insan O dayalı küçük bir protein<sup&gt; 6</sup(HAGT)&gt; alkylguanine-DNA alkyltransferase bir DNA tamir proteini. SNAP-tag etiketleri benzil ilintileyici üzerinden guanin konjuge boyalar veya chloropyrimidine bırakarak grupları. Etiketleme tepki olarak, yüzey yerine benzil grubu kovalent SNAP-etiketi eklenir. CLIP-etiket benzylcytosine ziyade benzylguanine türevleri ile reaksiyona için tasarlanmış SNAP-tag değiştirilmiş bir versiyonu. SNAP-tag ile birlikte kullanıldığında, CLIP-etiketi aynı hücrelerde aynı anda iki proteinin dik ve tamamlayıcı etiketleme sağlar.

SNAP-etiket ve CLIP-tag protein etiketleme sistemleri, canlı hücreler ilgi bir protein, floresan boyalar da dahil olmak üzere moleküller, kendine özgü, kovalent eklenti sağlar. Klonlanmış ve ifade sonra tekrar clone kalmadan, etiketli protein çok sayıda downstream uygulamalar için çeşitli substratlar kullanılmalıdır.

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag ve CLIP-tag protein etiketleme sistemleri, floresan boyalar da dahil olmak üzere çeşitli moleküllerin, ilgilenilen bir proteine spesifik ve kovalent olarak bağlanmasını sağlar...

SNAP ve clip etiketi. Protein etiketleme sistemleri, hemen hemen her molekülün ilgilenilen bir proteine spesifik kovalent bağlanmasını sağlar. İlgilenilen gen, etiketin her iki yanındaki vektöre klonlanabilir; klonlanan genin ekspresyonu, bir SNAP etiketi füzyon proteini ile sonuçlanır.Snap tag substratı iki kısımdan oluşur: snap tag tarafından tanınan benzo guanin ve fonksiyonel grup. Fonksiyonel grup; biyotin, bir boncuk veya çeşitli renklerde mevcut olan floresan bir grup olabilir. Etiketleme reaksiyonu sırasında, sübstitüe benzo grubu SNAP tag'e kovalent olarak bağlanarak guanini serbest bırakır; eğer hedeflenen proteine Fluora four eşlenmişse, etiket floresan yayarak proteinin canlı veya fikse edilmiş hücrelerde görselleştirilmesine olanak tanır.Merhaba, ben New England Bile Labs'tan Chris Provost. Bugün size, snap tag füzyon proteinleri eksprese eden canlı COS seven hücrelerinin floresan görüntülemesine yönelik bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda proteinlerin hücre içindeki lokalizasyonlarını incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz.Hadi başlayalım. Transfeksiyon için COS-7 hücrelerini hazırlamak amacıyla, standart protokollere uygun olarak tripsinize edin ve 50 ila 100 µL hücreyi 6 mL komple DMEM ortamına ekleyin. Hücre süspansiyonunu pipetle birkaç kez çekip boşaltarak karıştırın. Ardından, steril bir Lab Tech sekiz bölmeli iki odacıklı lam camı düzeneğinin her bir kuyucuğuna 300 µL tripsinize edilmiş hücre süspansiyonu paylaştırın; örnekleri 37 °C'de, %5 CO₂ ortamında gece boyunca inkübe edin ve ertesi güne geçin.Hücre kültürü odacıklarını hücre yoğunluğu ve sağlığı açısından kontrol edin. Transfeksiyon kompleks karışımları için uygun sayıda mikro santrifüj tüpünü etiketleyin. Laminar akışlı kabin içerisinde.Her bir reaksiyon için transfeksiyon kompleks karışımlarını hazırlayın. Serumsuz ortamda seyreltilmiş 0,3 µg snap fusion plazmid DNA'sı ve bir µL TPAs D two ve TPAs v transfeksiyon reaktiflerinin her birini kullanın. Transfeksiyon reaktiflerinin etkinliğini değerlendirmek için kontrol plazmidleri mevcuttur.Her bir kompleks karışım için negatif kontrol olarak mock transfekte edilmiş bir örnek ve/veya rezeke edilmemiş bir örneğin dahil edilmesini de öneriyoruz. Öncelikle, serumsuz DMEM'i uygun plazma DNA'sı ile karıştırın. Ardından TPAs D iki transfeksiyon reaktifiyle, onu da TPAs v transfeksiyon reaktifiyle ekleyin.Her bir reaktif eklendikten sonra, pipetle birkaç kez nazikçe aşağı yukarı çekerek bileşenleri iyice karıştırın ve reaksiyonları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sırasında hücreleri bir kez 600 µL complete DMEM ile yıkayın ve her bir örneğe 450 µL complete DMEM ekleyin. İnkübasyon tamamlandığında, her bir örneğe 50 µL transfeksiyon kompleks karışımını yavaşça ve damla damla ekleyin. Örnekleri 37 °C'de, %5 CO2 ortamında gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün. Transfekte edilen COS-7 hücreleri, bu prosedüre başlamak için Snap-Cell TMR* substratı ile işaretlenebilir; Snap-Cell TMR* substratına 50 µL DMSO ekleyin ve pipetle yukarı aşağı çekerek veya bir dakika boyunca vorteksleyerek karıştırın. Ardından, her bir örnekteki transfeksiyon kompleks medyasını vakum aspirasyonu ile dikkatlice uzaklaştırın ve hücreleri iki kez 600 µL komple DMEM ile yıkayın.Ardından her kuyucuktaki medyumu 600 µL complete DMEM ile değiştirin. Numuneleri inkübatöre geri yerleştirin. 995 µL complete DMEM ve beş µL 0.6 mM ekleyerek D işaretleme medyumunu hazırlayın.Substrat eklendikten sonra, Snap cell TMR star substratını karıştırmak için pipetle birkaç kez çekip boşaltın. Snap cell TMR STAR'ın son konsantrasyonu 3 µM olmalıdır. Büyütme medyasını örneklerden dikkatlice uzaklaştırın ve her kuyucuğa 200 µL DIA işaretleme medyası ekleyin; örnekleri 37 °C'de, %5 karbondioksit ortamında 30 dakika boyunca inkübe edin. Örnekler inkübe edilirken, TMR substratı üzerindeki Benzel grubu snap tag ile kovalent olarak bağlanacak ve quain salınacaktır.Numunelerin nükleer boyaması için HX çözeltisini hazırlayın. 10 mililitre complete DMEM içine bir mikrolitre HSED 3 33 42 Tri Hydrochloride TRI karıştırın. İnkübasyon tamamlandığında, tüm numunelerden d etiketleme medyasını uzaklaştırın ve her numuneye 600 mikrolitre seyreltilmiş hooked çözeltisi ekleyin.Numuneleri 37 °C'de, %5 karbondioksit ortamında beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, her numunedeki seyreltilmiş kancalı çözeltiyi uzaklaştırın ve numuneleri üç kez 600 µL komple DMEM ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, her numuneye 600 µL komple DMEM ekleyin.Hücre içi etiketleme için gerekli olan bağlanmamış Florun hücrelerden dışarı difüze olmasını sağlamak amacıyla, örnekleri 37 °C'de, %5 karbon dioksit ortamında 30 dakika daha inkübe edin. 30 dakika sonra, snap hücre örneklerindeki medyayı son kez 600 µL complete DMEM ile değiştirin. Hücreler artık bir zeis AOME vert 200 M floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme için hazırdır.Etiket füzyonları eksprese eden canlı COS-7 hücrelerinin standart floresan mikroskobu ile görüntülenmesine ait bazı temsili sonuçlar burada sunulmuştur. İlk görüntü, snap cell TMR* ile işaretlenmiş PNAP H2B eksprese eden canlı COS-7 hücrelerini göstermektedir. pnap H2B konstrüktü, PNAP TAG M vektörü kullanılarak oluşturulmuştur.Hücreler 30 dakika boyunca snap cell TMR star ile işaretlendi ve çekirdekler için Hoechst 33342 ile karşıt boyama yapıldı. Pembe floresans, histon proteininin bulunduğu yerlerdeki kırmızı floresansın üst üste bindiğini göstermektedir. Çekirdeği belirten mavi floresansa ek olarak, H2B proteininin ekspresyonu açıkça ve kolayca tanımlanabilmektedir.Sıradaki iki görüntü, pnap ile geçici olarak transfekte edilmiş canlı cost seven hücrelerini göstermektedir. A DR beta iki hücreleri, snap cell, tmr, star ile işaretlenmiş ve HUX 3 33 42 ile karşıt boyanmıştır. pnap A DR beta iki konstrüktü, PNAP TAG M vektörü kullanılarak oluşturulmuştur.Hücreler 30 dakika boyunca snap cell TMR star ile işaretlendi ve çekirdekler için hooks 3 33 42 ile karşı boyama yapıldı. Kırmızı floresans, hücre yüzey reseptör proteini A DR beta iki varlığını gösterirken, mavi floresans çekirdeği tanımlar. Snap tag füzyon proteinleri eksprese eden canlı cough seven hücrelerinin floresan görüntülemesinin nasıl yapılacağını göstermiş olduk.Bu prosedürü uygularken, transfeksiyon kompleksini yavaşça ve damla damla eklemeyi ve snap tag substratını kullanılmadığında -20 °C'de, karanlıkta saklamayı hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

