Name: Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Öğrenin, canlı zebra balığı embriyolarında iki foton mikroskobisi ile tek hücre çözünürlüğünde fotoaktivasyon yapmayı. Bu yöntem, gelişim biyolojisi ve hücre kaderi izleme çalışmaları için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uwe Strahle ve nazik neurogenin1 muhabir hattı sağlamak için; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz ve teknik danışmanlık ve yardım için iki foton uncaging ile Leonid Roitman;; Maayan Tahor ve teknik yardım için Suliman Elsadin sayesinde şekil grafik genia Brodsky nedeniyle Bu yazının yorumları için Amos Gutnick. İsrail Bilim Vakfı (hibe sayısı 928/08) ve Harriet &amp; Marcel Dekker Vakfı; Levkowitz laboratuarında araştırma Alman-İsrail Vakfı (hibe sayısı 183/2007) tarafından desteklenmektedir. GL Biyomedikal Araştırma Tauro Kariyer Geliştirme Başkanı bir görevdeki.

Biz kafesli floresein kullanarak hücre etiketleme bir protokol tanımlayan, ancak diğer fotoğraf devreye sokulabilir boyalar ve proteinlerin aynı şekilde kullanılan olabilir. 1. Kafesli Floresein enjeksiyon <ol><li> Dextran-konjuge 4,5-dimetoksi 2-nitrobenzyl floresein (DMNB) (10.000 MW dekstran, anyonik, Invitrogen, moleküler problar, Carlsbad, CA kafesli% 5 stok solüsyonu hazırlayın (5mg kafesli floresein / 100 mcL 0,2 M KCl) , kedi yok. D-3310). -20 ° C'de kısım ve mağaza DMNB-kafesli floresein ışığa duyarlı ve karanlıkta tutulması gerektiğini unutmayın. </li><li> "Zebra balığı kitap" 1 açıklandığı gibi% 1 agaroz (Sigma, St Louis, MO, kedi hayır. A9539) yapılan bir enjeksiyon çukur hazırlayın. </li><li> 100 x E3 stok solüsyonu seyreltilmesi ile 2 litre E3 ortamı hazırlayın. </li><li> Enjeksiyondan önce akşam, erkek (ler) fotoaktivasyon için hedef hücrelerinin lokalize için kullanılan bir görünür floresan dönüm noktası (GFP, RFP vb.) Ifade istenilen transgenik çizgi kadın (lar) dan ayıran çiftleşme kafesleri hazırlamak. </li><li> Mikropipet çektirmesi (Sutter Enstrüman, Novato, CA, P-97) kullanarak kılcal enjeksiyon iğneleri (filamanlı İnce Duvar Cam kılcal, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, kedi hayır. TW100F-6) hazırlayın. </li><li> Floresein kafesli buz üzerinde% 5 bir kısım çözülme. </li><li> 0,2 M KCl% 5 kafesli floresein stok çözelti% 1'lik bir nihai konsantrasyonu azaltır ve buz üzerinde tutmak. Işığa maruz kaçının. </li><li> Kurulum çiftleşme 4. adımda hazırlanan geçer. </li><li> Döllenmiş yumurtalar kısa sürede belirtilen olarak toplayın. Orient agaroz enjeksiyon kalıp tek hücreli dönem embriyoların E3 1 ile kaplanmış. </li><li> Microloader ucu (Eppendorf, Hamburg, Almanya, kedi.. 5242 956,003) dolgu ~ 1% 1 kafesli floresein çözüm mcL bir enjeksiyon iğnesinin kullanılması. </li><li> Gazla çalışan bir mikroenjektör (pnömatik picopump, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, PV820) bağlı bir mikromanipülatör içine yerleştirin iğne yüklenir </li><li> 2-3nl enjeksiyon hacmi ayarlayın ve kafesli floresein doğrudan hücre sitoplazma içine enjekte edilir. Deneme başına 50 embriyoların en az enjekte edilir. </li><li> 28.5 karanlıkta embriyolar inkübe ° C istenen gelişimsel aşamada E3. Eğer 24 saat sonra döllenme daha büyük embriyolar analiz edilir, pigmentasyon inhibe etmek için% 0.1 (PTU, Sigma, St Louis, MO, kedi hayır. 