Name: Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-06T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Öğrenin, siRNA transfeksiyonu sonrası canlı memeli hücrelerde mitoz zamanlamasını görüntüleme ve nicelendirme yöntemini. Bu protokol, hücre döngüsü dinamiklerini ve mitotik proteinlerin işlevini incelemek için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Amerikan Kanser Derneği (PF-07-103-01-CSM), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM61275 ve P30 CA042014), Lösemi ve Lenfoma Derneği ve Huntsman Kanser Vakfı tarafından desteklenmiştir.

siRNA transfeksiyon ve hücre hazırlama <ol><li> 4-iyi LABTEK II odacıklı coverglass fibronektin (10μg/mL) kullanılacak her bir kuyunun 0.5mL ekleyerek hazırlayın. 10-15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre ters transfeksiyon siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) kompleksleri hazırlayın. (100μL toplam) kullanılmak üzere odasına başına 24-iyi bir yemeğin iyi biri için önerilen miktarda kullanın. SiRNA transfeksiyon için benzer bir ürün / protokol ikame edilebilir. </li><li> Odacıklı coverglass kuyulardan fibronektin çıkarın. SiRNA / Lipofectamine RNAiMAX kompleksleri olacak her kuyuya 100μL ekleyin. </li><li> Kısım 20.000 histon H2B mCherry-ifade transfeksiyon karışımı içeren başına hücreleri (500μL). </li><li> Hücrelerin normal hücre kültür ortamı 1mL transfeksiyon karışımı değiştirmeden önce ~ 24 saat süreyle inkübe için izin verin. </li><li> Görüntü elde etme önce inkübe hücreler ilave bir 24 saat (48 saat sonrası transfeksiyon). </li></ol> Mikroskop kurulum ve görüntü alımı <ol start="7"><li> Görüntü elde etme kurulumu için üç ana bölümü vardır: 1) mikroskop sahnede oturuyor ve 37 sabit bir nemli ortamlarda muhafaza hücre inkübatör ° C ve% 5 CO 2; 2) otomatik bir sahne ile donatılmış bir inverted mikroskop, floresans ve aydınlık otomatik kepenkler ve otomatik filtre jantlar ve 3) bir yazılım aşamasında entegre ve kontrol paketi, panjurlar, ve filtre tekerlekler. Görüntüleme kurulumda, LABTEK II odacıklı coverglass kullanılabilir OKO Lab özelleştirilmiş bir hücre inkübatör kullanın. Sahne, panjurlar, ve filtre çarklarını Metamorph yazılımı tarafından kontrol edilir İpucu: OKO Lab sahne top inkübatör sistemi farklı tabak, çanak, veya lamel boyutları çeşitli adaptörler içerir. </li><li> Inkübatör, önceden ısıtılmış ve dengelenir kuluçka kapak açma, adaptör odacıklı coverglass yerleştirerek ve modelleme kil ile yer tutan LABTEK II odacıklı coverglass Pozisyonu. Hücre kültürü orta kurumasına olacağını odacıklı coverglass kapağı bırakın. Kapağını kapatın ve yerinde inkübatör sıkıca tutulur sağlanması, mikroskop sahnede tüm inkübatör pozisyon. </li><li> Metamorph kullanarak, yazılım menü çubuğunda &quot;Apps / çok boyutlu Toplama&quot; seçerek deney kurdu. Bu, timelapse sıklığını ve uzunluğunu seçebileceğiniz bir pencere açılacaktır, her renk için, pozlama süresi (eğer birden fazla ayar yapıyor), sayısı ve konumu sahne pozisyonları ve z bölümlerin sayısı (eğer arzulanan). Veri dosyaları nereye kaydedeceğinizi seçin İpucu: Eğer