Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Merhaba, benim adım Sochi ota. California Üniversitesi'ndeki Gelişimsel ve Hücre Biyolojisi Bölümü'nde, Dr. Ken Cho'nun laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Bugün sizlere xenopus embriyosunun basit kesit hazırlama işlemini göstereceğim.

Bu prosedür, geç gaz evresindeki kurbağa embriyosunun ikiye bölünmesini, ilgili moleküle karşı antikorla boyanmasını, plastiğe sızdırılmasını ve beş mikron kalınlığında aynı plastik kesitlerin alınmasını içerir. Bu prosedür, çok yüksek çözünürlüklü görüntülerle immunofloresan immünohistokimya veya in situ hibridizasyon çalışmalarında kullanılabilir. Tamam, bunlar 10'dan fazla embriyonun plastik kesitlenmesi için kullandığım küçük, kullanışlı araçlardır.

Bu, delta uçlu bir metal penset olup birincisi, embriyoyu plastikte yönlendirmek için kullanılabilir. İkincisi ise, embriyoyu mikrotomdan montaj yüzeyine aktarmak için bu boya fırçasıyla birlikte kullanılabilir. Bu, lam yüzeyine yerleştirdiğim ve plastik kesitli embriyo dilimlerini monte edebileceğim bir su havuzu oluşturan silikon kauçuk bir izolatördür.

Şimdi, in situ hibridizasyon veya immünofloresan saptama gibi analizler için fikse edilmiş embriyonun nasıl ikiye bölündüğünü gösteriyorum. Embriyoyu yarıya kesmek için marketlerden satın alabileceğiniz şu çok ultra ince plastik ızgarayı kullanıyorum. Sanırım evet, embriyolar gece boyunca %3,7 formaldehit ile fikse edildi.

Ve işte böyle; bunu nasıl sabitleyeceğiniz amacınıza bağlıdır. Bu örnek gece boyunca sabitlenmiştir. Yerinde hibridizasyon amacıyla gece boyu sabitleme yapabilirsiniz, ancak embriyo içindeki proteini tespit ettiğiniz immünofloresan saptama için çok uzun süreli sabitleme önermiyorum.

Proteinlerin hücre altı lokalizasyonu üzerindeki etkiyi en aza indirmek ve ayrıca saptama aşamasında antikorun güzel bir şekilde nüfuz etmesini sağlamak için aşırı fiksasyondan kaçınmak amacıyla, %3,7 formaldehit fiksasyonunu sadece iki saat boyunca yapmayı tercih ediyorum. Tamam, şimdi bu embriyoyu blast duvarını sol ve sağ taraftan keserek diseke ediyorum. Şu an gördüğüm kadarıyla, bu, PO'nun dorsal taraftan ventral tarafa kadar uzandığı evre 11'de bir embriyo.

Şimdi şu sağdaki parçaya bir bakalım. Hem dorsal hem de ventral tarafta blastoporu görebilirsiniz, ancak ventral tarafa kıyasla bu invajinasyonun embriyonun çok daha derinlerine doğru ilerlemesi nedeniyle dorsal taraf belirgindir. Bu nedenle, hem dorsal hem de ventral tarafı incelemek için uygun, iyi ikiye bölünmüş bir parçadır.

Embriyonun içerisinde, bu diseke edilmiş embriyoda, embriyo içerisinde eksprese edilen proteinin immünofloresan saptamasını gerçekleştireceğim. İmmünofloresan veya immünohistokimya için saptama amacıyla spesifik antikor kullanılır. Ancak sorun, antikorun embriyonun iç kısımlarına çok iyi nüfuz etmemesidir.

Dolayısıyla, bütün montajlı embriyo kullanırsanız, bunu bilemezsiniz. Proteinlerinizin embriyodaki ekspresyon paternini inceleyemezsiniz. Ancak bu önceden ikiye bölünmüş embriyoyu kullanarak, embriyonun derinliklerindeki hücrelerdeki ekspresyon paternini inceleyebilirsiniz.

Ah, stain ile boyanmış embriyo önceden %3,7 Formaldehit ile fikse edilmiş, etanoldeydehidre edilmiş ve Techno 7, 100 olarak adlandırılan plastiğe infiltre edilmiştir. Bu kit; ana sıvı kısım, sertleştirici bir (hardener one) olarak adlandırılan toz ve sertleştirici iki (hardener two) olarak adlandırılan sıvı olmak üzere üç bölümden oluşmaktadır.

İlk olarak, bu ana kısmı ve sertleştiriciyi 100'e 1 oranında karıştırıyorum; bu işlem infiltrasyon karışımını oluşturacaktır. Embriyoyu infiltre ettiğim sıvı budur. Henüz sıvı formda olduğu için henüz sertleşmeyecektir.

Ardından, embriyo örneklerinin bu plastik materyal ile tamamen çevrelendiğinden emin olmak için örnekler bu infiltrasyon karışımında gece boyunca bekletilir. Şimdi, transfer pipeti ile embriyo örneklerinden birini alıyorum ve gömme kalıbı olarak kullandığım ince duvarlı 0,5 mL'lik PCT tüpüne aktarıyorum. Daha sonra, embriyo üzerindeki fazla sıvıyı uzaklaştırıyorum.

