Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Mitoz sırasında meydana gelen hücresel organizasyon ve kromozom dinamiklerindeki değişiklikler, genomik ve hücresel içeriğin doğru kalıtımını sağlamak için sıkı bir şekilde koordine edilir. Bu video makalesinde, mitozun ayırt edici olaylarını izlemek için bir yöntem gösterilmektedir. Kromozom hareketi, floresan etiketli proteinleri ifade eden hücre hatları kullanılarak tek bir hücre bazında izlenir.

İRNA ile transfeksiyon, mitotik proteinlere yöneliktir, hızlandırılmış görüntüleme ile görselleştirilebilen ve görüntü analizi ile ölçülebilen hücre döngüsü değişikliklerine neden olur. Merhaba, ben Utah Üniversitesi Huntsman Kanser Enstitüsü'ndeki Katie Oman'ın laboratuvarından Douglas Mackey. Bugün size, SIA transfeksiyonunu takiben mitoz boyunca ilerlerken canlı hücreleri görüntülemek için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü, ilgilenilen proteinlerin bozulmasının mitotik ilerlemenin zamanlaması üzerindeki etkilerini incelemek için laboratuvarımızda kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Her birine 0,5 mililitre fibronektin ekleyerek dört duvarlı bir laboratuvar teknolojisi iki odacıklı bir kapak camı hazırlayın.

Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe edin. Bu arada, ters transfeksiyon için irna ve dudak RNAI max komplekslerini hazırlayın. Her oda için üreticinin talimatlarına göre, 24 kuyulu bir tabağın bir kuyusu için önerilen miktarı iyi kullanın.

15 dakika sonra, fibronektini odacıklı kapak camının kuyularından çıkarın. Daha sonra her bir kuyucuğa 100 mikrolitre irna kompleksi ekleyin, her birine 500 mikrolitrede 20.000 hücre ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirin.

Ertesi gün, transfeksiyon karışımını bir mililitre normal hücre kültürü ortamı ile değiştirin, ardından görüntü elde edilmeden önce hücreleri 24 saat daha inkübe edin. Görüntü elde etme kurulumu, görüntü elde etme yazılımı tarafından kontrol edilen ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına uyan özelleştirilmiş bir hücre inkübatöründen oluşur. Görüntü alımına hazırlanmak için, inkübatörün önceden uyarıldığından ve dengelendiğinden emin olun.

Ardından, inkübatörün kapağını açın ve hücreleri hazne kapağı kapalı olacak şekilde adaptöre yerleştirin. Yerinde tutmak için az miktarda modelleme kili kullanın. Kapağı kapatın ve inkübatörün sıkıca yerine oturduğundan emin olarak tüm inkübatörü mikroskop tablasına yerleştirin.

Ardından, metamorph kullanarak, yazılımın menü çubuğunda uygulamaların çok boyutlu alımını seçerek deneyi ayarlayın. Bu, görüntüleme parametrelerinin seçilebileceği bir pencere açacaktır. Veri dosyalarının nereye kaydedileceğini belirtin.

Ardından, dört TX kuru faz kontrast objektifini kullanarak parlak alan ve kiraz dalga boylarını seçin, yazılımı kullanarak bir hücre alanına odaklanın, otomatik odaklama işlevini yalnızca Brightfield kanalı için ayarlayın. Bu, yazılımın her alımdan önce her aşama konumunda otomatik odaklama yapmasına olanak tanır. İlk dalga boyu için bir görüntü yakalayın 50 milisaniyelik bir pozlama kullanarak, iyi bir görüntü görmek için pozlama süresini gereken minimuma ayarlayın.

Sürekli hücre canlılığını sağlamak için ışığa maruz kalma miktarını sınırlamak önemlidir. Genel bir kural olarak, bu en iyi şekilde nötr yoğunluk filtresi ve daha uzun bir kamera pozlama süresi kullanılarak elde edilebilir. Aydınlatma gücünü artırmak yerine.