22.290-9) phenylthiourea ekleyin. </li></ol> 2. Embriyo Montaj <ol><li> (4 ° C'de bir hafta saklanabilir çözümler parçası) taze E2 çözüm hazırlayın. </li><li> E2 ortamda çözünmüş 1% agaroz ince bir tabaka ile kaplayın 60 mm Petri kapları. </li><li> % 2 düşük erime noktası agaroz (Ultra Saf LMP agaroz, Invitrogen, Carlsbad, CA, kedi hayır 16.520.100) gömme hazırlayın: agaroz steril çift distile su kaynayana kadar mikrodalga ısıtma çözülür. Isıtma sırasında tüp kılıfı açık tutun. Kısım mikrosantrifüj tüpler içine 1 ml ve 72 ısıtma bloğu ° C </li><li> Embriyoların chorions hafifçe keskin forseps (5) sayılı dışında koryon çekerek çıkarın. (Bkz: adım 2) agar-kaplı çanak E2 çözüm embriyoların tutun. Polipropilen pipetler yapışabilir Dechorionated embriyolar yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti ile ele alınmalıdır. Bu embriyolar sıvı yüzey gerilimi tarafından hasar görmüş olabilir gibi hava dechorionized embriyo açığa kaçının. </li><li> E2 küçük hacimli bir yangın parlatılmış cam Pasteur pipeti kullanarak seçili embriyo toplayın, ve 60 mm Petri kabında embriyo. Mount embriyo yanında bir damla% 2'lik agaroz (~ 150 mcL) (3. aşama). Hızla iki damla karıştırın ve homojen bir final ~% 1 agaroz karışımı elde etmek için embriyonun dorsal yüzü objektif lens bakan bir diseksiyon mikroskobu şark kullanarak. </li><li> Agaroz katılaşmış kadar bekleyin ve gömülü embriyo sıvı batık kadar E2 orta ekleyin. Bu fotoaktivasyon işleminden sonra agaroz serbest olarak çanak başına tek embriyo elde etmek için tercih edilir. </li></ol> 3. Fotoaktivasyon <ol><li> Biz bir Zeiss LSM 510 META NLO iki foton, ayarlanabilir bir geniş bant (700-1020nm) Spectraphysics den Mai Tai-HP-femtosecond lazer ile donatılmış mikroskop kullanın. </li><li> Üzerine monte edilmiş bir embriyo mikroskop altında bir plaka sahibi yerleştirin. Embriyo floresan dönüm noktası 40x/0.8W Achroplan su kullanarak hedefi dalmış görüntülenmiştir. 500-550nm bant geçiren filtre (BP) ile non-descanned dedektörü (NDD) aşağıdaki adımları izleyin. </li><li> Fotoaktivasyon süreci için bir ön koşul olarak, en ventral görüntü serisi 860nm iki foton lazer dalga boyu (GFP algılama) ile tespit floresan sinyal dorsal parçası satın alarak ilgi bölgenin mekansal floresan bilgi edinin. Bu amaçla, yeterli çözünürlük elde edilen her bir odak düzlemi arasındaki 6μm bir yayılma kullanılarak elde edilebilir. </li><li> Hedef seçinfotoaktivasyon için z-düzlemi ve bu bölgede odak noktası haline getirmek. Deneyin amacı bağlı olarak, faiz bölge GFP görünür dönüm içinde veya dışında da olabilir. Bu z-düzleminde tek bir görüntü çekin. Görüntü kaydetme ve ayrı bir pencerede açık tutmak. </li><li> 720nm iki foton lazer dalga boyu ayarlama ve lazer 'Düzenle çamaşır suyu' menüsünden açmak mod-kilitli olduğu zaman. 