Metamorph başka yazılımı kullanarak, işlevleri biraz farklı olabilir, ama genel bir kavram aynıdır . Micromanager, çoğu donanım kurulumları ile uyumlu bir açık kaynak ImageJ tabanlı satın alma yazılımı, mükemmel bir alternatif. </li><li> Bu protokolün amaçları için, biz iki dalga boylarında (aydınlık ve mCherry) 15 sahne pozisyonları İpucu az 8 saat boyunca her 15 dakikada bir görüntü kazanacaklardır: daha iyi bir zaman çözünürlük istenirse, daha sonra satın almalar arasındaki zaman aralığını kısaltabilir, ancak , sahne pozisyonları daha az kullanılır ve böylece daha az mitotik hücrelerin analiz için uygun olacaktır. Zaman aralıklarında filtre setleri arasında geçiş yapmak için filtre tekerleği için gerekli olan süre dikkate almak dikkate alındığında önemlidir. </li><li> Ilk hücreleri aydınlık aydınlatma kullanarak bir alanda odaklanarak her dalga boyu için en uygun pozlama süresi belirleyin. Yazılım, sadece aydınlık kanal (bu her ediniminden önce her aşamasında pozisyon için yazılım otofokus izin verecek) İpucu otofokus fonksiyonu ayarlayın: Biz petrol gerek kalmadan mükemmel çözünürlük vermek için 40x kuru faz-kontrast objektif . Diğer hedefler istenilen optik çözünürlüğe bağlı olarak kullanılıyor olabilir. </li><li> MCherry dalga boyuna geçin ve 50 milisaniye maruz kullanarak bir görüntü ek bileşenini. Maruz kalma süresi, iyi bir görüntü görmek için gerekli minimum ayarlayın. Sürekli hücre canlılığı sağlamak için ışığa maruz kalma miktarı sınırlamak için esastır. Genel bir kural olarak, bu en iyi aydınlatma gücünü artırarak yerine nötral yoğunluk filtresi (ikaz ışık akısı azaltmak için) ve daha uzun bir kamera maruz kalma süresi ile elde edilebilir. Kullanılmak üzere herhangi bir ek dalga boyları için bu yordamı yineleyin İpucu: Denemeniz için belli bir maruz kalma, uzun süreli hücre canlılığını belirlemek için, geçici olarak timepoint boşluk ayarlayarak istenilen timelapse üzerinde bir hücrenin hayatta resimlerin toplam sayısı önizleme. saniyeye kadar dakika (yani, 10 dakika 10 saniye olur). Hücreleri 100-200 maruz kalma (ya da hayattauygun sayıda), daha sonra pozlama. Aksi takdirde, uyarma ışık, maruz kalma süresi, ya da tam deneyi simüle etmek için resimlerin toplam sayısını azaltır. </li><li> Sonraki seçin ve uygun sayıda hücre popülasyonu yeterli örnekleme ulaşmak böylece bir sahne pozisyonları işareti. Metamorph pozisyonlar kaydetmek ve her elde etmek için orada dönecektir İpucu: Ben genellikle bol hücre görüntü var olan konumlarını bulmak için çok yoğun olduğu pek çok deneyin değil. Ayrıca, hücrelerin mitoz yoluyla ilerleyen çok sayıda gözlemleyerek iyi bir şans olacak, böylece yeterli pozisyonları seçmek için önemlidir. </li><li> Tüm timelapse, dalga boyu maruz kalma süresi ve sahne konum bilgisi kaydedildikten sonra, yazılımın uygun ekipman kontrolü olup olmadığını belirlemek için ekrandaki &quot;Önizleme&quot; butonunu seçin. </li><li> Gibiyse, satın alma başlamak için ekranda &quot;Acquire&quot; düğmesini seçin. Sonra arkanıza yaslanın ve işi yapmak için bilgisayar ve mikroskop izin İpucu: her şeyin düzgün çalıştığından