Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Plastik bölümleri, parafine gömülü ya da dondurulmuş bölümleri daha birçok doku türleri için bu yöntem daha kullanışlı hale getirmek, floresan sekonder antikor ile boyanmış doku ince bölümlerde gerçek doku morfolojisi korumak. Bu video boyama, plastik gömme ve kesit yöntemi gösterilmiştir.

Merhaba, benim adım Sochi ota. Kaliforniya Üniversitesi Gelişim ve Hücre Biyolojisi Bölümü'nde Dr.Ken Cho'nun laboratuvarında doktora sonrası bilim insanıyım. Irv I Bugün size xenopus embriyosunun basit bölümünün hazırlanışını göstereceğim.

Bu prosedür, geç gaz evresi kurbağa embriyosunun ilgilenilen moleküle karşı antikor ile boyanmasını, plastiğe sızmasını ve beş mikron aynı plastik kesiti oluşturmasını içerir. Bu prosedür, immünofloresan immünohistokimyasını veya çok yüksek çözünürlüklü görüntü ile in situ hibridizasyonun incelenmesi için kullanılabilir. Tamam, bunlar 10 artı embriyonun embriyo plastik kesiti için kullandığım küçük kullanışlı araçlar.

Bu delta uçlu metal bir cımbız ve bu, bir numara, bu embriyoyu plastikte yönlendirmek için kullanılabilir. Ve ikincisi, bu, embriyoyu mikrotomdan montaj yüzeyine aktarmak için bu boya fırçası ile birlikte kullanılabilir. Bu, slaytın yüzeyine koyduğum ve plastik kesitli embriyo dilimlerini monte edebileceğim bir su çekme işlemi yapan silikon kauçuk bir yalıtkan.

Şimdi embriyonun nasıl ikiye bölüneceğini, nstitute hibridizasyon veya immünofloresan tespiti gibi tahlil için sabit embriyoyu gösteriyorum. Ve embriyoyu yarıya indirmek için, marketten satın alabileceğiniz bu çok ultra ince çöl ızgarasını kullanıyorum. Bence evet, hücreyi bir gecede %3.7 oranında sabitleyen sabit embriyolar var.

Ve bu, onu nasıl düzelttiğinizin amaca bağlı olduğudur. Bu bir gecede düzeltildi. İnsizyon hibridizasyonunun amacı için, gece boyunca fiksasyona gidebilirsiniz, ancak embriyonun içindeki proteini tespit ettiğiniz immünofloresan tespiti için çok uzun bir fiksasyon önermedim.

Ve proteinin hücre altı lokalizasyonu üzerindeki etkiyi en aza indirmek ve ayrıca tespit adımı sırasında antikorun güzel bir şekilde nüfuz etmesine izin vermek için aşırı fiksasyondan kaçınmak için sadece iki saat boyunca% 3.7 form yükseklik fiksasyonunu yapmayı tercih ediyorum. Tamam, şimdi bu embriyoyu sağ ve sol tarafı keserek patlama duvarından inceliyorum. Şimdi görüyorum ki bu, PO'nun dorsal taraftan ventral tarafa kadar olduğu 11. evre embriyoya sahip, ancak bi bir embriyo

Ve bu sağ el parçasına bir göz atalım. Blast po'yu hem dorsal tarafta hem de ventral tarafta görürsünüz, ancak dorsal taraf açıktır çünkü bu istila, ventral tarafa kıyasla embriyonun en derinine, en derinlerine ulaşmaktadır. Yani bu iyi bir parça, hem dorsal hem de ventral tarafı incelemek için iyi ikiye bölünmüş bir parça.

Embriyonun içinde, bu parçalanmış embriyo, embriyonun içinde ifade edilen proteinin immünofloresan tespitini kullanacağım. Ve immünofloresan veya immünohistokimya için, tespit için antikora özgü antikor kullanırsınız. Ancak sorun şu ki, antikor embriyonun içine çok iyi nüfuz etmiyor.

Yani eğer tam montaj, tam montaj embriyosu kullanırsanız, bilemezsiniz. Embriyodaki proteinlerinizin ekspresyon modelini inceleyemezsiniz. Ancak bu önceden ikiye bölünmüş embriyoyu kullanarak, embriyonun derinliklerindeki hücrede ifade modelinin ne olduğunu inceleyebilirsiniz.

Ah, leke lekeli embriyo zaten etanolde kurutulmuş% 3.7 Formaldehit içinde sabitlenmiş ve tekno 7, 100 olarak adlandırılan plastiğe sızmıştır. Ve bu kit, bu ana kısım sıvı ve sertleştirici olarak adlandırılan bu toz olmak üzere üç parça içerir. Ve bu sıvıya sertleştirici iki denir.

Önce bu ana parçayı karıştırıyorum ve sertleştiriciyi 100'e bir reio ile karıştırıyorum, bu size bu sızma karışımını verecek. Ve işte olan bu, bu bir sıvı, benim bu embriyoya sızdığım. Ve bu hala sıvıdır, bu yüzden henüz sertleşmeyecek.

Ve bu, embriyo örneğinin bu plastikte tamamen özetlendiğinden emin olmak için gece boyunca bu sızma karışımında bırakılan embriyo örneğidir. Şimdi bu örnek embriyoyu transfer pipeti ile alıyorum ve gömme kalıbı olarak kullandığım ince duvarlı 0.5 MPCL tüpüne aktarıyorum. Sonra bu embriyodan fazla sıvıyı çıkarıyorum.