'Tanımlama Bölgesi' menüsünü kullanarak 860nm (Adım 4) alınan görüntü göre fotoaktivasyon ilgi bölgesi (ROI) tanımlayın. Bu, ikinci eylem, x, y konumları gözlenen alan değişiklikleri gibi lazer dalga boyu 720nm değişen sonra bu resmin üzerine ROI seçmek için çok önemlidir. </li><li> (Bkz: adım 9) 'Düzenle çamaşır suyu' menüsünden fotoaktivasyon için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: a) göreceli lazer güç; b) iterasyon sayısını, c) tarama hızı. </li><li> Basın 'Düzenle çamaşır suyu' penceresi 'Bleach' ve lazer durana kadar bekleyin. </li><li> 860nm için geri dönün, çıkan photoactivated malzeme ve görüntü elde aktive etki Z-a (kalınlık) değerlendirmek için ikinci bir dizi yoğunluğunu değerlendirmek için bir tek düzlem görüntü kazanır. </li><li> Fotoaktivasyon için aşağıdaki parametreler göz önünde bulundurun: <ol class="lalpha"><li> Lazer yoğunluğu ve fotoaktivasyon süresi: Bir ampirik olarak değişen iki parametre tarafından fotoaktivasyon için en uygun koşulların belirlenmesi gerekir. Acousto-Optik Modülatör (AOM) iletim göreceli lazer güç tarafından kontrol edilebilir. Fotoaktivasyon süresi tekrarlamalar ve tarama hızı sayısının bir fonksiyonudur. </li><li> Uncaged floresan doygunluk önlemek için floresan doğrusal aralığı belirleyin. </li><li> Uncaged moleküllerin elde edilen floresan ve photoactivated klon 2 z ekseni bir sürede arasında doğrusal bir korelasyon vardır. </li></ol></li></ol> 4. Uncaged Floresein Tespiti <ol><li> Fotoaktivasyon sonra karanlıkta embriyolar yükseltmek, 28.5 ° C E2 orta deri pigmentasyonu görünümünü önlemek için% 0.1 PTU içeren. </li><li> Diseksiyon mikroskop altında agaroz istenilen gelişimsel aşamada, embriyo çıkarın. Sivri uçlu bir bistüri kullanarak, "V" embriyonun kafası dönük böylece embriyo yakın agaroz "V" şeklinde kesi oluşturmak. "V" embriyo başkanı yakın noktada kapalı bir pens yerleştirin ve hafifçe embriyo uzunluğu boyunca agaroz ayıran ve ortama embriyo serbest forseps açık itin. </li><li> Bir yangın cilalı Pasteur pipeti ile embriyoların toplayın ve paraformaldehid (PFA;% 4 1 x PBS, pH 7.2) ile düzeltmek oda sıcaklığında 3 saat veya gece boyunca 4 ° C </li><li> Fiksatif çözüm çıkartın ve oda sıcaklığında en az 5 dakika PBST 2-3 kez yıkayın. </li><li> Taze metanol ve -20 ° C'de inkübe ile doldurmak, en az 2 saat, 10 dakika süreyle% 100 metanol ile embriyolar yıkayın. </li><li> % 80,% 60,% 40 ve% 20: PBSTr seyreltilmiş metanol bir dizi ardışık inkubasyon (5 dk) embriyolar rehidrate. PBSTr 2 x 10 dakika yıkayın. </li><li> 500 