emin olmak için en az bir tam tur satın alma yoluyla otomasyon dikkat edin. </li></ol> Görüntü işleme ve analiz <ol start="16"><li> Satın alma işlemi tamamlandıktan sonra, bir sonraki adım, görüntü veri aktarmak için kolay bir forma. Bu protokolün amaçları için, ben sonra ImageJ programı kullanarak görüntü montajı nasıl oluşturmak için, sinema Metamorph kullanarak nasıl oluşturmak için ilk olarak gösterecektir. Her iki formatı kantifikasyon amaçlar için faydalı olacaktır. </li><li> Verileri gözden geçirmek için ilk adımı. Bunu yapmak için, menü çubuğunda &quot;Apps / İnceleme çok boyutlu Data&quot; seçeneğini seçin. Dosyalarınızı konumu seçin, daha sonra &quot;Görünüm&quot; seçin. Bu görüntülerin yığınını tek tek her aşamasında pozisyonunu gözden geçirmek için izin verecektir. Istenilen sahne konumu seçin, daha sonra &quot;Görüntüler Load&quot;. Veri kare kare ilerlemek mümkün olacaktır. </li><li> Hücreleri mitoz (as hem de DNA ve hücresel morfoloji tarafından belirlenir) geçmesi, bu aşamada pozisyonlar için, sinema ve montajı Metamorph kullanarak yapmak veya ImageJ (NIH üzerinden ücretsiz kullanılabilir) gibi diğer programlar ile yapabilirsiniz. </li><li> Metamorph bir film yapmak için, &quot;Süreç / film kaydet&quot; seçeneğini menü çubuğu. Kullanmak üzere kare, hız ve film dosya türünü seçmek mümkün olacak. Daha sonra &quot;Kaydet Movie&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Bir montaj yapmak için, ben, ImageJ gibi diğer programlar kullanılabilir. Stk dosyası olarak resim yığını. </li><li> ImageJ dosyayı açın ve mitoz geçiyor bir hücre bulana kadar kare ilerlemek. Bitkisel ve hücre çevresindeki alan &quot;Resim / Duplicate&quot; seçeneğini seçin İpucu: tüm kareleri çoğaltmak için emin olun. </li><li> Bir montaj yapmak için, &quot;Görüntü / Bacalar / Montaj yapma&quot; seçin menü çubuğunda. Burada montaj boyutu ve şekli dahil etmek istediğiniz kareleri belirtmek ve çerçeveleri arasındaki sınırları isteyip istemediğiniz. Bu seçin ve &quot;Tamam&quot; tuşuna basın. İpucu:. Montaj tif dosyası olarak kaydedin ve ImageJ veya Adobe Photoshop ya da başka bir işlem yapmak daha kolay görüntü işleme için 8-bit formatına Metamorph tarafından kullanılan 16-bit formatında montaj dosyaları değiştirin . </li><li> Mitoz farklı aşamalarında zamanını hesaplamak için, kromozomların ekvator (zaman profaz / prometafaz), çerçeveler hizalanır kadar kromozom tefrikine başlayana kadar t = 0 (DNA yoğuşma veya hücre yuvarlama ilk işareti), kare sayısını belirlemek (metafaz zaman), ve çerçeveler hücreleri (anafaz / telofaz / sitokinez) düzleştirmek için başlayana kadar. Her mitoz aşamasında hesaplanan zaman her kare arasındaki zaman aralığını bağlıdır. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> Şekil 1 tipik bir kontrol siRNA transfeksiyon deneyi histon H2B mCherry ifade HeLa hücre satırını kullanarak elde edilen sonuçları göstermektedir. Bu yöntem, mitotik zamanlama geç mitoz 1 zamanlaması nucleoporin Nup153 için beklenmedik bir rol açığa ölçmek için etkin olmuştur. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> .