Ve şimdi bu embriyo, bu embriyo zaten sertleşen plastiğe gömülmeye hazır. Sertleşen plastiği yapmak için, bu sızma karışımını bu sertleştirme tüpü ile 15'e bir oranında karıştırırsınız. Örneğin, tüpü desteklemek için bu sızma karışımından 750 mikrolitre alırsam, o zaman plastiğin polimerizasyonunu başlattıktan sonra bu sertleştiriciden de 50 mikrolitre eklemem gerekiyor, oops, kapağı kapatın ve sonra bu şekilde hafifçe karıştırın.

Ve girdap yapmamalısınız çünkü oksijen polimerizasyon reaksiyonunun inhibitörüdür. Bu karışımdan yaklaşık 250 mikrolitre embriyoya ekleyin. Ve bu polimerizasyon adımı, yapmanız gerekenden neredeyse dört saat sürüyor, hiç acele etmenize gerek yok.

Önce bu polimerize plastiği ekledikten sonra, embriyonun plastiğin içinde yüzmesini sağlamak için yukarı ve aşağı sıkabilirsiniz. Ve şimdi bu metal cımbızı alıyorum ve embriyonun etrafını itiyorum ve embriyonun kesici yüzeyi bu gömme kalıbın dibine gelecek şekilde yönlendiriyorum. Daha sonra kapağı kapatın çünkü oksijen kürleme reaksiyonunun bir inhibitörüdür ve izasyon reaksiyonuna izin vermek için dört saat bekletin.

Bundan sonra, bu zaten örnekte sürülen bir HUD'dur. Bu numuneye bir tür yapıştırıcı sürdünüz, böylece bu plastik sert parçanın bu kalıptan çıkmayacağından emin olmak için. Bu, tekno 30 40 adı verilen bu amaç için yapıştırıcı görevi gören başka bir plastik.

Ve bu tozu ve sıvıyı 2, 2, 1 ile karıştırıyorum, burada bu tozun 0.6 gramı var. Bu yüzden bu sıvıdan 300 mikrolitre ekleyeceğim, sonra hızlıca karıştıracağım ve bu plastik oldukça hızlı bir şekilde sertleşiyor. Yani bu bir parça, biraz sert olmanız gerekiyor, sonra bunu zaten duymuş olan bu örneğe dökün.

Bu yeterince iyi. Kapağı kapatın. Ben böyle görünüyorum.

Ve bunun zorlaşması yaklaşık 30 ila 60 dakika sürecektir. Ve bu, harekete geçmeye hazır olandır. Önce kalıbın ucunu karton bıçakla kesiyorum, bu uç kısmını bu kalıptan sıyırıyorum.

Şimdi bu gömülü embriyo ortaya çıkıyor. Ve ayrıca bu kapağı kestim çünkü ona ihtiyacım yok. Şimdi bu tain Roy iğnesini alıyorum, yani paren kesitleme için kullanılan normal leke bıçağından daha sert olan iğne tain Roy bıçağı değil.

Temizlemek için bunu kısaca Xin'e batırıyorum. Bunu şu şekilde ayarlayın, bunu bıçak tutucuya ayarlayın ve fazla zaini silin. Ve bazen bu alanı da zaine ile temizliyorum çünkü bu alanın temizliği kesinlikle önemli.

Şimdi bölümlere ayırmaya hazır. Bölümlere ayırmaya başlamadan önce montaj odasını kurdum. İşte bu sürgülü cam.

Ve bunun üzerine bu silikon kauçuğu koyuyorum ve çiftçiyi sonuna kadar itiyorum ki herhangi bir sızıntı olmasın, herhangi bir sızıntı olmasın. Ve bunu kaydırak ısıtıcısına koyun ve havuzumuzu yapmak için bu temiz şifalı suyu dökün. Ve taşkın yüzey suyu yüzeyini elde edene kadar elde etmek için su kadar koyun.

Ve bu önemlidir, çünkü bu taşkın suyu yüzeyi, suyun yüzey geriliminin eşit dağılımını sağlar, bu da bölümün eşit şekilde uzamasını sağlamak için önemlidir. Şimdi seksiyon yapıyorum ama bunu yapmadan önce bu maskeyi takıyorum çünkü her bir kesit parçası çok hafif, çok hafif ve göğsüm sahneden uçup gidebiliyor. Bu yüzden bu maskeyi takıyorum.

Ve şimdi bölümlere ayırmaya başlayın. Sahnede bir miktar kesit parçası elde ettikten sonra, bunu boya fırçasıyla alıyorsunuz ve yavaşça bu dağ odasının üstüne çıkıyorsunuz ve bu boya fırçasını vurarak bu parçanın yerçekimi ile suya girmesini sağlıyorsunuz. Ve suya iner inmez, su yüzeyinde dairesel bir parça oluşturacak şekilde uzanırlar.

Gece boyunca kuruduktan sonra bu ışık nasıl? Şimdi şuna ve buna benziyor. Artık numune, nükleer DNA için DPI ile temasa geçmeye hazırdır.

Ve sonra mikroskop altında çalışabilirsiniz. Bugün size geç gaz evreli kurbağa embriyosu kullanılarak plastik kesit hazırlığını gösterdim. Bu prosedür, paren gömme tekniği kullanılarak çalışılamayan proteinin alt hücresini veya lokalizasyonunu incelemek için oldukça yararlıdır ve ayrıca bu genel olarak artık hibridizasyon için bile geçerlidir.

Bu plastik bölüm aynı zamanda artık hibridizasyon için bile size sağlar, bu prosedür size paren veya donmuş kesit örneğinden çok daha yüksek düzeyde görüntü verebilir.