mcL Engelleme çözüm oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li><li> Çözüm Engelleme 1:500 sulandırılmış bir anti-Floresein alkalen fosfataz (AP) Fab parçaları (Roche, Palo Alto, CA, kedi.. 11426338910) ekleyin ve 4 gece boyunca inkübe ° C (kendi tarafta yer mikrosantrifüj tüpleri) . </li><li> PBST 5 x 15 dakika yıkayın. </li><li> TNT, 0,2 M NaCl 5 dakika yıkayınız. </li><li> TNT 0.4M NaCl içinde 5 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Prestain çözüm taze hazırlanmış 3 x 5 dakika dengelenmesi. </li><li> Hızlı Kırmızı tablet (Roche, Palo Alto, CA, kedi no 11496549001), 2 mL Prestain çözelti içinde eritin. Un çözünmüş parçacıklar atlamak için Whatman No 2 kağıt kullanarak çözüm filtre tavsiye edilir. Alternatif olarak, çözüm aşağı spin ve net süpernatant sıvı kullanın. </li><li> 500 mcL Hızlı Kırmızı oda sıcaklığında karanlıkta inkübe her tüp çözüm, ve monitör renk gelişimi istenilen sinyal-zemin oranı (birkaç saat 20 dakika) ulaşana kadar ekleyin. Eğer arka plan geliştirir, 4 transfer ° C. Inkübasyon bir saat sonra, yeni bir Hızlı Kırmızı boyama solüsyonu ile doldurun. </li><li> 3 x 5 dakika boyama tepki Dur PBST yıkar. </li><li> 20 dakika oda sıcaklığında% 4 PFA saptamak için. </li><li> PBST 2 x 5 dakika yıkayınız. </li><li> Embriyolar kadar% 25,% 50 ve PBS içinde% 75 gliserol ile net embriyoların tüpün alt kısmında yerleşmiş. Embriyolar birkaç gün süreyle 4 ° C'de muhafaza edilebilir. </li></ol> 5. Uncaged Alanı Floresan Görselleştirme <ol><li> Montaj için bir mikroskop lamı hazırlayın: 1 ml şırınga kullanarak birbirinden ~ 15mm bir mesafe yerleştirilen dört slaytta açık silikon gres lekeleri, uygulamak. Cente Mount embriyor ~% 75 gliserol ve yeri bir lamel (no. 0; 18x18mm) 200 mcL üst ve silikon karşı gliserol çözüm slaytlar arasındaki yüzey kaplar kadar yavaşça itin. </li><li> Sahneye monte embriyo yerleştirin ve 40x objektif kullanarak odak noktası haline getirmek. 488nm Argon ve uyarma kaynağı olarak 543nm HeNe lazerler kullanarak görüntüleri konfokal Z-serisi edinin. </li><li> Photoactivatated etki z ekseni a Uncaged embriyo bir görüntü analiz yazılımı kullanarak 3 boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak analiz edilebilir. </li></ol> 6. Çözümler <table border="1"><tbody><tr><td> 100 x E3 </td><td> 174mm 21mm KCl, NaCl, 12mm MgSO 4, 18mm Ca (NO3), 15mm Hepes, pH = 7.4 . Filtrasyon ve mağaza tarafından sterilize, 4 ° C </td></tr><tr><td> 20 x E2 </td><td> 0,3 M NaCl, 10mM KCl, oda sıcaklığında 20mm CaCl 2 * 2HOH, 20mm MgSO 4 * 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0.8mm Na 2 HPO 4 * 2HOH, süzüntü ve mağaza </td></tr><tr><td> 1 x E2 </td><td> 20 x E2 sulandırınız çift distile su ve taze NaHCO 3 (0.7mm final konsantrasyon), Penisilin ve Streptomisin (penisilin ve ml başına 100 mg streptomisin (Invitrogen 100U içeren 1 x nihai konsantrasyonu seyreltik