Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Aşağıdaki deneyin genel amacı, canlı bir zebra balığı embriyosunda, kimyasal olarak kafeslenmiş floresan boya gibi belirli bir ışığa duyarlı ajanı tek hücre çözünürlüğünde fotoaktive etmektir. Bu işlem, ilgilenilen hücreleri konumlandırmak ve hassas bir şekilde hedeflemek için canlı bir genetik işaretleyici ifade eden tek hücre evresindeki embriyolara ışığa duyarlı bir ajan enjekte edilerek gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak embriyolar büyütülür ve canlı embriyoyu hareketsiz kılan, düşük erime noktalı bir agar içerisine yerleştirilir.

Ardından, görünür floresan transgenik bir işaretçiyi lokalize etmek için iki foton mikroskobisi kullanılır. Daha sonra, ışığa duyarlı ajan istenen bir odak düzleminde aktive edilir ve fotoaktivasyonun boyutu izlenir. Sonuç olarak etiketlenen hücrelerin akıbeti, daha sonraki embriyonik evrelerde takip edilebilir.

Bu prosedür, canlı örneklerde tek hücre çözünürlüğünde çeşitli bileşiklerin aktivasyonu için kullanılabilir. Bu tekniğin konfokal mikroskopi veya flaş lamba gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nispeten düşük fototoksisite ile aksiyel düzeyde birkaç mikronluk derinlikteki dokuların fotoaktivasyonuna olanak tanımasıdır. Burada sunulan yöntem selin kenar izleme için kullanılmaktadır ve çeşitli bileşenlerin fotoaktivasyonu için uygulanabilir; bu da gelişimsel ve fizyolojik süreçler üzerinde hedeflenmiş kontrol sağlar. Enjeksiyondan önceki akşam, görünür bir floresan işaretleyici eksprese eden transgenik bir hattın erkek ve dişi zebrafishlerini ayırarak çiftleşme tanklarını hazırlayın.

Bu deneyde, transgenik hat, nörojenik N1 promotörünün kontrolü altında GFP eksprese eder. 0,2 molar potasyum klorür içindeki %5'lik dekstran konjuge kafesli floresein stokundan bir alikotu buz üzerinde çözün. Kafesli floreseini, 0,2 molar potasyum klorür ile %1 son konsantrasyona kadar seyreltin. Floreseini buz üzerinde tutun ve ışıktan koruyun. Zebra balığı çiftleşmelerinin gerçekleşmesini sağlayın; döllemiş yumurtaları bırakılır bırakılmaz toplayın ve metinde açıklandığı şekilde durulayın. Bir plastik pipet kullanarak, tek hücre evresindeki embriyoları, bir diseksiyon mikroskobu altında taze E3 medyumu ile kaplanmış %1'lik agaros enjeksiyon plakasına aktarın.

Embriyoları enjeksiyon oluklarında yönlendirmek için pipet kullanın. Uzun bir konik uç oluşturacak şekilde çekilmiş bir kapiler enjeksiyon iğnesinin ucunu kırın. İğneyi yaklaşık bir mikrolitre %1 caged fluorescein ile doldurmak için bir mikro yükleyici uç kullanın.

Yüklü iğneyi, pnömatik bir mikro enjektöre bağlı bir mikro manipülatörün içine yerleştirin. Her bir embriyonun sitoplazmasına doğrudan iki ila üç nanolitre kafesli floresein enjekte edin. Deney başına en az 50 embriyoya enjeksiyon yapın.

Enjekte edilen embriyoları taze E three ortamı içeren bir Petri kabına aktarın ve istenilen gelişim evresine gelene kadar 28,5 °C'de karanlıkta inkübe edin; pigmentasyonu önlemek için 24. saatte embriyolara %0,1 Phenyl threa uygulayarak embriyo montajına hazırlayın. 15 ila 20 adet 60 mm'lik Petri kabını, taze E two ortamında çözünmüş %1 Aros ile ince bir tabaka halinde kaplayın; aros katılaştığında, kabı bir diseksiyon mikroskobu altında E two ortamı ile doldurun.

Enjekte edilen embriyoları kaplanmış plaklara yerleştirmek için ince uçlu pens kullanın. Embriyoların havayla temas etmesinden kaçının. Suda çözünmüş %2 düşük erime noktalı agarosun bir alikotunu hazır bulundurun.

72 °C sıcaklıktaki bir ısıtma bloğunda. Ateşte cilalanmış bir past pipette kullanarak, yaklaşık 150 µL besiyerindeki tek bir kaplı embriyoyu 60 mm'lik bir petri kabına aktarın. Embriyonun yanına benzer hacimde %2'lik Agros yerleştirin ve homojen bir %1'lik Agros damlacığı elde etmek için iki damlacığı hızla birbirine karıştırın.

Embriyoyu, dorsal tarafı objektif lensine bakacak şekilde yönlendirin. Agarın katılaşmasını bekleyin ve gömülü embriyoyu E2 ortamına daldırın. Yeni monte edilmiş embriyoyu, geniş bantlı döner tabla lazerle donatılmış bir iki foton mikroskobu altında, bir plaka tutucuya yerleştirin.