fluorescent-labeling-cos-7-expressing-snap-tag-fusion-proteins-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Flash ve ReAsH biarsenical boyalar özellikle proteinlerin tetracysteine ​​motiflerine bağlanır ve seçici canlı hücrelerde protein etiketleyebilirsiniz. Son zamanlarda bu etiketleme stratejisi, farklı protein konformasyonlar veya oligomerik devletler için sensörler geliştirmek için kullanılır olmuştur. Biz etiketleme yaklaşımı tanımlar ve yöntemleri kantitatif bağlayıcı analiz etmek.

ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine ​​Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi

Biz β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı membran füzyon olaylar rakamlarla bir hücre füzyonu tahlil geliştirdik.

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Bu iletişim kuralı protein yarı-tek yaşam yapisan hücrelerde, hayatını darbe etiketleme ve floresan hızlandırılmış görüntüleme ek-etiket füzyon proteinlerin kullanarak belirlemek için bir yöntem açıklanır.

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Protein-protein etkileşimleri biyolojik sistemleri için kritik olan ve bağlama Kinetik çalışmalar dynamics ve protein kompleksleri fonksiyonu sağlar. Floresans rezonans enerji transferi ve durdu-akış tekniği kullanarak karmaşık bir proteinin Kinetik parametrelerin quantifies bir yöntemi açıklanmaktadır.

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Burada floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak hücre lisat ve canlı hücrelerde protein oligomerlerini ve toplamayı ölçmek için bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Öğrenin canlı hücre görüntüleme için SNAP-tag füzyon proteinleri ifade eden COS-7 hücrelerinde floresan etiketleme yöntemini. Bu teknik protein lokalizasyonunu gerçek zamanlı gözlemlemeyi sağlar.

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

Daha fazla video keşfet