kalem strep çözüm yapılmış eklemek Carlsbad, CA, kedi yok. 15.140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> % 0.1 PBS içinde TWEEN-20 </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> PBS içinde% 0.3 Triton </td></tr><tr><td> Engelleme çözüm </td><td> % 10 BSA,% 0.3 Triton, PBS içinde% 1 DMSO </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150mm NaCl,% 0.5, çift distile su TWEEN-20 </td></tr><tr><td> Prestain çözüm </td><td> 100 mM Tris-HCl pH 8.2, 0.4M NaCl,% 0.1, çift distile su TWEEN-20 </td></tr></tbody></table> 7. Temsilcisi Sonuçlar Yaşayan bir zebrafish embriyo ajanlar photoactivate iki foton mikroskopi bir örnek sunulmaktadır. Daha önce de benzer bir yaklaşım kullanarak zebrafish beyin 2,3 photoactivated etiketli sinir atalarıdır soy izlenmektedir. : GFP muhabiri transgen, canlı içsel bir dönüm noktası olarak görev yaptı: Şekil 1 neurog1 taşıyan zebrafish embriyoların anterior sinir plaka kafesli floresein konjuge tracer boya fotoaktivasyon gösterir. Embriyolar, bir hücre aşamada kafesli floresein enjekte ve tomurcuk aşamasında agaroz gömülü. 3 - 5 hücre gruplarının sahne uzamsal koordinatlarını neurog1 ölçüldü: GFP transgenik embriyo uncaging (Şekil 1A, A ') için ilgi bölgesi (ROI) belirlemek için. Biz nöral plaka belirli bir etki alanı (Şekil 1B, B ') floresein soy tracer Uncaged. Daha sonra, bu nöral progenitör etiketli subdomain kaderi Uncaged floresein (Şekil 1C, C ') immün prim5 (24 saat sonra döllenme) aşamasında tespit edildi. Iki foton lazer uncaging ölçüde, yani Uncaged floresan ve photoactivated etki alanı (z a) kalınlığı yoğunluğu iki parametre ayarlayarak kontrol edilebilir: lazer yoğunluğu ve süresi. Ikinci iterasyon sayısı ve tarama hızının ayarlanması ile kontrol edilebilir (Russek-Blum, 2009, bölüm 3, adım 9 bakınız). Şekil 1'de gösterilen örnekte, biz% 12 AOM iletim 25.6 μsec / piksel göreceli lazer gücü, 20 tekrarlamalar ve tarama hızı kullanılır. Bu ayarları kullanarak 9-10 hücreleri ve 30μm photoactivated z-a (~ 1-2 hücre satır) içeren bir yatırım getirisi olarak nitelendirdi. <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1, iki-foton mikroskopi kullanılarak canlı zebrafish embriyo kafesli floresein fotoaktivasyon Temsilcisi sonucu . Şematik gösterimi (AC) ve fotoaktivasyon süreci temsilcisi görüntüleri (A'C '). 1 hücre aşamada kafesli floresein tracer boya enjekte edildi: (GFP: neurog1) Zebra balığı embriyo (A, A ') neurogenin-1 organizatörü kontrolü altında ifade GFP yaşayın. 3-5 - hücre gruplarının sahne, ön beyin primordium (diensefalon) ayrı bir alan photoactivated ve Uncaged floresein tracer boya (B, B ') tespit edilebilir. Fotoaktivasyon prosedürü takiben, embriyo ° C ve Uncaged floresein içeren beyin hücrelerinin 24 saat sonra döllenme (C, C 'hpf) anti-Floresein immün tarafından takip 28.5 inkübe edildi. Dien, Diencephalon; Telefon, Telencephalon.