Foto aktivasyon işlemine başlamadan önce, ekspresyon gösteren dokunun en ventral kenarından dorsal kenarına kadar 860 nanometre dalga boyunda bir görüntü serisi elde edin. Görüntüleri Z düzleminde altı mikron aralıklarla alın. Foto aktivasyon için hedef Z düzlemini seçin ve GFP'yi referans noktası olarak kullanarak odaklayın.

İlgi bölgesini belirleyin. 860 nanometrede tek bir görüntü alın ve uygun hizalama için bu görüntüyü ayrı bir pencerede açık tutun. Edit bleach menüsünü açmadan önce 720 nanometredeki lazerin mod kilitlemeli durumda olması kritik öneme sahiptir.

Fotoaktivasyon için ilgi alanı veya ROI'yi belirlemek amacıyla 860 nanometrede çekilen görüntüyü kullanın. "Edit bleach" penceresinde, göreceli lazer gücünü, iterasyon sayısını ve tarama hızını ayarlayın. Fotoaktivasyon için, lazer durduğunda "bleach" düğmesine basın, tekrar 860 nanometreye geçin ve ortaya çıkan fotoaktive materyalin yoğunluğunu değerlendirmek için tek düzlemli bir görüntü edinin.

Aktive edilen alanın zsan değerini veya kalınlığını değerlendirmek için bir görüntü yığını toplayın. Bu sayede, lazer yoğunluğu ve pozlama süresi ampirik olarak belirlenebilir. Her bir klonun veya çapraz fotoğrafın optimal fotoaktivasyonu için deneyde kalan tüm embriyoları aktive edin.

Bu koşulları kullanarak, monte edilmiş foto-aktive embriyoları, %0.1 Phenyl thio urea içeren E iki ortamında, istenilen gelişim evresine ulaşana kadar 28.5 °C'de karanlıkta büyütün. Bir diseksiyon mikroskobu altında, monte edilmiş embriyonun yakınındaki koryona, çentiğin tabanı embriyonun başına bakacak şekilde sivri bir skalpel ile V şeklinde bir çentik açın. Kapalı bir pens setini çentiğin noktasına yerleştirin.

Embriyo boyunca koryonu ayırarak forsepsi nazikçe açın ve embriyoyu ortama bırakın. Her bir embriyoyu bıraktıktan sonra, embriyoyu bir mikro santrifüj tüpüne toplamak için alevle cilalanmış bir pastoral pipet kullanın. Kimyasal çeker ocakta, embriyoları üç saat boyunca %4 formaldehit ile sabitleyin.

Oda sıcaklığında; beraberindeki metinde açıklandığı şekildedehidratasyon, rehidratasyon, konjuge anti-florescein ile alkalin fosfataz boyama ve tüm ilgili yıkama işlemlerini gerçekleştirin. Embriyolara 500 µL filtrelenmiş fast red çözeltisi ekleyin. İstenilen sinyal-arka plan oranına ulaşıncaya kadar, her saat başı yeni fast red boyama çözeltisi ekleyerek oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin.

Boyama reaksiyonunu, beşer dakikalık üç PBST yıkamasıyla durdurun. Çeker ocakta, boyayı %4 formaldehit ile 20 dakika boyunca sabitleyin. Beşer dakikalık iki kez PBST ile yıkayın.

Şeffaf embriyoları, her bir embriyo tüpün dibine çökerene kadar PBS içindeki %25, %50 ve %75'lik gliserol gradyanları serisi ile yıkayın. Embriyoları, mikroskop altında görüntülemeye hazır olana kadar 4 °C'de saklayın. Embriyoları görüntüleme için sabitlemek amacıyla, bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, bir mikroskop lamı üzerine 15 mm'lik kare bir şeklin köşelerine dört adet 20 µL şeffaf silikon gres damlası uygulayın.

Bir embriyoyu, gres damlacıkları arasına yaklaşık 200 µL %75 gliserol içerisine yerleştirin. Embriyonun üzerine bir lamelles yerleştirin. Gliserol çözeltisi boşlukları doldurana kadar lamelles'i yavaşça düz bir şekilde aşağı doğru itin.

Gresle monte edilmiş embriyoların damlaları arasındaki boşluklar, konfokal mikroskopi ile görüntülemeden önce dört derece Celsius'ta birkaç gün boyunca saklanabilir. Bu görüntü, neurogenin bir promotörünün kontrolünde GFP eksprese eden canlı bir zebra balığı embriyosunu göstermektedir; embriyo, önceki yöntem kullanılarak tek hücre aşamasında kafesli floresein izleyici boya ile enjekte edilmiş olup üç ila beş somit aşamasındadır.

Beyin primordialinin dört farklı bölgesinden bir alanı iki foton lazeri ile fotoaktive edilmiş ve kafesi açılmış floresein izleyici boya tespit edilebilmiştir. Fotoaktivasyon prosedürünü takiben embriyo 28,5 °C'de inkübe edilmiş ve kafesi açılmış floresein içeren beyin hücreleri, döllenmeden 24 saat sonra anti-floresein immünboyama ile kırmızı renkte izlenmiştir. İşaretlenen hücre sayısının az olduğuna dikkat ediniz. Fotoaktivasyon prosedüründe uzmanlaşıldığında, işlem sadece birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, tek hücre çözünürlüğünde hassas fotoaktivasyona olanak tanıyan optimal parametrelerin kontrol edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.