<ol><li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li>
<li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li>
<li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li>
<li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC%2FC%28Cdc20%29+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li>
<li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li>
<li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li>
<li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li>
<li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li>
<li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li>
<li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li>
<li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li>
</ol>

Görüntüleme ve floresan protein teknolojisi son gelişmeler, canlı görüntüleme 2 hücresel analizi rutin bir özelliği haline gelmiştir. GFP, çeşitli (ve diğer renk çeşitleri 3) etiketli proteinlerin yaygın olarak kullanılabilir ya da inşa etmek nispeten kolay ve hücre bölünmesi işaretlerinden DNA / kromozom dinamikleri 4, 5, centrosome çoğaltılması 6, siklin B dinamikleri de dahil olmak üzere bir dizi izlemek için kullanılan olabilir 7, nükleer zarf arıza ve montajı 8, 9, mitotik iğsi oluşumu 10, ve 11 sitokinez çeşitli aşamalarında. Floresan etiketleri uyarma / emisyon spektrumları uyumlu Takip edilen proteinler, belirli olaylar arasında koordinasyon değerlendirilmelidir sağlayan tek başına veya birlikte olabilir. Büyük, mekansal ve / veya zamansal çözünürlük / istenirse, konfokal mikroskobu, lazer tarama, dönen disk, ya da rezonans tarama kullanılabilir olup olmadığını ve giderek artan çözünürlük ile gelişmiş mikroskopi seçenekleri listesi büyümeye devam ediyor. Memeli hücrelerinde mitoz Canlı görüntüleme de yüksek verimli RNAi ve küçük molekül ekranları 12-14 kullanım için adapte edilmiştir. Böylece, bu tekniği kullanarak ilk deneyler, nispeten basit olabilir iken, bu strateji üzerine inşa olanakları geniştir.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Lab Tek II Odacıklı Lam Camı (4 kuyucuklu)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>12-565-337</td><td>Ek odacık boyutları mevcuttur</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Sahne üstü hücre inkübatörü</td><td>OKO Lab</td><td></td><td>Herhangi bir uygun odacık kullanılabilir</td></tr><tr><td>Otomatik ters floresan mikroskobu</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Herhangi bir uygun mikroskop kullanılabilir</td></tr><tr><td>Yazılım paketi</td><td>Metamorph</td><td></td><td>Herhangi bir uygun yazılım kullanılabilir</td></tr></tbody></table>

zaman atlamalı görüntüleme sirna transfeksiyon sonra mitoz

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Genomik ve hücresel içeriği doğru miras sağlamak için hücresel organizasyonu ve mitoz sırasında oluşan kromozom dinamikleri değişiklikler sıkıca koordine edilmektedir. Hallmark mitoz kromozom hareketi gibi olaylar, GFP etiketli özel proteinleri ifade memeli hücre hatlarının zaman atlamalı floresan mikroskobu kullanarak bireysel bir hücre bazında kolayca takip edilebilir. RNAi tabanlı tükenmesi ile birlikte, bu belirli bir protein düzeyi düşürüldü sonra kusurları meydana gelen mitoz aşamasında saptayarak (ler) için güçlü bir yöntem olabilir. Bu protokol, mitoz zamanlaması üzerinde potansiyel bir mitotik düzenleyici protein tüketen etkisini değerlendirmek için basit bir yöntem mevcut. Hücreler, siRNA transfekte bir sahne üstü kuluçka odasına yerleştirilen ve otomatik bir floresan mikroskop kullanarak görüntülü. Biz nasıl hareketsiz görüntü montajı ya da film ya da yapmak için görüntüyü dizileri işlemek için zaman atlamalı bir deney, yazılımı kurmak için nasıl kullanılacağını tanımlamak, ölçmek ve ifade eden bir hücre hattı kullanarak mitotik aşamaları zamanlama nasıl analiz mCherry histon H2B etiketli. Sonuç olarak, zaman atlamalı bir deney tasarımı için önemli noktalar tartışacağız. Bu strateji, diğer yaklaşımlar tamamlayıcı ve hücre döngüsü, ilaç tedavileri ile senkronize etmek için gerek kalmadan bir nüfus ve mitoz 2) analizi gibi hücre bakarken gözlenen olmayabilir kinetiği) hassasiyeti 1 avantajlar sunuyor. Gibi görüntüleme deneylerinden elde edilen görsel bilgi sadece mitoz alt aşamalarda değerlendirilebilir sağlar, ama aynı zamanda FACS hücre döngüsü analizi ortaya olmazdı beklenmedik içgörü sağlayabilir.

İşte biz görüntüye bir temel protokolü açıklamak ve siRNA transfeksiyon sonra canlı memeli doku kültürü hücrelerinde mitoz zamanlama ölçmek.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Mitoz sırasında meydana gelen hücresel organizasyondaki ve kromozom dinamiklerindeki değişiklikler, genomik ve ... kalıtımının doğru şekilde gerçekleşmesini sağlamak için sıkı bir şekilde koordine edilir.