Ve şimdi bu embriyo, sertleştirici plastiğe gömülmeye hazır durumdadır. Sertleştirici plastiği hazırlamak için, bu infiltrasyon karışımını sertleştirici tüp ile 15'e 1 oranında karıştırırsınız. Örneğin, bu infiltrasyon karışımından 750 µL alırsam, plastiğin polimerizasyonunu başlatmak için 50 µL sertleştirici eklemem gerekir; ekledikten sonra kapağı kapatıp bu şekilde nazikçe karıştırın.

Oksijen, polimerizasyon reaksiyonunun inhibitörü olduğundan vorteks yapmamalısınız. Bu karışımdan yaklaşık 250 µL embriyoya ekleyin. Bu polimerizasyon aşaması yaklaşık dört saat sürer, dolayısıyla hiç acele etmenize gerek yoktur.

Önce bu polimerize olan plastiği ekledikten sonra, embriyonun plastiğin içinde yüzmesini sağlamak için plastiği yukarı ve aşağı doğru borulayabilirsiniz. Şimdi, embriyoyu yönlendirmek ve embriyonun kesit yüzeyi bu gömme kalıbının altına gelecek şekilde konumlandırmak için bu kaplamalı metal cımbızı kullanıyorum. Ardından, oksijen kürlenme reaksiyonunu inhibe ettiği için kapağı kapatın ve polimerizasyon reaksiyonunun gerçekleşmesi için dört saat boyunca bekletin.

Bundan sonra, bu, numunede zaten yer alan bir HUD'dur. Plastik sert parçanın bu kalıptan çıkmadığından emin olmak için numuneye bir tür yapıştırıcı sürersiniz. Bu, bu amaçla yapıştırıcı olarak görev yapan, techno 30 40 adı verilen başka bir plastiktir.

Şimdi bu tozu ve sıvıyı 2, 2, 1 oranında karıştırıyorum; burada 0.6 gram toz var. Bu yüzden 300 µL sıvı ekleyeceğim, ardından hızlıca karıştıracağım; bu plastik oldukça çabuk sertleşiyor. Bu bir aşama, biraz hızlı olmanız gerekir, ardından bunu önceden sertleşmiş örneğin üzerine dökün.

Bu kadarı yeterli. Kapağı kapatın. Görüntü şu şekildedir.

Ve sertleşmesi yaklaşık 30 ila 60 dakika sürecektir. İşlem için hazır olan örnek budur. İlk olarak, kalıbın ucunu maket bıçağı ile kesip bu uç kısmını kalıptan soyup çıkarıyorum.

Böylece gömülü embriyo açığa çıkmış oldu. Ayrıca, ihtiyacım olmadığı için bu kapağı kestim. Şimdi, parafin kesit alma işlemlerinde kullanılan standart bıçaklardan daha sert olan bu tain Roy bıçağını alıyorum.

Temizlemek için bunu kısaca Ksilen'e batırıyorum. Bunu bıçak tutucuya yerleştiriyorum ve fazla Ksilen'i siliyorum. Ayrıca, bu bölgenin temizliği kesinlikle önemli olduğu için bazen burayı da Ksilen ile temizliyorum.

Artık kesit alma işlemi için hazırdır. Kesit almaya başlamadan önce, montaj haznesini kuruyorum. Bu bir lam camıdır.

Bunun üzerine bu silikon kauçuğu yerleştiriyorum ve herhangi bir sızıntı olmayacak şekilde her yere iyice bastırıyorum. Bunu lam ısıtıcısına yerleştirip havuzumuzu oluşturmak için temiz distile su döküyorum. Su yüzeyinin taşma seviyesine gelene kadar su ekleyin.

Bu durum önemlidir çünkü bu taşma suyu yüzeyi, suyun yüzey geriliminin eşit dağılımını sağlar; bu da kesitin eşit şekilde genişlemesi için kritiktir. Şimdi kesit alma işlemine geçiyorum, ancak bunu yapmadan önce bu maskeyi takıyorum çünkü her bir kesit parçası çok hafif, o kadar hafiftir ki nefesimle sahneden uçup gidebilirler. Bu yüzden bu maskeyi kullanıyorum.

Şimdi kesme işlemine başlayın. Lam üzerine belirli sayıda kesit parçası elde ettikten sonra, bir boya fırçasıyla bu parçaları alın ve yavaşça su haznesinin üzerine taşıyıp, yerçekimi yardımıyla parçaların suyun içine girmelerini sağlamak için fırçaya hafifçe vurun. Parçalar suyun yüzeyine değer değmez, su yüzeyinde dairesel bir form oluşturacak şekilde genişlerler.

Gece boyu kurutma işleminden sonra ışık nasıl? Şimdi şuna ve şuna benziyor. Artık numune, nükleer DNA için DPI ile temas ettirilmeye hazırdır.

Ardından mikroskop altında inceleme yapabilirsiniz. Bugün size geç gaz evresindeki kurbağa embriyosu kullanarak plastik kesit hazırlama işlemini gösterdim. Bu prosedür, parafin gömme tekniği ile çalışılamayan hücre altı yapıların veya protein lokalizasyonunun incelenmesi ve genel olarak in situ hibridizasyon çalışmaları için oldukça kullanışlıdır.

Bu plastik kesit yöntemi, rezidüel hibridizasyon için bile size parafin veya dondurulmuş kesit örneklerinden çok daha yüksek düzeyde görüntüler sağlayabilir.