Herhangi bir ek dalga boyu için bu prosedürü tekrarlayın. Ardından her kanal için pozlama süresini ayarlayın. Ardından, 15 aşama konumunda sekiz saat boyunca 15 dakikalık bir hızlandırılmış aralık belirleyin.

Daha iyi bir zaman çözünürlüğü isteniyorsa, alımlar arasındaki zaman aralığını kısaltın. Ne kadar çok sahne pozisyonu kullanılırsa, elde etmenin o kadar uzun süreceğini unutmayın. Her zaman aralığında, hücre popülasyonunu yeterince örneklemek için uygun sayıda aşama konumu seçin ve işaretleyin.

Metamor pozisyonları kaydedecek ve her satın alma için belirlenen yere geri dönecektir. Zaman atlamalı dalga boyu pozlamasından sonra, zaman ve sahne konumu bilgileri belirlenmiştir. Yazılımın ekipmanı uygun şekilde kontrol ettiğini onaylamak için ekrandaki önizleme düğmesini seçin.

Sistemin çalıştığından emin olduktan sonra, alıma başlamak için ekrandaki satın al düğmesini seçin. Her şeyin düzgün çalıştığından emin olmak için otomasyonu en az bir tam satın alma turu boyunca gözlemleyin. Sonra arkanıza yaslanın ve bilgisayarın ve mikroskobun işi yapmasına izin verin.

Verileri gözden geçirmek için uygulamaları seçin, menü çubuğunda çok boyutlu verileri gözden geçirin, dosya konumu görünümünü seçin, ardından bir sahne konumu seçin. Bu konumdaki görüntü yığınını incelemek için görüntüleri yükle'ye tıklayın. Görüntüler yüklendikten sonra, verilerde kare kare ilerlemek için fareyi kullanın.

Burada filmler, metamorf kullanılarak mitotik hücrelerden oluşturulur. Metamorph'ta bir film yapmak için yığın film yap'ı seçin. Menü çubuğunda, hangi karelerin kullanılacağını, filmin hızını ve dosya türünü seçin.

Ardından montaj yapmak için kaydet'i seçin. İlk olarak, verileri metamorf halinde bir nokta STK dosyası olarak kaydedin. Ardından J görüntüsünü açın J görüntüsünde nokta s stk dosyasını açın ve bölgeyi işaretleyerek ve menü çubuğunda görüntü kırpmayı seçerek ilgilenilen bir bölgeyi kırpın.

Ardından görüntü yığınlarını seçin. Montaj yap: Hangi karelerin ekleneceğini, montajın boyutunu ve şeklini belirtin. Ve çerçeve kenarlıkları arasında istenip istenmediği.

Sonra tamam'a basın. Montajı nokta tiff dosyası olarak kaydedin. Son olarak, mitozun her aşamasındaki zamanı hesaplayın, DNA yoğunlaşmasının veya hücre yuvarlamasının ilk belirtisinin belirgin olduğu çerçeveyi belirleyin, çünkü T sıfır faza eşittir.

Prometafaz, kromozomlar ekvatorda hizalandığında sona erer, metafaz daha sonra DNA anafaz telofazı ayırmaya başlayana kadar devam eder. Ve son olarak, sitokinez takip eder ve hücreler düzleşmeye başlar. Taşını ifade eden hiler hücrelerin hızlandırılmış görüntülemesi.

H iki BCFP gösterilir. Bu hücreler kontrol irna ile transfekte edildi ve hücre döngüsü boyunca normal olarak ilerledi. Buna karşılık, nükleer gözenekli NUP 1: 53'e yönelik siRNA'larla transfekte edilen hücreler, MIT ilerlemesindeki ciddi değişikliklerin yerini alır.

Az önce, bir transfeksiyonu takiben hücrelerin mitotik ilerlemesinin zamanlamasını belirlemek için hızlandırılmış bir görüntüleme deneyini nasıl kuracağınızı, çalıştıracağınızı ve analiz edeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken, uygun sıcaklık ve CO2 konsantrasyonlarını koruyarak ve hücrelerin maruz kaldığı ışık miktarını sınırlayarak hücrelere mümkün olduğunca nazik davranmak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.