<ol><li>Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. (1995).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Russek-Blum, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neuronal+cluster+size+is+determined+during+early+forebrain+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning.</a> Development. 135, 3401-3413 (2008).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Staudt, N., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prethalamus+Is+Established+during+Gastrulation+and+Influences+Diencephalic+Regionalization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization.</a> PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Bulina, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore-assisted+light+inactivation+%28CALI%29+using+the+phototoxic+fluorescent+protein+KillerRed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed.</a> Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).</li>
<li>Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+chemistry+with+caged+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Controlling cell chemistry with caged compounds.</a> Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).</li>
<li>Wieboldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+precursors+of+glutamate%3A+synthesis%2C+photochemical+properties%2C+and+activation+of+glutamate+receptors+on+a+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).</li>
<li>Marque, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+caged+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Using caged neurotransmitters.</a> Nature. 337, 583-584 (1989).</li>
<li>Zucker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorelease+techniques+for+raising+or+lowering+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2.</a> Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).</li>
<li>Neveu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caged+retinoic+acid+for+one-+and+two-photon+excitation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).</li>
<li>Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-controlled+gene+silencing+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos.</a> Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).</li>
<li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA%2FDNA+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nat Genet. 28, 317-325 (2001).</li>
</ol>

Foto-aktive bileşikler fonksiyonu moleküllerin biyolojik ya da kimyasal olarak aktif bir devlet haline dönüştüren bir fotokimyasal reaksiyon inducing (genellikle UV), belirli bir dalga boyu ile aydınlatılmış kadar maskeli moleküllerdir. Aktivasyon ışığa maruz kaldıkları sınırlayarak tam zamansal ve mekansal olarak kontrol edilebilir beri bu probları, hücre biyolojisi araştırmalarında çok güçlü araçlar sunuyoruz. Çok foton mikroskopi önemli bir avantaj, nispeten derin bir optik penetrasyon ve...

<table><tbody><tr><td>Dekstran-konjuge 4,5-dimetoksi-2-nitrobenzi (DMNB) kafesli fluorescein (10.000 MW dekstran, anyonik)</td><td>Invitrogen</td><td>D-3310</td><td>moleküler problar</td></tr><tr><td>Enjeksiyon kanalı ve kaplamalı plakalar için agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Filamanlı ince duvarlı cam kılcal borular</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çekici</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikroyükleyici uç</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Pnömatik pikopump</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Feniltiyüre (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22290-9</td><td></td></tr><tr><td>Embriyo montajı için düşük erime noktalı agaroz</td><td>Ultra Pure LMP agarose</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-alkalin fosfataz (AP) Fab fragmanları</td><td>Roche Group</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red</td><td>Roche Group</td><td>11496549001</td><td></td></tr></tbody></table>

canlı zebra balığı embriyolar iki-foton-tabanlı fotoaktivasyon

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Yaşayan bir organizma hedef bileşiklerin fotoaktivasyon gibi, embriyonik gelişim, hücresel sinyal ve yetişkin fizyoloji gibi çeşitli biyolojik süreçleri araştırmak için değerli bir yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır. Bu bağlamda, multi-foton mikroskopi kullanımı, tek bir hücrenin çözünürlükte derin dokularda belirli bir ışık duyarlı ajan kantitatif fotoaktivasyon sağlar. Zebra balığı embriyolar optik şeffaf olduğu için, onların gelişimi in vivo olarak izlenebilir. Bu özellikler zebrafish odaklı ışığı ile kimyasal ajanlar ve proteinlerin çeşitli aktivite kontrol etmek için mükemmel bir model organizma. Burada biz, bizi, canlı zebrafish embriyolarının hücrenin kaderini takip kimyasal kafesli floresein aktivasyonu ikna etmek için iki-foton mikroskopi kullanımını tanımlamak. Biz, herhangi bir ilgi hücreleri bulmak ve hassas hedef canlı genetik bir dönüm noktası (GFP) ifade embriyolar kullanın. Bu prosedür, aynı şekilde, proteinleri, hormonlar, küçük moleküller ve diğer kafesli bileşikler hassas ışık kaynaklı aktivasyonu için kullanılabilir.