Mitoz sırasında meydana gelen hücresel organizasyon ve kromozom dinamiklerindeki değişiklikler, genomik ve hücresel içeriğin doğru şekilde aktarılmasını sağlamak için sıkı bir şekilde koordine edilir. Bu video makalesinde, mitozun karakteristik olaylarını takip etmeye yönelik bir yöntem gösterilmektedir. Kromozom hareketleri, floresan işaretli proteinler eksprese eden hücre hatları kullanılarak tekil hücre düzeyinde izlenmektedir.Mitotik proteinleri hedef alan siRNA ile transfeksiyon, zaman geçimli görüntüleme ile görselleştirilebilen ve görüntü analizi ile nicelleştirilebilen hücre döngüsü değişikliklerine yol açar. Merhaba, ben University of Utah'ın Huntsman Cancer Institute'undaki Katie Oman laboratuvarından Douglas Mackey. Bugün sizlere, siRNA transfeksiyonu sonrası canlı hücrelerin mitoz sürecindeki ilerleyişlerini görüntüleme prosedürünü göstereceğiz.İlgilenilen proteinlerin bozulmasının mitotik ilerleme zamanlaması üzerindeki etkilerini incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Her birine 0,5 milliliters fibronectin ekleyerek dört duvarlı lab tech iki odacıklı lameli hazırlayın.Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca inkübe edin. Bu sırada, ters transfeksiyon için irna ve lip RNAI max komplekslerini hazırlayın. Her bir bölme için üretici talimatlarına uygun olarak, 24 kuyucuklu bir plağın tek bir kuyucuğu için önerilen miktarı kullanın.15 dakika sonra, fibronektini bölmeli lam camının kuyucuklarından uzaklaştırın. Ardından, her kuyucuğa 100 mikrolitre siRNA kompleksleri ekleyin; her birine 500 mikrolitre içinde 20.000 hücre şeklinde paylaştırın. Hücreleri 24 saat boyunca inkübatörde bekletin.Ertesi gün transfeksiyon karışımını bir mililitre standart hücre kültürü ortamı ile değiştirin, ardından görüntüleme öncesinde hücreleri 24 saat daha inkübe edin. Görüntüleme düzeneği, ters mikroskobun tablasına yerleştirilen ve görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilen özelleştirilmiş bir hücre inkübatöründen oluşmaktadır. Görüntülemeye hazırlanmak için inkübatörün önceden ısıtıldığından ve dengelendiğinden emin olun.Ardından, inkübatörün kapağını açın ve hücreleri, hazne kapağı kapalı halde adaptöre yerleştirin. Sabitlemek için küçük bir miktar modelleme kili kullanın. Kapağı kapatın ve inkübatörün sıkıca yerleştiğinden emin olarak tüm inkübatörü mikroskop tablasına konumlandırın.Ardından, metamorph kullanarak, yazılımın menü çubuğundan apps multidimensional acquisition seçeneğini belirleyip deneyi kurun. Bu işlem, görüntüleme parametrelerinin seçilebileceği bir pencere açacaktır. Veri dosyalarının nereye kaydedileceğini belirtin.Ardından, dörtlü TX kuru faz kontrast objektifini kullanarak parlak alan ve m cherry dalga boylarını seçin, yazılım yardımıyla bir hücre alanına odaklanın ve otomatik odaklama fonksiyonunu yalnızca Parlak Alan kanalı için ayarlayın. Bu işlem, yazılımın her görüntüleme öncesinde her bir sahne konumunda otomatik odaklama yapmasını sağlayacaktır. İlk dalga boyu için, 50 milisaniyelik bir pozlama kullanarak bir görüntü yakalayın ve pozlama süresini kaliteli bir görüntü görmek için gereken minimum değere ayarlayın.Hücre canlılığının sürdürülmesini sağlamak için ışığa maruz kalma miktarını sınırlandırmak esastır. Genel bir kural olarak, bu durum aydınlatma şiddetini artırmak yerine, nötr yoğunluk filtresi ve daha uzun kamera pozlama süresi kullanılarak en iyi şekilde gerçekleştirilebilir.Bu işlemi diğer tüm dalga boyları için