Multiphoton mikroskobu optik derin penetrasyon ve azaltılmış fototoksisite düşük enerjili fotonların kontrol sağlar. Biz zebrafish embriyolar canlı hücre etiketlenmesi için bu teknolojinin kullanımını anlatmayacağız. Bu protokol fotoğraf indüksiyonu için çeşitli ışık duyarlı moleküllerin kolayca adapte edilebilir.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Canlı bir organizmadaki hedef bileşiklerin fotoaktivasyonu, embriyonik süreçler gibi çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için değerli bir yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, canlı bir zebra balığı embriyosunda, kimyasal olarak kafeslenmiş floresan boya gibi belirli bir ışığa duyarlı ajanı tek hücre çözünürlüğünde fotoaktive etmektir. Bu işlem, ilgilenilen hücreleri konumlandırmak ve hassas bir şekilde hedeflemek için canlı bir genetik işaretleyici ifade eden tek hücre evresindeki embriyolara ışığa duyarlı bir ajan enjekte edilerek gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak embriyolar büyütülür ve canlı embriyoyu hareketsiz kılan, düşük erime noktalı bir agar içerisine yerleştirilir.Ardından, görünür floresan transgenik bir işaretçiyi lokalize etmek için iki foton mikroskobisi kullanılır. Daha sonra, ışığa duyarlı ajan istenen bir odak düzleminde aktive edilir ve fotoaktivasyonun boyutu izlenir. Sonuç olarak etiketlenen hücrelerin akıbeti, daha sonraki embriyonik evrelerde takip edilebilir.Bu prosedür, canlı örneklerde tek hücre çözünürlüğünde çeşitli bileşiklerin aktivasyonu için kullanılabilir. Bu tekniğin konfokal mikroskopi veya flaş lamba gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nispeten düşük fototoksisite ile aksiyel düzeyde birkaç mikronluk derinlikteki dokuların fotoaktivasyonuna olanak tanımasıdır. Burada sunula

two-photon-based-photoactivation-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Burada, canlı zebra balığı embriyosunda fotokonverte edilebilir floresan proteinlerin (PCFPs) fotoaktive anahtarlaması ve fotokonverte edilmiş proteinin gelişim sırasındaki belirli zaman noktalarında takibi için bir yöntem sunmaktayız. Bu metodoloji, canlı bir omurgalı organizmadaki farklı gelişimsel süreçlerin temelini oluşturan hücre biyolojik olaylarının izlenmesine olanak tanır.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Mitoz her canlı organizma için kritiktir ve kusurlar genellikle kansere ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Araştırmacılar, bu görüntüleme protokolünü ve zebra balığını bir model sistem olarak kullanarak, canlı bir omurgalı organizmasında mitozu ve mitotik süreçler kusurlu olduğunda ortaya çıkan çok sayıda kusuru görselleştirebilirler.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Burada, nasıl hücre photoconversion floresan protein, Eos, yaşayan hayvanlarda ifade belirli alanlara UV Işınlarına maruz kalma yoluyla elde edilir göstermek için bir iletişim kuralı mevcut.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Bu iletişim kuralı Kaede yaşayan endocardial hücreleri floresan proteinin photoconversion için bir yöntemi açıklar endocardial hücreleri izleme Atriyoventriküler kanal ve Atriyoventriküler kalp kapak geliştirme sırasında sağlar Zebra balığı embriyo .

Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Sinyal yollarının optogenetik manipülasyonu, gelişim, rejenerasyon, homeostaz ve hastalıkta sinyalleşmenin nasıl çözüldüğünü araştırmak için güçlü bir strateji olabilir. Bu protokol, erken zebra balığı embriyosunda ışık-oksijen-voltaj algılama alanı tabanlı Nodal ve kemik morfojenik protein (BMP) sinyal aktivatörlerinin kullanılması için pratik yönergeler sağlar.

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak GCaMP kalsiyum göstergelerini eksprese eden transgenik zebra balıklarının beyin bölgelerindeki nöral aktiviteyi incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

In vivo (İn canlı) Kısmen Kısıtlanmış Larva Zebra Balıklarında Duyusal Stimülasyonla İndüklenen Nöral Aktivitenin Konfokal Floresan Görüntülemesi

Öğrenin, canlı zebra balığı embriyolarında iki foton mikroskobisi ile tek hücre çözünürlüğünde fotoaktivasyon yapmayı. Bu yöntem, gelişim biyolojisi ve hücre kaderi izleme çalışmaları için uygundur.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Daha fazla video keşfet