tekrarlayın. Ardından her kanal için pozlama süresini ayarlayın. Sonrasında, 15 sahne konumunda sekiz saat boyunca 15 dakikalık bir zaman atlamalı çekim aralığı belirleyin.Daha iyi bir zaman çözünürlüğü isteniyorsa, alımlar arasındaki zaman aralığını kısaltın. Ne kadar çok sahne konumu kullanılırsa, alımın o kadar uzun süreceğini unutmayın. Her zaman aralığında, hücre popülasyonunu yeterince örneklemek için uygun sayıda sahne konumunu seçin ve işaretleyin.Metamor, her bir veri toplama işlemi için konumları kaydedecek ve belirlenen konuma geri dönecektir. Zaman ayarlı dalga boyu pozlamasından sonra, zaman ve sahne konum bilgileri atanmıştır. Yazılımın ekipmanı uygun şekilde kontrol ettiğini doğrulamak için ekrandaki önizleme düğmesini seçin.Sistemin çalıştığından emin olduktan sonra, görüntüleme işlemini başlatmak için ekrandaki acquire butonunu seçin. Her şeyin düzgün çalıştığından emin olmak için otomasyonu en az bir tam görüntüleme döngüsü boyunca gözlemleyin. Ardından, işlemi bilgisayar ve mikroskobun gerçekleştirmesine izin verin.Verileri incelemek için, uygulamalar (apps) sekmesinden menü çubuğundaki çok boyutlu verileri incele (review multidimensional data) seçeneğini belirleyin, dosya konumu görünümünü seçin ve ardından bir sahne pozisyonu belirleyin. Bu pozisyondaki görüntü yığınını incelemek için görüntüleri yükle (load images) butonuna tıklayın. Görüntüler yüklendikten sonra, veri setinde kare kare ilerlemek için fareyi kullanın.Burada, Metamorph kullanılarak mitotik hücrelerin videoları oluşturulmuştur. Metamorph'ta bir video oluşturmak için stack make movie seçeneğini belirleyin. Menü çubuğundan hangi karelerin kullanılacağını, videonun hızını ve dosya türünü seçin.Ardından, bir montaj oluşturmak için kaydet seçeneğini belirleyin. İlk olarak, verileri metamorph programında .stk dosyası olarak kaydedin. Daha sonra ImageJ'i açın, .stk dosyasını ImageJ'de açın ve bölgeyi işaretleyip menü çubuğundan görüntü kırpma seçeneğini belirleyerek ilgilenilen bölgeyi kırpın.Ardından görüntü yığınlarını seçin. Montajı oluşturun; hangi karelerin dahil edileceğini, montajın boyutunu ve şeklini belirtin. Ayrıca kare sınırlarının istenip istenmediğini seçin.Ardından tamam'a tıklayın. Montajı bir .tiff dosyası olarak kaydedin. Son olarak, DNA kondansasyonunun veya hücre yuvarlaklaşmasının ilk belirtisinin görüldüğü kareyi T=0 profaz olarak belirleyerek, mitozun her bir aşamasındaki süreyi hesaplayın.Prometafaz, kromozomlar ekvatora dizildiğinde sona erer; ardından DNA ayrılmaya başlayana kadar metafaz devam eder, ardından anafaz ve telofaz gerçekleşir. Son olarak sitokinez gerçekleşir ve hücreler yassılaşmaya başlar. Histon eksprese eden hilar hücrelerin zaman atlamalı görüntülemesi.H iki BCFP gösterilmiştir. Bu hücreler kontrol irna ile transfekte edilmiş olup hücre döngüsünde normal şekilde ilerlemektedirler. Buna karşılık, nükleer por NUP 1 53'e yönelik siRNA'lar ile transfekte edilen hücrelerde MIT ilerlemesinde ciddi bozulmalar görülmektedir.Sizlere, bir transfeksiyon sonrası hücrelerin mitotik ilerleme zamanlamasını belirlemek için bir zaman serisi görüntüleme deneyinin nasıl kurulacağını, yürütüleceğini ve analiz edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, uygun sıcaklığı ve CO2 konsantrasyonlarını koruyarak ve hücrelerin maruz kaldığı ışık miktarını sınırlayarak, hücrelere mümkün olduğunca nazik davranmak önemlidir. Şimdilik bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

time-lapse-imaging-of-mitosis-after-sirna-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

FRET tabanlı gazetecilere giderek canlı hücre kinaz ve fosfataz aktiviteleri izlemek için kullanılır. Burada hedef fosforilasyon hücre döngüsü bağımlı değişiklikleri değerlendirmek için FRET tabanlı gazetecilere nasıl kullanılacağı hakkında bir metodu tanımlar.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

Kaynak: Daniele, F., et. al SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde Nörotransmitter Vezikül Dinamiklerini Değerlendirmek için TIRFM ve pH'a duyarlı GFP probları: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi. J. Vis. Uzm. (2015). Bu video, florofor etiketli sinaptik vezikülleri görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak insan nöroblastom hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Hücreler ilk olarak epifloresan modunda odaklanır. Daha sonra, zarın yakınındaki floroforları...

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Kullanılarak Hücre Görüntüleme

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Burada, hücre göç TIP60 tükenmiş MCF10A meme epitel hücreleri kullanarak bir yara iyileşmesi tahlil gerçek zamanlı izleme mevcut. Canlı hücre görüntüleme teknikleri bizim protokolündeki uygulanması bize analiz ve tek hücreli hareket içinde gerçek zaman ve zaman içinde görmenize olanak sağlar.

Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

Biz bir protokol yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu kullanılarak analiz tarafından takip HeLa hücreleri Çift Kişilik timidin eşitlenmesi için mevcut. Bu yöntem de interfaz işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri üzerinde çalışmalar etkinleştirme mitoz, zaman uyumlu olarak S faz geçin hücreleri çok sayıda elde anahtarıdır.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Protokol, mitokondriyal nükleoidlerin ticari olarak kullanılabilen DNA jeli lekesi ile özel etiketlemesini, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM) ile zaman atlamalı canlı etiketli hücrelerin zaman atlamalı serilerinin edinimini ve nükleoid hareketinin otomatik olarak izlenmesini açıklar.

Hızlandırılmış Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskomu için Mitokondriyal Nükleoidlerin Özel Etiketlemesi

Burada mil oluşumu ve mitotik progresyon dinamiklerini değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Hızlandırılmış görüntüleme uygulamamız, kullanıcının mitozbölünmenin çeşitli aşamalarındaki hücreleri belirlemesini, mitotik defektleri izlemesini ve tanımlamasını ve anti-mitotik ilaçlara maruz kalındığında mil dinamiği ve mitotik hücre kaderini analiz etmesini sağlar.

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Bu protokol, kromatin üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenmiş bir protein dimerizasyon sistemini göstermektedir.  Kimyasal dimerizatörlü telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer gövdesinin oluşumu gösterilmiştir. Damlacık büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşimi canlı hücre görüntüleme, immünofluoresans (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile izlenir.

Telomerlerde Kimyasal Dimerizasyona Bağlı Protein Kondensatları

Bu protokol, dna çift iplik kopmalarında transkripsiyonu tek molekül hassasiyetiyle tespit etmek için yeni bir muhabir gen sistemi ve deneysel kurulum sunar.

DNA Çift Telli Molalarda Transkripsiyonal Aktivitenin Canlı Hücre Görüntülemesi

Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Öğrenin, siRNA transfeksiyonu sonrası canlı memeli hücrelerde mitoz zamanlamasını görüntüleme ve nicelendirme yöntemini. Bu protokol, hücre döngüsü dinamiklerini ve mitotik proteinlerin işlevini incelemek için değerli bir araç sunar.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Daha fazla video keşfet